CN103930787A - 检测过敏原的***和方法 - Google Patents
检测过敏原的***和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103930787A CN103930787A CN201280053386.1A CN201280053386A CN103930787A CN 103930787 A CN103930787 A CN 103930787A CN 201280053386 A CN201280053386 A CN 201280053386A CN 103930787 A CN103930787 A CN 103930787A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- value
- approximately
- peptide
- anaphylactogen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4713—Plasma globulins, lactoglobulin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4731—Casein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/76—Assays involving albumins other than in routine use for blocking surfaces or for anchoring haptens during immunisation
- G01N2333/77—Ovalbumin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本文提供使用质谱检测过敏原的方法和***。在一些方面中,可通过使用所选多反应监测MRM转换检测所关注过敏原所特有的一种或一种以上肽来筛选试样中以下过敏原的存在或量:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同种型S1和S2)、乳球蛋白、高和低谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种类型的坚果,包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子。
Description
技术领域
本发明一股来说涉及使用质谱对试样(例如食物试样)中的过敏原进行检测和定量的试剂盒和方法。
背景技术
食物过敏可诱发有害免疫反应,例如,如皮炎、哮喘、胃肠损伤、过敏性休克等。用于对食物试样中的过敏原进行检测和/或定量的常规方法一股采用免疫分析,其可具有许多缺点。例如,一种称作酶联免疫吸附分析(ELISA)的此类方法需要使用昂贵的试剂盒并且最多进行半定量。另外,常规免疫分析在每次筛选中一股限于单一过敏原并且因缺乏特异性而频繁地造成假阳性。
因此,所属领域内需要对食物试样中的过敏原进行检测和定量的改进的试剂盒和方法。
发明内容
根据各实施例,本文提供使用质谱对试样中的过敏原进行检测和/或定量的方法和试剂盒。如下文所述,这些方法和试剂盒可使得能够通过利用所关注过敏原所特有的一种或一种以上氨基酸序列来对试样中的至少一种过敏原(例如,卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低分子量麦谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果,包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)进行检测和/或定量。例如,可使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)来检测过敏原特有的胰蛋白酶肽。在许多实施例中,可观察每一肽中的所选多反应监测(MRM)转换以使得能够对例如食物试样中的过敏原进行可靠定量。
根据各实施例,揭示各种过敏原所特有的一组肽。例如,可使用所述过敏原所特有的经分离肽来对过敏原卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同种型S1和S2)、乳球蛋白、含有高和低分子量麦谷蛋白的谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果中的每一者进行检测和/或定量。在一些情况下,这些过敏原术语为广泛定义,其涵盖来自不同蛋白质的各种类型的肽且在一些情况下涵盖不同属和/或种的过敏原。例如,术语芥子涵盖从芸苔属(Brassica)和芥属(Sinapis)两者中的种获得的过敏原,这两个属均应理解为芥子的形式。举例来说,在鸡卵中发现的过敏原卵白蛋白所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-7中的一者或一者以上。也在鸡卵中发现的过敏原溶菌酶所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:8-11中的一者或一者以上。牛乳蛋白质酪蛋白S1所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.12-18中的一者或一者以上。牛乳蛋白质酪蛋白另一同种型酪蛋白S2所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.24-29中的一者或一者以上。大麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.30-33中的一者或一者以上。低分子量麦谷蛋白所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.34-59中的一者或一者以上。高分子量麦谷蛋白所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.60-79中的一者或一者以上。归类为芥子的各物种的蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.80-112中的一者或一者以上。燕麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.113-116中的一者或一者以上。黑麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.117-123中的一者或一者以上。芝麻蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.124-132中的一者或一者以上。小麦蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.133-138中的一者或一者以上。巴西坚果蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.139-155中的一者或一者以上。榛子蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.IDNO.156-172中的一者或一者以上。澳大利亚坚果蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.173-181中的一者或一者以上。花生蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.182-187中的一者或一者以上。阿月浑子坚果蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO.188-203中的一者或一者以上并且最后核桃蛋白质所特有的经分离肽可具有氨基酸序列SEQ.ID NO204-212中的一者或一者以上。
上述肽中的每一者可使用与每一过敏原特有肽相关的特定MRM转换来检测和/或定量。根据各实施例,每一肽的优化MRM转换在下文论述于表1-19中。
在一个方面中,提供筛选试样中的过敏原的方法。所述方法包括获得试样和用至少一种蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)消化所述试样以将所述试样中存在的至少一种过敏原(如果有)片段化成多种肽。所述过敏原可为以下蛋白质中的至少一者:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白和从小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种类型的坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)获得的蛋白质。所述方法另外包括通过使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定至少一种肽的量来对至少一种过敏原进行定量。多种肽中的至少一者具有如序列表中所显示的氨基酸序列SEQ ID NO:1-212,所述序列的全部内容以引用方式并入本文中。
在一些实施例中,上述过敏原中的两者或两者以上是通过经由LC-MS/MS检测多种肽(例如上文所论述的那些)来检测和/或定量,其中对于每一肽片段来说,监测多个MRM转换,例如上文所论述的那些。已发现过敏原(例如,卵蛋白质(例如卵白蛋白)、溶菌酶或牛乳蛋白质(例如酪蛋白和乳球蛋白)、高和低麦谷蛋白、从小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果获得的蛋白质)的精确鉴别和/或定量可通过使用LC-MS/MS对过敏原的一组特有肽(例如本文所揭示的那些)的至少一种且优选若干种(例如,全部)和每一肽的特定MRM转换(例如本文所揭示的那些)进行监测和定量来完成。
在一个实施例中,可监测多种肽中的每一者的至少一个所选MRM转换。例如,可监测所述肽中的每一者的两个、三个或任一其它数量的MRM转换。在一个实施例中,可例如使用相同轮次的串联质谱仪来对两种或两种以上过敏原进行检测和/或定量。在另一实施例中,测定两种或两种以上肽的的量以对所关注过敏原进行定量。
在一些实施例中,所述方法可包含在消化所述试样之前添加已知量的以下蛋白质中的至少一者:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻、澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子的蛋白质。例如,可在消化试样之前将已知量的卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白和乳球蛋白中的每一者添加到所述试样。
本文还揭示检测试样中的卵白蛋白的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分卵白蛋白(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-7的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对卵白蛋白的所选肽进行检测和/或定量。例如,可监测一个所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:1-7的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表1中。可通过LC-MS/MS来监测卵白蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的溶菌酶的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分溶菌酶(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:8-11的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对溶菌酶的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:8-11的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表2中。可通过LC-MS/MS来监测溶菌酶的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的酪蛋白(例如,酪蛋白同种型S1或S2)的方法。在一个实施例中,所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分酪蛋白同种型S1(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:12-18的肽。在另一实施例中,所述方法可包括将蛋白水解酶添加到试样以将试样中存在的至少一部分酪蛋白同种型S2(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:19-23的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对酪蛋白的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:12-23的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表3或4中。可通过LC-MS/MS来监测酪蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的乳球蛋白的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分乳球蛋白(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:24-29的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对乳球蛋白的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:24-29的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表5中。可通过LC-MS/MS来监测乳球蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的大麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分大麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:30-33的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对大麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:30-33的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表6中。可通过LC-MS/MS来监测大麦的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的高和低分子量麦谷蛋白的方法。在一个实施例中,所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分高或低分子量麦谷蛋白(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ IDNO:34-79的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对低或高分子量麦谷蛋白的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:34-79的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表7和8中。可通过LC-MS/MS来监测高或低分子量谷蛋白的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测高或低分子量麦谷蛋白的一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的芥子的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分芥子蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:80-112的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对芥子蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:80-112的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表9中。可通过LC-MS/MS来监测芥子的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的燕麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分燕麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:113-116的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对燕麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:113-116的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表10中。可通过LC-MS/MS来监测燕麦的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的黑麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分黑麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:117-123的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对黑麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:117-123的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表11中。可通过LC-MS/MS来监测黑麦的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的芝麻的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分芝麻蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:124-132的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对芝麻蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:124-132的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表12中。可通过LC-MS/MS来监测芝麻的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的小麦的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分小麦蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:133-138的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对小麦蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:133-138的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表13中。可通过LC-MS/MS来监测小麦的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的巴西坚果的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分巴西坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:139-155的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对巴西坚果蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:139-155的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表14中。可通过LC-MS/MS来监测巴西坚果的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的榛子的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分榛子蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:156-172的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对榛子蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:156-172的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表15中。可通过LC-MS/MS来监测榛子的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的澳大利亚坚果的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分澳大利亚坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:173-181的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对澳大利亚坚果蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:173-181的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表16中。可通过LC-MS/MS来监测澳大利亚坚果的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的花生的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分花生蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:182-187的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对花生蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:182-187的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表17中。可通过LC-MS/MS来监测花生的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的阿月浑子坚果的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分阿月浑子坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:188-203的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对阿月浑子坚果蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:188-203的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表18中。可通过LC-MS/MS来监测阿月浑子坚果的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
本文还揭示检测试样中的核桃的方法。所述方法可包括将蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)添加到试样以将试样中存在的至少一部分巴西坚果蛋白质(如果有)裂解成多种肽,所述肽具有至少一种具有氨基酸序列SEQ ID NO:203-212的肽。然后利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
在一个方面中,可监测所选MRM转换以对核桃蛋白质的所选肽进行检测或定量。例如,可监测所选前体-产物离子对转换。对应于SEQ ID NO:203-212的每一肽的优化MRM转换在下文提供于表19中。可通过LC-MS/MS来监测核桃的肽的任一数量的优化转换。例如,可监测一个、两个、三个或任选地所有优化MRM转换。
在一些实施例中,上述方法可利用氨基酸序列与所选肽相同的至少一种同位素富集肽来校准所述肽的定量。在一些实施例中,可利用具有已知浓度的所选肽的标准物来校准所选肽的定量。在一些实施例中,可在添加蛋白水解酶之前将已知量的所关注过敏原(例如,卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白或来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质)添加到试样以校准所选所关注的肽和/或蛋白质的定量。在一些实施例中,可在添加蛋白水解酶之前将已知量的以下蛋白质中的每一者添加到试样:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。
试样可来自多种来源。在一个实施例中,例如,试样可为食物试样。
在另一实施例中,所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:i)SEQ ID NO:113,m/z值为约989/998、989/1085或989/1234;ii)SEQ ID NO:114,m/z值为约777/984、777/1112或777/1226;iii)SEQ ID NO:115,m/z值为约627/642或627/1013;iv)SEQ ID NO:116,m/z值为约419/642。
在又一实施例中,所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:i)SEQ ID NO:124,m/z值为约465/472、465/728或465/815;ii)SEQ ID NO:125,m/z值为约397/679、397/417或397/580;iii)SEQ ID NO:126,m/z值为约717/743、717/957或717/372;iv)SEQ ID NO:127,m/z值为约380/589、380/476或380/377;v)SEQ ID NO:128,m/z值为约419/522、419/637或419/409;vi)SEQ ID NO:129,m/z值为约582/795、582/866或582/980;vii)SEQ IDNO:130,m/z值为约806/869、806/1070或806/957;viii)SEQ ID NO:132,m/z值为约685/901、685/1089或685/1238。
在又一实施例中,所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:i)SEQ ID NO:156,m/z值为约582/666、582/852或582/999;ii)SEQ ID NO:157,m/z值为约514/729、514/800或514/914;iii)SEQ ID NO:158,m/z值为约882/1033、882/580或882/806;iv)SEQ ID NO:159,m/z值为约567/449、567/684或567/799;v)SEQ ID NO:160,m/z值为约539/763、539/948或539/635;vi)SEQ ID NO:161,m/z值为约374/619、374/490或374/304;vii)SEQ IDNO:162,m/z值为约576/689、576/852或576/588;viii)SEQ ID NO:163,m/z值为约721/900、721/1014或721/484;ix)SEQ ID NO:164,m/z值为约502/703、502/816或502/575;x)SEQ ID NO:165,m/z值为约807/874、807/988或807/1089;xi)SEQ ID NO:166,m/z值为约700/984、700/464或700/365;xii)SEQ ID NO:167,m/z值为约679/841、679/600或679/713;xiii)SEQ ID NO:168,m/z值为约815/906、815/835或815/724;xiv)SEQ ID NO:169,m/z值为约424/589、424/718或424/488;xv)SEQ ID NO:170,m/z值为约601/973、601/616或601/731;xvi)SEQ ID NO:171,m/z值为约791/935或791/1212;和xvii)SEQ ID NO:172,m/z值为约528/614。
在又一实施例中,所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:i)SEQ ID NO:173,m/z值为约729/921或729/1050;ii)SEQ ID NO:174,m/z值为约438/626或438/725;iii)SEQ ID NO:175,m/z值为约585/892或585/763;iv)SEQ ID NO:176,m/z值为约545/821或545/952;v)SEQ ID NO:177,m/z值为约537/786或537/935;vi)SEQ ID NO:178,m/z值为约493/743或493/580;vii)SEQ ID NO:179,m/z值为约344/500或344/401;viii)SEQ IDNO:180,m/z值为约392/566或392/437;和ix)SEQ ID NO:181,m/z值为约500/743或500/580。
在又一实施例中,所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:i)SEQ ID NO:188,m/z值为约397/515、397/572或397/416;ii)SEQ ID NO:189,m/z值为约518/556或518/797;iii)SEQ ID NO:190,m/z值为约802/1078、802/802或802/931;iv)SEQ ID NO:191,m/z值为约746/1157、746/941或746/683;v)SEQ ID NO:192,m/z值为约569/821、569/557、569/658;vi)SEQ ID NO:193,m/z值为约713/1012或713/470;vii)SEQ ID NO:194,m/z值为约502/703、502/816或502/575;viii)SEQ ID NO:195,m/z值为约479/680、479/809或479/381;ix)SEQ ID NO:196,m/z值为约702/790、702/904或702/1088;x)SEQ ID NO:197,m/z值为约838/1020、838/835或838/906;xi)SEQ ID NO:198,m/z值为约961/1027、961/899或961/671;xii)SEQ ID NO:199,m/z值为约790/1054、790/492或790/925;xiii)SEQ ID NO:200,m/z值为约777/694、777/807或777/579;xiv)SEQ ID NO:201,m/z值为约279/500或279/274;xv)SEQ ID NO:202,m/z值为约837/1080、837/966、837/753;和xvi)SEQ ID NO:203,m/z值为约598/747、598/848、598/634。
在又一实施例中,所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:i)SEQ ID NO:204,m/z值为约813/1142;ii)SEQ ID NO:205,m/z值为约805/900、805/623或805/345;iii)SEQ ID NO:206,m/z值为约698/820、698/949或698/461;iv)SEQ ID NO:207,m/z值为约683/1136、683/796、683/925、683/1039或683/569;v)SEQ ID NO:208,m/z值为约515/729、515/487或515/616;vi)SEQ ID NO:209,m/z值为约955/692、955/905或955/577;vii)SEQ ID NO:210,m/z值为约502/703、502/816或502/575;viii)SEQ ID NO:211,m/z值为约792/904或792/1017;ix)SEQ ID NO:212,m/z值为约529/1017。
本文还揭示用于质谱测试试样中的过敏原的试剂盒。所述试剂盒可包括至少一种用于将试样中存在的至少一种过敏原(如果有)片段化成多种肽的蛋白水解酶(例如,胰蛋白酶)。过敏原可例如为卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高和低分子量麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质,并且多种肽中的至少一者可为具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-212的肽。试剂盒还可包括至少一种使用质谱仪对所述多种肽中的至少一者的试剂进行定量。
在一个方面中,用于对多种肽中的至少一者进行定量的试剂可为氨基酸序列与多种肽中的一者相同的同位素富集肽。在一个实施例中,同位素富集肽可包括例如C13或N15中的至少一者。在另一方面中,用于对至少一种所述多种肽进行定量的试剂可包括所选浓度的用于校准质谱仪的多种肽中的至少一者。在一些实施例中,用于对至少一种所述多种肽进行定量的试剂可包含用于校准质谱仪的以下蛋白质中的至少一者:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低分子量麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。例如,试剂盒可包括已知量的以下蛋白质中的每一者:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低分子量麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。在其它实施例中,仅包括一些过敏原。
试剂盒可另外包括用于制备将使用质谱仪分析的试样、运行所制备的试样穿过LC柱或执行质谱的各种试剂。作为非限制性实例,试剂盒可包括例如将用作标准物的以下蛋白质中的一者:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白、来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。试剂盒还可包括烷基化剂(例如,甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)、碘乙酰胺)和/或还原剂。
在一个方面中,试剂盒可包括关于使用质谱仪对至少一种过敏原进行定量的说明书。举例来说,试剂盒可包括关于待用作质谱仪中的设置的转换对或所预计片段离子的信息。
根据不同方面,提供可控制过程和/或执行本文所述的计算的软件。例如,所述软件可向质谱仪提供指令以监测一个或一个以上特定前体-产物离子对转换或片段离子。
具体实施方式
所属领域技术人员应理解,本文所述的方法和试剂盒是非限制性实例性实施例并且申请者揭示内容的范围仅由权利要求书界定。尽管结合各实施例对申请者的教示内容进行了说明,但并不打算将申请者的教示内容限定于所述实施例。相反,申请者的教示内容涵盖各种替代、修改和等效形式,如所属领域技术人员所应了解。结合一个实例性实施例说明或描述的特征可与其它实施例的特征组合使用。所述修改和变化形式打算包括在申请者的揭示内容的范围内。
根据各实施例,提供使用质谱通过检测一种或一种以上所关注过敏原所特有的氨基酸序列来筛选试样中以下蛋白质的存在或量的方法:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(同种型S1和S2)、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子的蛋白质)。例如,可使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)来检测过敏原特有肽。可观察每一肽中的所选MRM转换以使得能够对试样中的过敏原进行定量。
所述方法可利用所属领域内已知的多种质谱技术。例如,质谱技术可为串联质谱(MS/MS)技术和/或液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术。在一些实施例中,所述技术包含LC-MS/MS技术和使用三相四极仪器和多反应监测(MRM)。
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测卵白蛋白所特有的至少一种经分离肽(例如,一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:1-7的肽)来对试样中的卵白蛋白进行检测和/或定量。例如,LC-MS/MS可用于测定试样中卵白蛋白特有肽的存在和/或量。在一个实例性实施例中,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换。在一些实施例中,卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:1,并且所述方法可包括监测至少一个具有约391/504、391/667或391/433的m/z值的前体-产物离子对转换,其中如本文所使用的术语“约”意指在+/-一(1)原子质量单位范围内。在其它实施例中,卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:2,并且所述方法可包括监测至少一个具有约762/1036、762/487、762/1150的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQID NO:3,并且所述方法可包括监测至少一个具有约605/419、605/621或605/749的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,卵白蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ IDNO:4,并且所述方法可包括监测至少一个具有约673/1096、673/1024、673/1209、449/526、449/608或449/639的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:5,并且所述方法可包括监测至少一个具有约791/1052、791/951或791/1239的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,卵白蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:6,并且所述方法可包括监测至少一个具有约844/666、844/1332或844/1121的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,卵白蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:7,并且所述方法可包括监测至少一个具有约930/1017、930/1118、930/1303或930/888的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中,所述方法可包括监测与每一卵白蛋白特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的卵白蛋白特有肽可通过监测具有约391/504、391/667或391/433的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中,可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中,对试样中的卵白蛋白进行检测或定量的方法可包括检测多种卵白蛋白特有肽。作为非限制性实例,卵白蛋白可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:1-7的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表1显示根据申请者的教示内容测定为卵白蛋白所特有的肽的序列SEQ ID NO:1-7,以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的卵白蛋白进行可靠定量。卵白蛋白所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中,其全部内容以引用方式并入本文中。
在下表中,片段离子具有对电荷以及常规片段化命名的引用。例如,标记2y4将指示带双电荷并且为y4片段(来自C-末端的4个单元)的片段。同样,标记2b4将指示带双电荷并且为b4片段(来自N-末端的4个单元)的片段。这些命名规则为所属领域技术人员已知。
表1
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测溶菌酶所特有的至少一种经分离肽(例如,一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:8-11的肽)来对试样中的溶菌酶进行检测和/或定量。例如,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中溶菌酶特有肽的存在和/或量。在一些实施例中,溶菌酶特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:8,并且所述方法可包括监测至少一个具有约438/737、438/452或438/680的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,溶菌酶特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:9,并且所述方法可包括监测至少一个具有约497/621、497/847或497/807的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,溶菌酶特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:10,并且所述方法可包括监测至少一个具有约715/804、715/951或715/1065的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,溶菌酶特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:11,并且所述方法可包括监测至少一个具有约878/901、878/1064或878/1178的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中,所述方法可包括监测与每一溶菌酶特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的溶菌酶特有肽可通过监测具有约438/737、438/452或438/680的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中,可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中,对试样中的溶菌酶进行检测或定量的方法可包括检测多种溶菌酶特有肽。作为非限制性实例,溶菌酶可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ IDNO:8-11的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表2显示根据本教示内容测定为溶菌酶所特有的肽的序列SEQ ID NO:8-11,以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的溶菌酶进行可靠定量。溶菌酶所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中,其在此处以引用方式并入其表2中。
表2
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测酪蛋白所特有的至少一种经分离肽(例如,一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12-23的肽)来对试样中的酪蛋白进行检测和/或定量。例如,所述方法可包含通过检测酪蛋白S1所特有的经分离肽(例如,一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12-18的肽)来对试样中的酪蛋白S1同种型进行检测和/或定量。举例来说,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中酪蛋白S1特有肽的存在和/或量。在一些实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12,并且所述方法可包括监测至少一个具有约693/921、693/992或693/1091的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:13,并且所述方法可包括监测至少一个具有约584/763、584/706、584/650或438/600的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:14,并且所述方法可包括监测至少一个具有约416/488、416/587或416/702的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:15,并且所述方法可包括监测至少一个具有约634/992、634/771或634/934的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:16,并且所述方法可包括监测至少一个具有约880/1325、880/1495、880/1438、880/436、587/758、587/871或587/790的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:17,并且所述方法可包括监测至少一个具有约345/590、345/476或345/573的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S1特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:18,并且所述方法可包括监测至少一个具有约416/488、416/587或416/702的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中,所述方法可包括监测与每一酪蛋白S1特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有氨基酸序列SEQ ID NO:12的酪蛋白S1特有肽可通过监测具有约693/921、693/992或693/1091的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中,可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中,对试样中的酪蛋白S1同种型进行检测或定量的方法可包括检测多种酪蛋白S1特有肽。作为非限制性实例,酪蛋白S1可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:12-18的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表3显示根据申请者的教示内容测定为酪蛋白S1同种型所特有的肽的序列SEQID NO:12-18,以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的酪蛋白S1同种型进行可靠定量。酪蛋白S1同种型所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中,其全部内容以引用方式并入本文中。
表3
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测酪蛋白S2所特有的至少一种经分离肽(例如,一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:19-23的肽)来对试样中的酪蛋白S2同种型进行检测和/或定量。举例来说,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中酪蛋白S1特有肽的存在和/或量。在一些实施例中,酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:19,并且所述方法可包括监测至少一个具有约373/534或373/437的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:20,并且所述方法可包括监测至少一个具有约598/912、598/701、598/814、598/436的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ IDNO:21,并且所述方法可包括监测至少一个具有约438/629、438/558或438/445的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S2特有肽可具有氨基酸序列SEQID NO:22,并且所述方法可包括监测至少一个具有约490/648、490/761、490/833的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,酪蛋白S2特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:23,并且所述方法可包括监测至少一个具有约694/1187、694/811或694/940的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中,所述方法可包括监测与每一酪蛋白S2特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有氨基酸序列SEQ ID NO:19的酪蛋白S2特有肽可通过监测两个具有约373/534或373/437的m/z值的前体-产物离子对转换来鉴别。关于具有氨基酸序列SEQ ID NO:20的酪蛋白S2特有肽,可监测任两个、三个或全部具有约598/912、598/701、598/814或598/436的m/z值的经鉴别前体-产物离子对。
在一个实施例中,对试样中的酪蛋白S2同种型进行检测或定量的方法可包括检测多种酪蛋白S2特有肽。作为非限制性实例,酪蛋白S2可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:19-23的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表4显示根据申请者的教示内容测定为酪蛋白S2同种型所特有的肽的序列SEQID NO:19-23,以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的酪蛋白S2同种型进行可靠定量。
表4
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测对乳球蛋白所特有的至少一种经分离肽(例如,一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:24-29的肽)来对试样中的乳球蛋白进行检测和/或定量。例如,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中溶菌酶特有肽的存在和/或量。在一些实施例中,乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:24,并且所述方法可包括监测至少一个具有约533/853、533/754或533/641的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:25,并且所述方法可包括监测至少一个具有约458/803、458/688或458/504的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:26,并且所述方法可包括监测至少一个具有约1158/1453、1158/1581、1158/1255、772/1026、772/977或772/912的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,乳球蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:27,并且所述方法可包括监测至少一个具有约623/573、623/918、623/819、623/1047的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,乳球蛋白特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:28,并且所述方法可包括监测至少一个具有约561/806、561/935或561/692的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,乳球蛋白特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:29,并且所述方法可包括监测至少一个具有约419/653、419/556或419/425的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中,所述方法可包括监测与每一乳球蛋白特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有氨基酸序列SEQ ID NO:24的乳球蛋白特有肽可通过监测具有约533/853、533/754或533/641的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中,可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。
在一个实施例中,对试样中的乳球蛋白进行检测或定量的方法可包括对多种乳球蛋白特有肽进行检测和/或定量。作为非限制性实例,乳球蛋白可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:24-29的肽的任一组合或甚至全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表5显示根据申请者的教示内容测定为乳球蛋白所特有的肽的序列SEQ ID NO:24-29,以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的乳球蛋白进行可靠定量。乳球蛋白所特有的额外MRM转换显示于附录A、B和D中,其全部内容以引用方式并入本文中。
表5
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测至少一种大麦所特有的经分离肽(例如B1-大麦醇溶蛋白或B3-大麦醇溶蛋白)来对试样中的大麦(barley,Hordeum vulgare)进行检测和/或定量,所述试样可具有例如一种或一种以上具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQID NO:30-33的肽。例如,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中大麦特有肽的存在和/或量。在一些实施例中,大麦特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:30,并且所述方法可包括监测至少一个具有约835/948、835/1097或835/1228的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,大麦特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:31,并且所述方法可包括监测至少一个具有约336/515、336/554或336/497的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,大麦特有肽可具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:32,并且所述方法可包括监测至少一个具有约820/1097、820/548或820/713的m/z值的前体-产物离子对转换。在其它实施例中,大麦特有肽可具有氨基酸序列SEQ ID NO:33,并且所述方法可包括监测至少一个具有约499/785、499/575或499/393的m/z值的前体-产物离子对转换。
在一个实例性实施例中,所述方法可包括监测与每一大麦特有肽相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有氨基酸序列SEQ ID NO:30的大麦特有肽可通过监测具有约835/948、835/1097或835/1228的m/z值的任两个前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中,可监测所有三个所鉴别的前体-产物离子对。同样,氨基酸序列SEQ IDNO:31-33可以类似方式使用。
在一个实施例中,对试样中的大麦进行检测或定量的方法可包括检测多种大麦特有肽。作为非限制性实例,大麦可通过使用具有本文所鉴别的氨基酸序列SEQ ID NO:30-33的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表6显示根据本教示内容测定为大麦所特有的肽的序列SEQ ID NO:30-33,以及其最佳MRM Q1,Q3转换。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的大麦蛋白质进行可靠定量。
表6
所属领域技术人员理解,在一些情况下,所述序列中存在的个别氨基酸可通过在试样制备过程中使用常规方法来修饰。在另一实施例中,还打算捕获所述经修饰序列。例如,SEQ ID NO:30含有可在试样制备过程中利用封端剂封端的半胱氨酸部分,所述封端剂例如甲烷硫代磺酸甲酯,其可产生其中半胱氨酸已经封端而免于进一步反应的序列。其它封端剂为所属领域内已知并且可包括碘乙酰胺。因此应认识到,SEQ ID NO:30-33在其范围内包括经修饰的肽序列,其中个别氨基酸已经修饰而包括所述封端剂。所属领域技术人员将认识到,尽管序列将与封端剂的添加大体上类似,但质量将相应地改变。所述修饰也适合本文所揭示的所有过敏原的所有序列。
根据其它实施例,所述方法还可用于对除上文所揭示的过敏原以外的其它过敏原进行鉴别和定量,所述其它过敏原包括低和高分子量麦谷蛋白和来自芥子、燕麦、黑麦、芝麻、小麦、巴西坚果、榛子、澳大利亚坚果、花生、阿月浑子坚果和核桃的蛋白质。如上文针对例如卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白同种型S1、酪蛋白同种型S2、乳球蛋白和大麦等过敏原所例示,此也可通过检测过敏原所特有的至少一种经分离肽序列(例如,一种或一种以上具有先前所述或如表7-19中所概述的特定过敏原的氨基酸序列的肽)来实现。
根据一些实施例,所述方法可包含通过检测过敏原所特有的至少一种经分离肽(例如,一种或一种以上具有表7-19中所揭示的特定过敏原的氨基酸序列的肽)来对所述过敏原进行检测和/或定量。例如,三相四极质谱仪可用于监测所选多反应监测(MRM)转换以测定试样中过敏原特有肽的存在和/或量。在一些实施例中,过敏原特有肽可具有表7-19中所述的氨基酸序列,并且所述方法可包括监测至少一个具有所述过敏原所特有的m/z值且描述于表7-19中的前体-产物离子对转换,并且还可包括监测如表7-19中所述的所述过敏原(如果可用)所特有的片段离子。
在一个实例性实施例中,当每一过敏原特有肽具有一个以上与其相关的前体-产物离子对转换时,所述方法可包括监测与其相关的多个前体-产物离子对转换。举例来说,具有表7-19中所述的氨基酸序列的过敏原特有肽可通过监测任两个(如果可用)在表7-19中发现的特定过敏原的前体-产物离子对转换来鉴别。在一个实施例中,且如果可用,如果可用,可监测三个或三个以上所鉴别前体-产物离子对。
在一个实施例中,对其它过敏原(包括低和高分子量麦谷蛋白和来自芥子、燕麦、黑麦、芝麻、小麦、巴西坚果、榛子、澳大利亚坚果、花生、阿月浑子坚果和核桃的蛋白质)进行检测或定量的方法可包括检测多种过敏原特有肽。作为非限制性实例,过敏原可通过使用具有本文所鉴别的表7-19中所述的特定过敏原的氨基酸序列的肽的任一组合或全部来定量。如上文所论述,对于每一肽来说,可监测一个或一个以上前体-产物离子对转换。
下表7-19显示根据本教示内容测定为低和高分子量麦谷蛋白的过敏原和来自芥子、燕麦、黑麦、芝麻、小麦、巴西坚果、榛子、澳大利亚坚果、花生、阿月浑子坚果和核桃的蛋白质的过敏原所特有的肽的序列,以及其最佳MRM Q1,Q3转换和片段离子。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的过敏原进行可靠定量。
为了进一步明晰,根据本教示内容,表7-19中所述的每一过敏原显示所测定的所述过敏原的肽的序列,以及其最佳MRM Q1,Q3转换和片段离子信息。根据各实施例,这些观察的肽和转换可用于使得能够对试样中存在的所述过敏原进行可靠定量。
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
表17
表18
表19
在一些实施例中,上述过敏原中的两者或两者以上可通过经由LC-MS/MS检测每一过敏原所特有的一种或一种以上肽(例如上文所论述的那些)来检测和/或定量,其中对于每一肽来说,可监测多个MRM转换,例如上文所论述的那些。在一个实施例中,例如,可通过监测卵白蛋白所特有的两种肽的多个MRM转换(例如,监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.1的肽的MRM转换930/1116、930/888和930/1017和监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.7的肽的MRM转换390/667、390/504和390/433)如溶菌酶所特有的一种肽的多个MRM转换(例如,监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.8的肽的MRM转换437/452、437/680和437/737)在试样中检测卵蛋白质。在一个实施例中,例如,可通过监测酪蛋白同种型S1所特有的两种肽的多个MRM转换(例如,监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.12的肽的MRM转换693/920、693/991和693/1090和监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.16的肽的MRM转换880/1324、880/436、587/758、587/871和587/790)、酪蛋白同种型S2所特有的一种肽的多个MRM转换(例如,监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.20的肽的MRM转换598/911和598/456)和乳球蛋白所特有的一种肽的多个MRM转换(例如,监测具有氨基酸序列SEQ.ID NO.27的肽的MRM转换623/1047、623/918、623/819)在试样中检测牛乳蛋白质。在其它实施例中,表1到19中所揭示的任何过敏原的任一组合可使用类似程序进行检测和/或定量。
根据一些实施例,提供用于质谱测试试样中以下蛋白质中至少一者的试剂盒:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。试剂盒可包括以下物质所特有的一种或一种以上经分离肽:鸡卵白蛋白、鸡溶菌酶、牛酪蛋白或牛乳球蛋白、高或低麦谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果,包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子。例如,试剂盒可包括一种或一种以上具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的经分离卵白蛋白特有肽。在一个方面中,试剂盒可包括一种或一种以上具有氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的经分离溶菌酶特有肽。在一个实施例中,试剂盒可包括一种或一种以上经分离酪蛋白特有肽。例如,试剂盒可包括酪蛋白的S1同种型所有的一种或一种以上经分离肽,例如那些具有氨基酸序列SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的肽。或者或另外,试剂盒可包括酪蛋白的S2同种型所特有的一种或一种以上经分离肽,例如那些具有氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的肽。在一个实施例中,试剂盒可包括一种或一种以上具有氨基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29的经分离乳球蛋白特有肽。在一些实施例中,试剂盒可包含以下蛋白质中的每一者所特有的至少一种经分离肽:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(S1和/或S2)、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。例如,试剂盒可包含每一本文所鉴别的对应于SEQ ID NO:1-212的经分离肽中的一者。或者,试剂盒可包含一种选自对应于SEQ ID NO.1-7的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.8-11的群组的肽、选自对应于SEQ ID NO.12-18的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.19-23的群组的肽、一种选自对应于SEQ ID NO.24-29的群组的肽和一种选自表6-19中的每一过敏原的肽。在一些实施例中,所述肽可经同位素标记(例如,使用15N、13C)。在其它实施例中,一种或一种以上肽可选自本文所揭示的一些但非全部过敏原。
根据一些实施例,提供用于质谱测试试样中以下蛋白质中至少一者的试剂盒:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。试剂盒可包括例如至少一种用于将以下蛋白质中的一者或一者以上片段化成多种肽的蛋白水解酶:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。例如,蛋白水解酶可效地将过敏原片段化成多种肽,其中至少一者具有氨基酸序列SEQ ID NO.1-212。试剂盒还可包括至少一种用于使用质谱仪对多种肽中的至少一者进行定量的试剂,所述肽具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-212。
各种方法和试剂可有效地制备用于质谱分析的试样和/或将过敏原片段化成多种肽。例如,在一个实例性实施例中,蛋白水解酶可为胰蛋白酶,其可将过敏原裂解成多种肽。在一些实施例中,试剂盒可包括LC柱,在其上面固定有蛋白水解酶,例如胰蛋白酶。试剂盒还可包含消化组份,包括缓冲液酶、烷基化剂、还原剂和任选地其它试剂和/或组份。在一些实施例中,试剂盒可包含例如均匀分析,使得使用者只需要添加试样。
在一些实施例中,试剂盒可包含校准或归一化试剂或标准物。例如,试剂盒可包含以下蛋白质中的每一者所特有的至少一种肽:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白(S1和/或S2)、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质,其用于校准过敏原特有肽的定量。作为非限制性实例,试剂盒可含有已知浓度的每一过敏原特有肽的溶液,使得可构建校准曲线。在一些实施例中,试剂盒可含有至少一种用于校准过敏原特有肽或过敏原本身的定量的所关注过敏原(例如,卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质)。例如,试剂盒可包括已知量的以下蛋白质中的每一者:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低麦谷蛋白和来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果(包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子)的蛋白质。或者或另外,可通过向试样掺加氨基酸序列与所关注肽相同的至少一种同位素富集肽来执行校准。因此,试剂盒可包括一种或一种以上对应于SEQ ID NO.1-212中的每一者或一些的同位素富集肽。
根据一些实施例,可根据各种因素使用不同转换来测量和用基准问题测试(benchmark)分析结果。因此,试剂盒可包含不同转换值和/或建议设置,其可用于使得能够在试样与一种或一种以上对照试剂之间进行比较测量。试剂盒可包括与每一过敏原特有肽的Q1和Q3转换值有关的信息。例如,在一个实施例中,试剂盒可包含每一本文所鉴别的经分离肽SEQ ID NO:1-2,并且进一步可包含关于使用质谱仪对至少一种肽进行定量的说明书。在试剂盒中还可包括关于可以或应当用于执行分析的仪器设置的信息。试剂盒可包括关于试样制备、操作条件、体积量、温度设置等的信息。
根据一些实施例,可根据各种因素使用不同转换来测量和用基准问题测试分析结果。因此,试剂盒可包含不同转换值和/或建议设置,其可用于在试样与一种或一种以上对照试剂之间进行比较测量。试剂盒可包括测量特定转换对值(例如,Q1/Q3转换对或一个或一个以上不同转换对的值)的说明书。
试剂盒可包装在含有一个或一个以上试剂器皿和合适说明书的气密密封容器中。电子媒介也可含于试剂盒内并且可储存和/或提供关于一种或一种以上分析、测量值、转换对、操作说明书、用于实施操作的软件、其组合等的电子信息。
根据一些方面,提供本文所述的可控制过程和/或执行计算的软件。例如,软件可向质谱仪提供指令以监测一个或一个以上特定前体-产物离子对转换。
软件可包括例如基于对与试剂盒一起提供的校准标准物的质谱分析生成校准数据的模块和接收并分析质谱数据(例如,LC-MS/MS数据)以鉴别一种或一种以上上述肽和MRM转换的模块。在鉴别上述过敏原中一者所特有的一种或一种以上肽后,软件可利用校准数据来对那些肽和相关过敏原进行定量。
在其它实施例中,提供可实现针对过敏原筛选试样的方法,其包含:获得试样;
用至少一种蛋白水解酶消化所述试样以将所述试样中存在的至少一种过敏原(如果有)片段化成多种肽,其中所述至少一种过敏原选自由以下组成的群组:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高分子量谷蛋白、低分子量谷蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻、澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子;和通过使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定所述多种肽中至少一者的量来对所述试样中存在的所述过敏原中的至少一者进行定量,其中所述多种肽中的至少一者包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1-212的肽。在其它实施例中,对两种或两种以上过敏原进行定量。在另一实施例中,测定所述多种肽中的两者或两者以上以对所述过敏原中的所述至少一者进行定量。在另一实施例中,监测所述多种肽中每一者的所选MRM转换中的至少一个。在替代实施例中,监测所述多种肽中每一者的两个或两个以上所选MRM转换。在又一实施例中,蛋白水解酶为胰蛋白酶。
附图说明
图1显示由面包的实例性“空白”试样产生的实例性色谱图。
图2显示由掺加有牛乳且含有牛乳肽的面包试样产生的实例性色谱图。
图.3A、3B、3C描绘获得的三种特定牛乳肽的信号。
图4显示含有芥子的试样的质谱。
图5显示肽EQ ID NO.20的校准线。
图6显示肽EQ ID NO.16的校准线。
图7显示肽EQ ID NO.12的校准线。
图8显示肽EQ ID NO.27的校准线。
图9显示肽EQ ID NO.7的校准线。
实例
申请者的教示内容可参考下面的实例和所得数据得到甚至更全面地理解。所属领域技术人员通过考虑本说明书和实践本文所揭示的本教示内容将明了申请者的教示内容的其它实施例。这些实例仅打算视为实例性。
实例1
溶液的制备
提取缓冲液-将Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇,3.03g)和尿素(60g)溶解于水(480mL)中,制备50mM Tris缓冲液/2M尿素提取溶剂。所得溶液具有约10的pH值。
消化缓冲液-将碳酸氢铵(3.16g)溶解于水(400mL)中。所得溶液具有约7.8的pH值。
酶溶液-将胰蛋白酶(1g)溶解于消化缓冲液(20mL)中,制备50mg/mL浓度的储备液。将储备液(100μL)进一步稀释于10mL消化缓冲液中,制备500μg/mL溶液的最终胰蛋白酶溶液。所有酶溶液均在-20℃(或更低)下冷冻储存并且在使用前解冻。
碘乙酰胺溶液-将碘乙酰胺(0.925g)添加到10mL水中并且进行声波处理以溶解固体。在使用前新制备0.5M碘乙酰胺溶液并且在使用后丢弃。
混合过敏原掺加溶液的制备-将20.0mg(0.0200g)每一蛋白质(卵溶菌酶、卵白蛋白、牛乳α-酪蛋白和牛乳β-乳球蛋白)于15mL聚丙烯离心管中溶解于10.0mL提取缓冲液中,制备含有2000μg/mL每一过敏原的组合掺加溶液。当储存于冷冻器中时,所得混合过敏原掺加溶液稳定1个月。尚未测定更长期稳定性。
试样制备
如上文所论述,试样可得自多种来源。在此实例中,从干烘食物获得试样。在离心管(50mL)中混合微细粉末试样(5.0g)与30mL提取缓冲液并通过剧烈振荡打碎混合物并且使用辊式混合器进一步搅动(60分钟)。将离心管以3500rpm和15℃旋转沉淀5分钟。将200μL1M DTT溶液添加到6mL上清液。将试样混合并在37℃下加热60分钟。然后将试样冷却到室温并且添加2.0mL新制备的0.5M碘乙酰胺水溶液。振荡试样以进行混合并且避光储存(30分钟,在室温下)。向每一试样中添加6mL消化缓冲液(0.1M碳酸氢钠),之后添加400μL胰蛋白酶酶溶液(200μg总酶/试样)。在37℃下将试样培育过夜。离心试样(5分钟,10℃,以3000rpm)并且通过0.45μRC过滤器过滤。用0.5mL甲酸酸化滤液。
依次用6mL含有0.1%甲酸的乙腈和6mL含有0.5%TFA(三氟乙酸)的水对StrataTMx SPE筒体进行条件处理。将来自经离心试样的上清液以1-2滴/秒的速率加载到SPE筒体上。用3mL0.5%TFA水溶液洗涤SPE筒体。用6mL乙腈洗脱过敏原肽并且使用离心蒸发器将其蒸发到干燥。
通过添加300μL水/乙腈溶液(95%具有5%乙腈和0.5%甲酸的水)将试样残余物重构。将试样涡旋20-30秒并且声波处理30分钟以完成材料的溶解。将内容物转移到1.5mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)并且离心(5分钟,以13000rpm)。移出上清液并且将其转移到300μL带有压力配合帽的聚丙烯HPLC小瓶中以供HPLC分析。
使用岛津卓越LC***(Shimadzu Prominence LC system),使用菲罗门分析柱(Phenomenex Analytical Column)(4μm)、赛内吉海德鲁-RP80A柱(Synergi Hydro-RP80AColumn)(150×2.1mm),使用1.00ml甲酸存于999ml水中和1.00ml甲酸存于999ml乙腈中的流动相溶液执行色谱。流动速率为0.300ml/min,柱炉温度为30C。
使用离子源在应用生物***(Applied Biosystems)LC/MS/MS***上分析试样。使用MRM检测窗口为90s且目标扫描时间为0.40s的预定MRM(sMRM)来分析化合物。将Q1设定为低并且将Q3设定为单位分辨率以获得最大信号反应。
实例2
描述制备试样的另一方法,其中在此实例中。纳诺色谱10k亚米茄(NANOSEP10kOMEGA)(100/pk)和菲尼克斯(Phenex)RC膜(0.45μm),26mm注射器式过滤器。另外,利用以下HPLC溶剂和消耗品:水、甲醇(MeOH)、乙腈(CAN)、50mL聚丙烯离心管、15mL聚丙烯离心管、一次性玻璃培养管(13×100mm)、聚丙烯微型离心管(1.5mL)、锥形聚丙烯HPLC小瓶和帽(300μL)、一次性注射器、10mL容量鲁尔端(1uer end)。此外,提取和试样处理需要以下设备:用于50mL管的超速离心机、用于1.5mL管的微型离心机;用于试样处理的SPE歧管(具有真空泵);强迫通风培育器(设定为37℃)、辊式振荡器、离心蒸发器/浓缩器。
溶液的制备
提取缓冲液-将Tris(2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇,3.03g)和尿素(60g)溶解于水(480ml)中并且搅拌直到完全溶解以制备50mM Tris缓冲液/2M尿素提取溶剂。
消化缓冲液-将碳酸氢铵(3.16g)溶解于水(378mL)中。向其中添加2ml1M氯化钙和20ml乙腈。pH值为约7.8。
酶溶液-将胰蛋白酶(1g)溶解于消化缓冲液(20mL)中以制备50mg/mL浓度的储备液。将储备液(100μL)进一步稀释于10mL消化缓冲液中以制备500μg/mL溶液的最终胰蛋白酶溶液。所有酶溶液均在-20℃(或更低)下冷冻储存并且在使用前解冻。
个别过敏原储备液的制备-通过将30.0mg每一卵白蛋白、牛乳酪蛋白和乳球蛋白于5ml埃彭道夫管中溶解于3.0ml提取缓冲液中来制备10mg/ml储备液。当在-20C或更低下储存时,所得过敏原储备液稳定3个月,但尚未测定更长期稳定性。
混合过敏原掺加溶液的制备-将1.0ml每一过敏原储备液(10mg/ml)(卵白蛋白、牛乳酪蛋白和牛乳乳球蛋白)转移到5ml埃彭道夫管中且向其中添加2.0ml提取缓冲液并且混合。混合过敏原储备液含有2mg/ml每一过敏原并且当在-20C或更低下储存时稳定1个月,但尚未测定更长期稳定性。
混合过敏原掺加溶液的制备-将100μL混合过敏原储备液(2mg/ml)添加到2mL含有900μL提取缓冲液的埃彭道夫管。所得溶液含有200μg/ml每一过敏原蛋白质。
试样制备
将1.00g微细粉末试样称量到15ml离心管中。从下表20中的每一个别试样制备来自每一个别试样的连续添加校准试样。
表20
剧烈振荡每一混合物以打碎混合物并且然后使用辊式混合器进一步搅动60分钟。将离心管以3500rpm和15C旋转沉淀20分钟。将500μL每一上清液添加到2ml埃彭道夫管和50μL TCEP溶液并且在60C下在培育中涡旋混合60分钟。然后将管冷却到室温,添加25μL MMTS,再次涡旋以进行混合并培育10分钟。将500μL消化缓冲液添加到每一试样,之后添加20μL胰蛋白酶酶溶液(含有20μf总酶/试样)。通过旋涡将溶液充分混合。然后在37C下将试样培育过夜。第二天,将30μL甲酸添加到每一试样并充分混合。然后将试样以13000rpm离心5分钟。将500μL上清液加入10K-MwCO过滤器中并且以13000rpm离心20分钟。将200μL滤液转移到合适的聚丙烯HPLC自动取样器小瓶中以供LC/MS/MS分析,将剩余部分储存在-20C下以供在需要时进行进一步分析。
使用岛津卓越LC***,使用菲罗门分析柱(4μm)、赛内吉海德鲁-RP80A柱(150×2.1mm),使用1.00ml甲酸存于999ml水中和1.00ml甲酸对999ml乙腈的流动相溶液执行色谱。***也由***控制器(CBM-20A)、2个等度泵LC-20AD(具有半微量50μL混合器)、自动取样器SIL-20AC和柱炉CTO-20AC组成。另外,利用保护柱(菲罗门捕集筒体(trap cartridge)(4μm)、赛内吉海德鲁-RP80A墨丘利(Mercury)(20×2.0mm))、筒体固定器(菲罗门墨丘利MS20mm筒体固定器)并且利用95:5(v:v)乙腈:水+0.05%TFA的针头冲洗,其中流动速率:0.300mL/min,平衡时间:0.5min,柱炉温度:30℃,和注入体积:30μL。自动取样器针头冲洗顺序包括冲洗体积:1000μL,针头行程:52mm,冲洗速度:35μL/sec,取样速度:2.0μL/sec,冲洗浸渍时间:5sec,冲洗模式:抽吸之前和之后。
使用具有正极性的离子源在应用生物***LC/MS/MS***上分析试样。使用MRM检测窗口为90s且目标扫描时间为0.40s的预定MRM(sMRM)来分析化合物。将Q1设定为低并且将Q3设定为单位分辨率以获得最大信号反应。其它参数利用包括来源/气体参数IS:5500,CUR:30psi,TEM:500℃,GS1:35psi,GS2:46psi,Ihe:On,和CAD:高。
化合物MRM参数和保留时间包括DP:可变,EP:10,CXP:可变,停留时间:可变,Q1分辨率:低,Q3和分辨率:单位
使用连续掺加试样的面积对标称浓度的最小二乘方由回归从绝对峰面积获得校准曲线。通过使用回归方程反算每一掺加水平下的浓度来计算与回归线的偏差。由未掺加试样的表观浓度计算的回归曲线获得靶肽的浓度。卵白蛋白、卵溶菌酶、牛乳酪蛋白和乳球蛋白中每一者的线性范围在介于10μg/g与100μg/g之间的范围内。
每一试样具有其特有的定量用线性范围。应从回归中排除完整校准曲线中的校准标准物以满足适用范围。校准曲线描绘于图5到9中。
图5描绘当将200ppm掺加到面包中时,酪蛋白肽SEQ ID NO.20的校准线。图6描绘当将200ppm掺加到面包中时,酪蛋白肽SEQ ID NO.16的校准线。图7描绘当将200ppm掺加到面包中时,酪蛋白肽SEQ ID NO.12的校准线。图8描绘当将200ppm掺加到面包中时,牛肽SEQ ID NO.27的校准线。图8描绘当将200ppm掺加到面包中时,卵白蛋白肽SEQ ID NO.7的校准线。
实例3
将一包芥子与100mM Tris和2M尿素组合。使用氢氧化铵将pH调节到pH值为9和9.5以提取相关蛋白质。使试样经受如实例1或2中所述的类似制备和分析技术与添加碘乙酰胺以封阻半胱氨酸的额外过程。分离半胱氨酸经碘乙酰胺修饰的肽序列SEQ IDNO.103并进行分析。图4描绘此试样的质谱。很明显,于对应于2/y4片段离子的380/499处、于对应于2/y5片段离子的380/659处、于对应于2/b5片段离子的380/584(次峰)处和于对应于2/b4片段离子的380/487处鉴别质谱峰。
所关注肽和/或过敏原的定量可利用各种校准技术。例如,可在质谱分析前将含有已知量的所选肽的校准标准物添加到试样以生成校准曲线,所述标准曲线允许对随后运行经过LC-MS/MS的试样进行定量。在一些实施例中,可在制备用于质谱分析的试样前将已知量的所关注过敏原添加到试样。举例来说,可在用蛋白水解酶消化试样前将已知量的以下蛋白质中的一者或一者以上添加到所述试样:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高或低明胶蛋白、小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻和各种坚果,包括澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子。通过向试样中掺加已知浓度的所关注过敏原,可校准过敏原或其特有肽的定量。在一些实施例中,可迭代地测试掺加有各种已知量的所关注过敏原的多种试样以生成校准曲线,例如,使用连续稀释物或标准物添加方法进行。从质谱分析得到的数据的校准曲线可用于计算例如“未掺加”试样中的肽和/或过敏原的表观浓度。关于校准方案的一个实施例的各种校准曲线和进一步细节进一步显示于图5到9中,所述图描绘各种肽的校准曲线,其全部内容以引用方式并入本文中。
在一些实施例中,可例如通过同位素稀释质谱测定肽的量,其中向所制备的试样中掺加所关注肽的同位素富集形式。在一个实例性实施例中,可将校准标准物“掺加”到试样中,对于不同运行使用不同浓度(例如,连续稀释)。从质谱分析得到的数据的校准曲线可用于计算例如“未掺加”试样的表观浓度。
所属领域技术人员根据上述实施例将了解根据申请者的教示内容的方法和***的其它特征和优点。因此,除非在所附权利要求书中指明,否则申请者的揭示内容不受限于特别显示和描述的内容。本文所引用的所有出版物和参考文献的全部内容均以引用方式明确地并入本文中。
Claims (15)
1.一种检测试样中的过敏原的方法,其中所述过敏原选自由以下组成的群组:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高分子量麦谷蛋白、低分子量麦谷蛋白、小麦蛋白质、黑麦蛋白质、燕麦蛋白质、大麦蛋白质、芥子蛋白质、芝麻蛋白质、澳大利亚坚果蛋白质、阿月浑子坚果蛋白质、巴西坚果蛋白质、核桃蛋白质、花生蛋白质和榛子蛋白质,所述方法包含:
将蛋白水解酶添加到所述试样以将所述试样中存在的所述过敏原的至少一部***解成多种肽;和
利用液相色谱串联质谱LC-MS/MS来测定所述至少一种肽是否在所述试样中。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为卵白蛋白并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:1,m/z值为约391/504、391/667或391/433;
ii)SEQ ID NO:2,m/z值为约762/1036、762/487或762/1150;
iii)SEQ ID NO:3,m/z值为约605/419、605/621或605/749;
iv)SEQ ID NO:4,m/z值为约673/1096、673/1024、673/1209、449/526、449/608或449/639;
v)SEQ ID NO:5,m/z值为约791/1052、791/951或791/1239;
vi)SEQ ID NO:6,m/z值为约844/666、844/1332或844/1121;和
vii)SEQ ID NO:7,m/z值为约930/1017、930/1118、930/1303、930/888。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为酪蛋白并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:12,m/z值为约693/921、693/992或693/1091;
ii)SEQ ID NO:13,m/z值为约584/763、584/706、584/650或438/600;
iii)SEQ ID NO:14,m/z值为约416/488、416/587或416/702;
iv)SEQ ID NO:15,m/z值为约634/992、634/771或634/935;
v)SEQ ID NO:16,m/z值为约880/1325、880/1495、880/1438、880/436、587/758、587/871或587/790;
vi)SEQ ID NO:17,m/z值为约345/590、345/476或345/573;
vii)SEQ ID NO:18,m/z值为约416/488、416/587或416/702;
viii)SEQ ID NO:19,m/z值为约373/534或373/437;
ix)SEQ ID NO:20,m/z值为约598/912、598/701、598/814或598/436;
x)SEQ ID NO:21,m/z值为约438/629、438/558或438/445;
xi)SEQ ID NO:22,m/z值为约490/648、490/761、490/833;和
xii)SEQ ID NO:23,m/z值为约694/1187、694/811或694/940。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为乳球蛋白并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:24,m/z值为约533/853、533/754或533/641;
ii)SEQ ID NO:25,m/z值为约458/803、458/688或458/504;
iii)SEQ ID NO:26,m/z值为约1158/1453、1158/1581、1158/1255、772/1026、772/977或772/912;
iv)SEQ ID NO:27,m/z值为约623/573、623/918、623/819、623/1047;
v)SEQ ID NO:28,m/z值为约561/806、561/935或561/692;和
vi)SEQ ID NO:29,m/z值为约419/653、419/556或419/425。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为高分子量麦谷蛋白、低分子量麦谷蛋白或小麦蛋白质并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
a)SEQ ID NO:34,m/z值为约448/693、448/533、448/808、448/491或448/590;
b)SEQ ID NO:35,m/z值为约609/686、609/757、609/1072、609/631或609/845;
c)SEQ ID NO:36,m/z值为约905/994、905/1093、905/954或905/1085;
d)SEQ ID NO:37,m/z值为约924/994、924/1093或924/1242;
e)SEQ ID NO:38,m/z值为约983/1057、983/1080、983/1119或983/1185;
f)SEQ ID NO:39,m/z值为约399/699、399/498或399/611;
g)SEQ ID NO:40,m/z值为约825/1237、825/884、825/1012、825/1140或825/1062;
h)SEQ ID NO:41,m/z值为约1009/1237、1009/1135或1009/1140;
i)SEQ ID NO:42,m/z值为约880/1085、880/1184、880/998、880/911或880/1127;
j)SEQ ID NO:43,m/z值为约1050/1183、1050/1061、1050/1137或1050/1189;
k)SEQ ID NO:44,m/z值为约431/548、431/647、431/451或431/761;
1)SEQ ID NO:45,m/z值为约567/891、567/791、567/660或557/1020;
m)SEQ ID NO:46,m/z值为约640/790、640/1106、640/890、640/693或640/1049;
n)SEQ ID NO:47,m/z值为约676/861、676/890、676/1106、676/1205或676/764;
o)SEQ ID NO:48,m/z值为约757/1025、757/890或757/780;
p)SEQ ID NO:49,m/z值为约832/1108、832/948或832/1116;
q)SEQ ID NO:50,m/z值为约876/954、876/1067或876/1195;
r)SEQ ID NO:51,m/z值为约827/850、827/914或827/1248;
s)SEQ ID NO:52,m/z值为约594/928、594/814、594/686、594/757或594/601;
t)SEQ ID NO:53,m/z值为约623/871、623/743、623/814、623/644、623/985;
u)SEQ ID NO:54,m/z值为约672/1084、672/971、672/914、672/842或672/1141;
v)SEQ ID NO:55,m/z值为约918/989、918/1089或918/1224;
w)SEQ ID NO:56,m/z值为约1110/1181、1110/1199或1110/1243;
x)SEQ ID NO:57,m/z值为约494/620、494/641、494/571或494/507;
y)SEQ ID NO:58,m/z值为约859/974、859/1103、859/1231、859/1018或859/1214;
z)SEQ ID NO:59,m/z值为约743/865、743/1001、743/1100、743/1187或743/986;
aa)SEQ ID NO:60,m/z值为约523/674、523/802、523/545或523/432;
bb)SEQ ID NO:61,m/z值为约524/543、524/656、524/814、524/743、524/901、524/234或524/392;
cc)SEQ ID NO:62,m/z值为约579/898、579/711、579/899、579/1045或579/541;
dd)SEQ ID NO:63,m/z值为约608/898、608/711、608/1045、608/654或608/541;
ee)SEQ ID NO:64,m/z值为约657/697、657/1054、657/868、657/811或657/1201;
ff)SEQ ID NO:65,m/z值为约682/705、682/833、682/1178、682/772或682/592;
gg)SEQ ID NO:66,m/z值为约686/1054、686/697、686/868或686/1201;
hh)SEQ ID NO:67,m/z值为约718/1049、718/833、718/962、718/1121或718/592;
ii)SEQ ID NO:68,m/z值为约729/1018、729/946、729/875、729/1131或729/747;
jj)SEQ ID NO:69,m/z值为约459/730、459/560、459/659、459/473或459/829;
kk)SEQ ID NO:70,m/z值为约557/886、557/787、557/672或557/986;
ll)SEQ ID NO:71,m/z值为约661/822、661/951、661/735、661/1079或661/535;
mm)SEQ ID NO:72,m/z值为约735/1143、735/745、735/975、735/873、735/1046或735/632;
nn)SEQ ID NO:73,m/z值为约713/822、713/951、713/735、713/948或713/884;
oo)SEQ ID NO:74,m/z值为约762/1076、762/1029、762/793、762/979或762/857;
pp)SEQ ID NO:75,m/z值为约1048/1237、1048/1121、1048/1140、1048/894、1048/770或1048/761;
qq)SEQ ID NO:76,m/z值为约967/1167、967/995、967/1109、967/1209或967/1038;
rr)SEQ ID NO:77,m/z值为约414/513、414/428或414/699;
ss)SEQ ID NO:78,m/z值为约537/656、537/543、537/769或537/840;
tt)SEQ ID NO:79,m/z值为约566/713、566/600、566/826或566/897;
uu)SEQ ID NO:133,m/z值为约459/730或459/560;
vv)SEQ ID NO:134,m/z值为约538/547、538/776或538/705;
ww)SEQ ID NO:135,m/z值为约557/886或557/787;
xx)SEQ ID NO:136,m/z值为约579/898或579/711;
yy)SEQ ID NO:137,m/z值为约595/792、595/978或595/539;和
zz)SEQ ID NO:138,m/z值为约664/850或664/779。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为大麦蛋白质并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:30,m/z值为约835/948、835/1097或835/1228;
ii)SEQ ID NO:31,m/z值为约336/515、336/554或336/497;
iii)SEQ ID NO:32,m/z值为约820/1097、820/548或820/713;和
iv)SEQ ID NO:33,m/z值为约499/785、499/575或499/393。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为黑麦蛋白质并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:117,m/z值为约937/1178;
ii)SEQ ID NO:118,m/z值为约625/942或625/1178;
iii)SEQ ID NO:119,m/z值为约852/1200、852/1072或852/1210;
iv)SEQ ID NO:120,m/z值为约997/1226;
v)SEQ ID NO:121,m/z值为约665/1226或665/1129;
vi)SEQ ID NO:122,m/z值为约988/1101或988/1198;
vii)SEQ ID NO:123,m/z值为约659/1198。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为芥子蛋白质并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:80,m/z值为约323/476、323/547、323/470或323/419;
ii)SEQ ID NO:81,m/z值为约492/757、492/660、492/814或492/886;
iii)SEQ ID NO:82,m/z值为约586/666、586/767或586/896;
iv)SEQ ID NO:83,m/z值为约483/650、483/737、483/836或483/818;
v)SEQ ID NO:84,m/z值为约547/778、547/865或547/965;
vi)SEQ ID NO:85,m/z值为约365/519;
vii)SEQ ID NO:86,m/z值为约442/658、442/715、442/786或442/737;
viii)SEQ ID NO:87,m/z值为约738/1144、738/990或738/1087;
ix)SEQ ID NO:88,m/z值为约554/1087;
x)SEQ ID NO:89,m/z值为约600/694、600/795或600/924;
xi)SEQ ID NO:90,m/z值为约401/694;
xii)SEQ ID NO:91,m/z值为约547/778、547/865或547/964;
xiii)SEQ ID NO:92,m/z值为约365/519;
xiv)SEQ ID NO:93,m/z值为约774/1062、774/964或774/1175;
xv)SEQ ID NO:94,m/z值为约517/964;
xvi)SEQ ID NO:95,m/z值为约838/1190、838/965或838/1093;
xvii)SEQ ID NO:96,m/z值为约559/965;
xviii)SEQ ID NO:97,m/z值为约1059/1121、1059/1249或1059/1064;
xix)SEQ ID NO:98,m/z值为约706/1064;
xx)SEQ ID NO:99,m/z值为约600/1087;
xxi)SEQ ID NO:100,m/z值为约274/419、274/476、274/322或274/373;
xxii)SEQ ID NO:101,m/z值为约422/672、422/771、422/668或422/555;
xxiii)SEQ ID NO:102,m/z值为约736/882、736/1011、736/1139或736/1196;
xxiv)SEQ ID NO:103,m/z值为约380/499、380/659、380/584或380/487;
xxv)SEQ ID NO:104,m/z值为约490/519、490/679或490/792;
xxvi)SEQ ID NO:105,m/z值为约327/519;
xxvii)SEQ ID NO:106,m/z值为约593/1056、593/752或593/909;
xxviii)SEQ ID NO:107,m/z值为约396/752;
xxix)SEQ ID NO:108,m/z值为约377/553、377/624、377/578或377/465;
xxx)SEQ ID NO:109,m/z值为约550/739、550/867、550/1027或550/924;
xxxi)SEQ ID NO:110,m/z值为约739/1219、739/999、739/1127;
xxxii)SEQ ID NO:111,m/z值为约555/999;
xxxiii)SEQ ID NO:112,m/z值为约600/694、600/795、600/924或600/1087。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为花生蛋白质并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:182,m/z值为约543/858、543/430或543/633;
ii)SEQ ID NO:183,m/z值为约571/913、571/669或571/506;
iii)SEQ ID NO:184,m/z值为约628/855、628/742、628/514或628/970;
iv)SEQ ID NO:185,m/z值为约689/833、689/930或689/1078;
v)SEQ ID NO:186,m/z值为约695/700、695/814或695/978;和
vi)SEQ ID NO:187,m/z值为约787/804、787/989或787/1118。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述过敏原为巴西坚果蛋白质并且所述方法包含监测至少一个具有与选自由以下组成的群组的特定氨基酸序列相关的指定m/z值的前体-产物离子对转换:
i)SEQ ID NO:139,m/z值为约525/661、525/792或525/548;
ii)SEQ ID NO:140,m/z值为约847/1085、847/843或847/972;
iii)SEQ ID NO:141,m/z值为约350/568、350/437或350/307;
iv)SEQ ID NO:142,m/z值为约589/660、589/789或589/917;
v)SEQ ID NO:143,m/z值为约450/586、450/715或450/786;
vi)SEQ ID NO:144,m/z值为约434/603、434/490或434/403;
vii)SEQ ID NO:145,m/z值为约537/688、537/816或537/575;
viii)SEQ ID NO:146,m/z值为约416/584、416/699、416/507或416/455;
ix)SEQ ID NO:147,m/z值为约432/600、432/487或432/400;
x)SEQ ID NO:148,m/z值为约404/529、404/586、404/657、404/519或404/430;
xi)SEQ ID NO:149,m/z值为约500/723、500/886或500/461;
xii)SEQ ID NO:150,m/z值为约602/771、602/919或602/658;
xiii)SEQ ID NO:151,m/z值为约645/806、645/920或645/693;
xiv)SEQ ID NO:152,m/z值为约749/880、749/1084或749/692;
xv)SEQ ID NO:153,m/z值为约826/1090、826/904或826/571;
xvi)SEQ ID NO:154,m/z值为约615/863、615/963或615/707;和
xvii)SEQ ID NO:155,m/z值为约610/804、610/904或610/691。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述蛋白水解酶包含胰蛋白酶。
12.根据权利要求1所述的方法,其中利用LC-MS/MS来测定所述至少一种肽是否在所述试样中包含对所述至少一种肽在所述试样中的量进行定量,利用氨基酸序列与所述至少一种肽相同的至少一种同位素富集肽来校准所述至少一种肽的所述定量,并且利用包含已知浓度的所述至少一种肽的标准物来校准所述至少一种肽的所述定量。
13.一种用于质谱测试试样中的过敏原的试剂盒,其包含:
至少一种蛋白水解酶,其用于将所述试样中存在的至少一种选自由以下组成的群组的过敏原片段化成多种肽:卵白蛋白、溶菌酶、酪蛋白、乳球蛋白、高分子量麦谷蛋白、低分子量麦谷蛋白以及来自小麦、黑麦、燕麦、大麦、芥子、芝麻、澳大利亚坚果、阿月浑子坚果、巴西坚果、核桃、花生和榛子的蛋白质;和
至少一种试剂,其用于使用质谱仪对所述多种肽中的至少一者进行定量,其中所述多种肽中的所述至少一者包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:1到212的肽。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述至少一种用于对至少一种所述多种肽进行定量的试剂包含氨基酸序列与所述多种肽中的所述至少一者相同的至少一种同位素富集肽,且其中所述至少一种用于对至少一种所述多种肽进行定量的试剂包含所选浓度的用于校准所述质谱仪的所述多种肽中的所述至少一者。
15.根据权利要求13所述的试剂盒,其进一步包含烷基化剂、还原剂、关于使用质谱仪对所述过敏原的所述至少一者进行定量的说明书或关于待用作质谱仪中的设置的转换对的信息。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201611046130.4A CN106918709B (zh) | 2011-09-02 | 2012-09-04 | 检测过敏原的***和方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161530612P | 2011-09-02 | 2011-09-02 | |
US61/530,612 | 2011-09-02 | ||
PCT/US2012/053689 WO2013033713A1 (en) | 2011-09-02 | 2012-09-04 | System and method for the detection of allergens |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611046130.4A Division CN106918709B (zh) | 2011-09-02 | 2012-09-04 | 检测过敏原的***和方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103930787A true CN103930787A (zh) | 2014-07-16 |
CN103930787B CN103930787B (zh) | 2016-12-21 |
Family
ID=47756957
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611046130.4A Expired - Fee Related CN106918709B (zh) | 2011-09-02 | 2012-09-04 | 检测过敏原的***和方法 |
CN201280053386.1A Expired - Fee Related CN103930787B (zh) | 2011-09-02 | 2012-09-04 | 检测过敏原的***和方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201611046130.4A Expired - Fee Related CN106918709B (zh) | 2011-09-02 | 2012-09-04 | 检测过敏原的***和方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9970942B2 (zh) |
EP (2) | EP3282260B1 (zh) |
JP (3) | JP6328050B2 (zh) |
CN (2) | CN106918709B (zh) |
CA (1) | CA2847478A1 (zh) |
WO (1) | WO2013033713A1 (zh) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104987363A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-10-21 | 浙江省疾病预防控制中心 | 花生过敏源蛋白的特征肽及其应用 |
CN105738550A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-07-06 | 大连海洋大学 | 食品中潜在过敏原的筛选方法 |
CN106796206A (zh) * | 2014-08-11 | 2017-05-31 | 美国陶氏益农公司 | 用于变应原的选择性定量与检测的***和方法 |
CN106995491A (zh) * | 2016-01-25 | 2017-08-01 | 欧蒙医学诊断技术有限公司 | 新型澳洲坚果过敏原 |
CN108244621A (zh) * | 2016-12-29 | 2018-07-06 | 清华大学 | 一种源于发酵果汁的醇溶组分及其用途 |
CN108956837A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-12-07 | 浙江清华长三角研究院 | 一种用于检测牛乳品中A1β-酪蛋白含量的特征肽及方法 |
CN109557193A (zh) * | 2018-07-09 | 2019-04-02 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法 |
CN110073208A (zh) * | 2016-12-15 | 2019-07-30 | 株式会社岛津制作所 | 质谱分析装置 |
CN110577993A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-17 | 苏州乾康基因有限公司 | 检测过敏相关基因突变的引物组、探针组、试剂盒及用途 |
WO2021046819A1 (en) * | 2019-09-12 | 2021-03-18 | Mars, Incorporated | Quantifying peanut proteins in food products |
CN115286691A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-11-04 | 上海理工大学 | 一种大麦肽纳米载体及其制备方法和应用 |
TWI817259B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-10-01 | 國立中興大學 | 檢測芒果過敏原之方法及芒果過敏原標記胜肽 |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103293317B (zh) * | 2013-04-28 | 2015-08-05 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种牛乳β-乳球蛋白定量检测试剂盒及其应用 |
CN104630333B (zh) * | 2013-11-14 | 2018-05-01 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 澳洲坚果过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法 |
ES2516616B1 (es) * | 2014-07-24 | 2015-09-08 | Instituto De Investigación Sanitaria - Fundación Jiménez Díaz | Procedimiento de detección del alérgeno de mostaza sin a 1 en una muestra alimentaria |
JPWO2016159181A1 (ja) * | 2015-03-30 | 2018-02-22 | 国立大学法人大阪大学 | 免疫用ペプチド、免疫用ペプチドの製造方法、それを含む免疫疾患用医薬組成物、および免疫疾患の治療方法 |
CA3008389A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | Morinaga Institute Of Biological Science, Inc. | Protein detection method, and protein immunoassay method |
ES2952741T3 (es) * | 2015-12-29 | 2023-11-03 | Sanofi Sa | Métodos para caracterizar composiciones que comprenden antígenos de cacahuete |
CN105973969A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-09-28 | 大连海洋大学 | 食品低致敏加工方式的筛选方法 |
US20180011107A1 (en) * | 2016-07-07 | 2018-01-11 | Genysis Lab Inc. | Identification of the presence of specific polypeptides by liquid chromatography and mass spectrometry |
JP6903661B2 (ja) | 2016-07-21 | 2021-07-14 | 株式会社日清製粉グループ本社 | アレルゲン検出方法 |
CN107290461B (zh) * | 2017-07-14 | 2020-06-16 | 浙江工商大学 | 一种建立蜂王浆致敏蛋白的液质联用分析的方法 |
US20200370090A1 (en) * | 2017-07-31 | 2020-11-26 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Compositions and methods for detecting allergens |
CN108152385A (zh) * | 2017-11-10 | 2018-06-12 | 杭州谱胜检测科技有限责任公司 | 一种婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白含量的检测方法及实现该方法的试剂盒 |
US11408895B1 (en) | 2018-04-09 | 2022-08-09 | Hob Biotech Group Corp., Ltd. | Allergen characterization, potent allergen product formulation, comprehensive allergen reagent, and allergy assay |
CN109283239B (zh) * | 2018-10-22 | 2022-01-04 | 山东省农业科学院奶牛研究中心 | 一种检测牛乳中不同β-酪蛋白变体型的方法 |
EP4023664A4 (en) | 2019-08-30 | 2023-11-22 | Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Health Sciences | ALLERGEN DETECTION MARKERS AND ALLERGEN DETECTION METHODS USING THEREOF |
JP7405266B2 (ja) | 2020-08-24 | 2023-12-26 | 株式会社島津製作所 | 質量分析制御装置、質量分析装置、質量分析方法およびプログラム |
CN113321705B (zh) * | 2021-06-15 | 2022-04-26 | 北京林业大学 | 一种弹性蛋白酶抑制肽及其制备方法与应用 |
CN113341037B (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-16 | 北京三元食品股份有限公司 | 检测乳粉中乳清蛋白、酪蛋白含量和/或二者比例的方法 |
EP4293351A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-12-20 | ifp Privates Institut für Produktqualität GmbH | Sensitive detection of food allergens by immunoenrichment and lc-ms/ms |
CN113728865B (zh) * | 2021-09-24 | 2022-12-13 | 广西壮族自治区亚热带作物研究所(广西亚热带农产品加工研究所) | 一种澳洲坚果促花保果的综合管理方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1385194A2 (en) * | 2002-07-24 | 2004-01-28 | Micromass UK Limited | Mass spectrometer |
CN101287991A (zh) * | 2005-09-15 | 2008-10-15 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 对变应原进行定量的方法 |
CN101310177A (zh) * | 2005-11-08 | 2008-11-19 | 国立大学法人东北大学 | 用质谱仪定量膜蛋白质的方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7498162B2 (en) * | 2000-09-25 | 2009-03-03 | Nestec S.A. | Lactic acid bacteria capable of reducing an individual's tendency to develop allergic reactions |
US7052916B2 (en) * | 2002-05-24 | 2006-05-30 | Immunex Corporation | Polypeptide analyses using stable isotope labeling |
JP4278028B2 (ja) * | 2002-12-18 | 2009-06-10 | 明治乳業株式会社 | 炎症性サイトカイン産生抑制活性を有するペプチド |
TW200512459A (en) | 2003-09-23 | 2005-04-01 | Univ Nat Cheng Kung | Global analysis for protein expression kit and protein qualitative and quantitative method thereof |
CA2621067C (en) * | 2005-09-15 | 2014-04-29 | Alk-Abello A/S | A method for quantification of allergens |
WO2008146100A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for absolute quantification of polypeptides |
GB0906698D0 (en) * | 2009-04-17 | 2009-06-03 | Queen Mary & Westfield College | Method for quantifying modified peptides |
EP2249162A1 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-10 | Stallergenes Sa | Method for grass species identification |
-
2012
- 2012-09-04 EP EP17193549.7A patent/EP3282260B1/en active Active
- 2012-09-04 US US14/342,079 patent/US9970942B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-04 JP JP2014528696A patent/JP6328050B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-04 CN CN201611046130.4A patent/CN106918709B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2012-09-04 WO PCT/US2012/053689 patent/WO2013033713A1/en active Application Filing
- 2012-09-04 EP EP12828908.9A patent/EP2751573B1/en not_active Not-in-force
- 2012-09-04 CA CA2847478A patent/CA2847478A1/en not_active Abandoned
- 2012-09-04 CN CN201280053386.1A patent/CN103930787B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2017
- 2017-12-12 JP JP2017237514A patent/JP6605013B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-10-15 JP JP2019188801A patent/JP2020020809A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1385194A2 (en) * | 2002-07-24 | 2004-01-28 | Micromass UK Limited | Mass spectrometer |
CN101287991A (zh) * | 2005-09-15 | 2008-10-15 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 对变应原进行定量的方法 |
CN101310177A (zh) * | 2005-11-08 | 2008-11-19 | 国立大学法人东北大学 | 用质谱仪定量膜蛋白质的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
J. HEICK ET AL.: "First screening method for the simultaneous detection of seven allergens by liquid chromatography mass spectrometry", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》, vol. 1218, no. 7, 23 December 2010 (2010-12-23), XP 028138512, DOI: doi:10.1016/j.chroma.2010.12.067 * |
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106796206A (zh) * | 2014-08-11 | 2017-05-31 | 美国陶氏益农公司 | 用于变应原的选择性定量与检测的***和方法 |
CN104987363A (zh) * | 2015-06-25 | 2015-10-21 | 浙江省疾病预防控制中心 | 花生过敏源蛋白的特征肽及其应用 |
CN106995491B (zh) * | 2016-01-25 | 2021-12-07 | 欧蒙医学实验诊断股份公司 | 澳洲坚果过敏原 |
CN106995491A (zh) * | 2016-01-25 | 2017-08-01 | 欧蒙医学诊断技术有限公司 | 新型澳洲坚果过敏原 |
CN105738550A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-07-06 | 大连海洋大学 | 食品中潜在过敏原的筛选方法 |
CN110073208A (zh) * | 2016-12-15 | 2019-07-30 | 株式会社岛津制作所 | 质谱分析装置 |
CN110073208B (zh) * | 2016-12-15 | 2022-02-11 | 株式会社岛津制作所 | 质谱分析装置 |
CN108244621A (zh) * | 2016-12-29 | 2018-07-06 | 清华大学 | 一种源于发酵果汁的醇溶组分及其用途 |
CN108244621B (zh) * | 2016-12-29 | 2022-06-14 | 清华大学 | 一种源于发酵果汁的醇溶组分及其用途 |
CN108956837A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-12-07 | 浙江清华长三角研究院 | 一种用于检测牛乳品中A1β-酪蛋白含量的特征肽及方法 |
CN109557193B (zh) * | 2018-07-09 | 2022-05-17 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法 |
CN109557193A (zh) * | 2018-07-09 | 2019-04-02 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法 |
WO2021046819A1 (en) * | 2019-09-12 | 2021-03-18 | Mars, Incorporated | Quantifying peanut proteins in food products |
CN110577993A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-17 | 苏州乾康基因有限公司 | 检测过敏相关基因突变的引物组、探针组、试剂盒及用途 |
TWI817259B (zh) * | 2021-11-23 | 2023-10-01 | 國立中興大學 | 檢測芒果過敏原之方法及芒果過敏原標記胜肽 |
CN115286691A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-11-04 | 上海理工大学 | 一种大麦肽纳米载体及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3282260B1 (en) | 2019-12-11 |
JP2014525588A (ja) | 2014-09-29 |
CA2847478A1 (en) | 2013-03-07 |
CN103930787B (zh) | 2016-12-21 |
CN106918709B (zh) | 2020-03-10 |
WO2013033713A1 (en) | 2013-03-07 |
EP2751573A4 (en) | 2015-08-12 |
JP2018066751A (ja) | 2018-04-26 |
US20160025741A1 (en) | 2016-01-28 |
EP3282260A2 (en) | 2018-02-14 |
CN106918709A (zh) | 2017-07-04 |
EP2751573A1 (en) | 2014-07-09 |
EP2751573B1 (en) | 2017-11-08 |
JP6605013B2 (ja) | 2019-11-13 |
JP2020020809A (ja) | 2020-02-06 |
US9970942B2 (en) | 2018-05-15 |
JP6328050B2 (ja) | 2018-05-23 |
EP3282260A3 (en) | 2018-03-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103930787A (zh) | 检测过敏原的***和方法 | |
JP6563574B2 (ja) | 品質管理試薬及び方法 | |
CN102510903A (zh) | 蛋白质和多肽的质谱鉴定和定量检测的方法学革新 | |
I Razinkov et al. | Methods of high throughput biophysical characterization in biopharmaceutical development | |
CN109791131A (zh) | 用于生肉和加工肉类产品的肉种鉴定的lc/ms/ms分析 | |
CN104797715A (zh) | 通过质谱法定量甲状腺球蛋白 | |
CN106749598A (zh) | 一种用于检测羊奶粉中牛奶粉掺假比例的特征肽组合及方法 | |
CN104569134B (zh) | 一种基体中蛋白质酶切效率的准确测定方法 | |
Er et al. | Determination of seventeen free amino acids in human urine and plasma samples using quadruple isotope dilution mass spectrometry combined with hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry | |
Xiang et al. | Chemical cross-linking and mass spectrometric analysis of the endogenous yeast exosome complexes | |
CN105866315A (zh) | 一种电子烟烟液中氨基酸的测定方法 | |
JP7499774B2 (ja) | 無傷のタンパク質レベルでのLC-MSに基づくHbA1c測定の自動化試料ワークフロー | |
CN104614452B (zh) | 一种液相色谱-串联质谱内标法测定l-羟脯氨酸的方法 | |
Gaugler et al. | Validation of an automated extraction procedure for amino acids and acylcarnitines for use with tandem mass spectrometry for newborn screening | |
JP2022517413A (ja) | LC-MSに基づくHbA1c測定の高速試料ワークフロー | |
CN111458496A (zh) | 基于内标校正的免疫精准定量分析方法及其专用试剂盒 | |
Zheng et al. | Ligand–protein target screening from cell matrices using reactive desorption electrospray ionization-mass spectrometry via a native-denatured exchange approach | |
Lovdel et al. | Extraction and LC-MS/MS analysis of four steroids from mouse plasma and bone marrow | |
Stewart et al. | Chemical analysis of aquatic pheromones in fish | |
Nguyen | Analysis of Growth Hormone Releasing Hormone Analogues in Dried Biological Samples using Smart Affinity Samplers: Development of a µSPE LC-MS/MS Method | |
Marques et al. | The Importance of Sample Preparation for Omics Analysis: Which Extraction Method is the Most Suited for my Biological Question? | |
Tian et al. | Differentiating specific and non-specific protein-metabolite interactions using gradient open port probe electrospray ionization mass spectrometry | |
Razavi et al. | Full automation of the SISCAPA® workflow using a Biomek NXP Laboratory Automation Workstation | |
Anderson et al. | Sensitive and Robust LC-MS/MS Analysis of Salivary Cortisol in Negative Mode | |
CN115902007A (zh) | 测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20161221 Termination date: 20210904 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |