CN103930097B - 用于生产原位形成的基质的喷射体系 - Google Patents

Abstract

描述用于生成原位形成的基质的喷射体系，其包括至少一种亲脂性组分，该亲脂性组分包括基于乙醇酸和乳酸的至少一种聚合物和XlogP3值小于0.2的至少一种生物相容性溶剂；和至少一种亲水性组分，其中至少两种组分在应用前彼此分离地存在，并且不被混合，直到喷射或处于喷射进程中，其中组分在喷射到人组织上时形成膜。

Description

用于生产原位形成的基质的喷射体系

本发明涉及用于防止粘连，具体地外科粘连，的喷射或施用体系。

在损伤和手术后，粘连频繁发生。它们发展成堆积和瘢痕，并导致术后并发症。具体地，腹部的外科干预导致多达94%的患者体内的原发性术后粘连。腹膜，如同浆膜，形成腹腔的内衬。其由内脏层和周缘层组成，其中具有浆液间隙，该浆液间隙填充有5至20ml的液体，允许器官自由滑动。在组织学上，腹膜包括鳞状上皮单层——其也被称为间皮层，和浆膜下***薄层。在几天之内，间皮层的损伤导致这两层和周围组织的之间形成永久性粘连。除手术造成的损伤外，间皮层还可通过如下被损伤：拭子的使用、手术期间的表面干燥、或通过滑石粉手套与滑石接触。即便在微创手术中，如腹腔镜检查，激活过程也在运行过程中成立。

尽管腹膜粘连的病理生理学研究超过了一个世纪，但迄今为止的发现仍是不完全的。图1归纳显示了腹膜粘连的发病机理和可能的治疗方法。假设腹膜组织的创伤引发炎性反应，并且渗出炎性细胞和可溶性纤维蛋白单体。这些在约3小时内形成纤维结构，如果存在足够的纤维蛋白溶解活性，则该纤维结构可在前几天内被丝氨酸蛋白酶纤溶酶溶解。但是，如果这种情况没有发生，结果则是会形成胶原蛋白富集的***，即永久性粘连，其然后将产生问题。

虽然在损伤后的前两天，炎性过程主要涉及中性粒细胞，但巨噬细胞和间皮细胞在永久性粘连的发生中发挥重要作用。两种细胞类型均能够将纤溶酶原，即纤溶酶的前体，释放到血流中。在毛细血管中，纤溶酶原通过丝氨酸蛋白酶纤溶酶原激活因子（组织/尿激酶纤溶酶原激活因子，t-PA/u-PA）转化成纤溶酶。这些蛋白酶也是由间皮层分泌。通过浓度增加的炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（TNF）、转化生长因子（TGFβ）或白介素触发，活性tPA浓度在创伤后阶段减少。这导致腹腔中的纤维蛋白溶解活性显著降低，这导致纤维蛋白溶解和纤维蛋白形成之间失衡，并且促进永久性粘连形成。组织中活性t-PA浓度的降低转而是由于间皮细胞中的t-PA产量降低以及同时纤溶酶原激活因子抑制剂类型1（PAI-1）——组织纤溶酶原激活因子的最重要的抑制剂——的超表达。类似于原发性伤口闭合——其中血小板渐增地分泌PAI-1从而防止纤维蛋白过早溶解而因此启动原发性伤口闭合，在创伤后阶段，间皮下血管的间皮细胞和内皮细胞形成纤溶酶原激活因子抑制剂出现增多。因此，假设t-PA/PAI-1平衡是形成腹膜粘连的关键点。

关于永久性粘连的治疗，存在不同的方法，如：

i）原发性预防——通过避免损伤和发炎，

ii）通过抗凝血剂防止含血清渗出物凝固，

iii）通过纤溶剂溶解纤维结构，

iv）应用机械屏障，直到间皮层通过分离而再生，和

v）防止纤维组织形成（fibrosation）。

纤溶剂的应用和物理屏障的应用被认为是有前途的治疗方法；但是，这些方法由于其相关缺点未发现被临床接受。已经发现，当前可用的纤溶剂具有不足的抗粘连活性，据推测是由于其在血浆中的短半衰期等。因此需要的高剂量产生强副作用，而制止其的应用。已知的纤溶剂是链激酶、尿激酶和重组生成的t-PA蛋白阿替普酶（alteplase，可以以获得）及其修饰形式瑞替普酶（reteplase，可购自）。阿替普酶在血浆中的半衰期仅为3至6分钟，修饰形式的瑞替普酶的血浆半衰期增加至13至16分钟。因此，需要多个施用和输液泵来获得连续药物水平，其产生高副作用。

物理屏障也已被用于减少粘连。但是，迄今为止还不能对术后并发症显示出积极作用。当前可用的物理屏障体系限于局部施用区域。已知的物理屏障主要是可吸收组织，如氧化纤维素纤维、透明质酸和羧甲基纤维素的组合、或PEG凝胶。

例如，由US2011/0052712A1已知，利用可生物降解的聚合物作为粘连屏障。该文献提出用于生成粘连屏障的制剂，其包括大量来自可生物降解的聚合物和至少一种水溶性聚合物的聚合物组合的颗粒，其以膜形式沉积在组织上，以防止粘连。施用后水溶性聚合物的目的是从组织吸水膨胀，从而能够实现膜形成和水的提供，使得颗粒逐渐分解和释放可能包括的活性剂。这些颗粒可包含例如抗炎剂，作为活性剂。但是，通过该制剂获得的膜的性质取决于在施用位点处可获取的水量，并且无法以再现形式被调节。

还已提出将防止粘连的活性剂施加于损伤或手术位点。由于液体不长时间保持在理想位置，在过去已研发了这样的体系：其中活性剂——可能被包封在可生物降解的聚合物中，被提供在预制基质中。但是，固定体系对于患者而言是不舒适的，特别是在腹腔区。因此，还已提出取而代之使用的凝胶，其可包含活性剂。因此，WO2004/011054例如公开了聚合物储存组合物，其包括由具有低至高分子量的不同类型的聚合物制成的聚合物基质，该聚合物基质包括难混溶于水的溶剂，以提高聚合物的塑性。提出的组合物是多种类型的聚合物的复合体系，因此在生产和应用中成本高昂而且复杂。

通过包含将水吸收到基质中的水溶性或水膨胀性聚合物而将来自周围的水用于基质形成的已知体系的缺点存在于基质中包括的活性剂，其通过水过于迅速释放，使得作用位点处在初始存在过高的活性剂浓度。理想的是均匀释放，而在开始时没有所谓的“***”。为实现这个目标，US2009/0004273提出通过利用聚合物体系包封蛋白和肽，该聚合物体系在体系接触组织流体时不形成水凝胶。为带来活性剂的大致连续线性释放和防止在开始时***，应用由疏水性组分和亲水性组分组成的两种不同的聚合物体系，其可例如以装置膜或涂层形式被供应。

为使植入物施用性灵活，还提出原位形成膜或植入物。为此，例如，DE10001863描述了原位形成的植入物，其通过在施用前立刻混合载体材料和溶剂而原位形成，使得至少部分载体材料溶解，从而在身体中形成液晶相。载体材料以粉末形式提供，并例如通过喷射干燥获得。具体地，在其还包括活性剂时，必须小心使得载体材料充分地混合，以使活性剂均匀地分布在产生的基质中。

进一步，原位形成的载体体系已被描述用于植入物生产。由于身体中的基质形成不可以直接应用温度和pH值变化以及反应性组分，因此最常用的技术是溶剂沉淀。因此，在已知的方法中，植入物最常通过溶解在有机溶剂中的水不溶性聚合物与组织流体（淋巴）的接触而被固化。为促进沉淀，在其中一些已知方法中，如上所述，将吸水性组分加入组合物，如膨胀性聚合物。取决于使用的载体体系和有机溶剂，通过形成粘性凝胶实现粘度增加，或通过基质形成实现真正的载体体系沉淀。为此，常使用乳酸和乙醇酸的共聚物，其沉淀可通过溶剂和聚合物选择来控制。取决于药物活性组分的分子大小，释放动力学和释放持续时间均可被酌情调节。现有技术中描述的两种技术是技术，其利用N-甲基-2-吡咯烷酮作为水混溶性溶剂；和技术，其利用水难溶性溶剂。公知的事实是，水混溶性较高导致植入物形成较快，因此导致基质多孔性较高，而水难溶性溶剂或高浓度聚合物溶液导致植入物形成较慢。前者方法导致嵌入组分迅速释放而且活性剂初始释放较高，所谓的“***”。后者方法导致持续释放，并且释放仅开始于一定时间后。基于技术的产品可被购买，以治疗晚期激素相关***癌的激素制剂的形式。

这种体系的有益之处在于其可在理想位点被直接施用并且活性剂也可在施用期间被嵌入基质。但是，已知的原位形成的植入物的最大问题是植入物的形态控制和因此药物释放的控制。植入物的形态取决于施用位点的条件，因此再现性几乎是不可能的，并且阻止释放动力学的预定设置。

因此，全部之前已知的体系均仍具有缺点，并且还未满足应用。因此，本发明的目标是提供克服这些缺点、方便使用、使用过程无需复杂或昂贵措施、并且有助于可靠地防止损伤和手术后粘连的体系。此外，体系将提供递送活性剂的可能性，其中活性剂的释放将是可预料的，可调节的和以恒定方式发生的，而不导致在开始时***，而且无过长的延迟。

此外，本发明的目标是提供这样的施用体系：其可被直接喷射在预期位点上；其能够吸收活性剂，具体地亲水剂，如核酸、蛋白质或肽，和能够将它们以控制方式释放；其可在施用位点产生稳定的膜，并且该膜的释放性质是可调节的和可优化的。此外，将提供这样的施用体系：其是生理相容的，并且不妨碍蛋白质、肽和核酸的活性，因此允许释放活性产物。

此外，本发明的目标是提供可有效防止外科粘连并且有助于防止永久性粘连的施用体系。

上述目标是通过权利要求1限定的可喷射的施用体系实现的。可喷射的施用体系，在下文中也被称为喷射体系，包括由溶解在溶剂中的至少一种聚合物形成的至少一种亲脂性组分、和至少一种水性组分、以及任选地至少一种活性剂。其可包括进一步的组分。

惊讶地发现，本发明限定的具体组合物提供这样的载体材料：方便使用，稳定，可在理想位点上并以理想程度施用，并且能够提供活性剂达理想的时间段并以理想释放速率提供活性剂。

有益的性质通过喷射体系来实现，该喷射体系包括两种组分，其中一种组分具有溶解在溶剂中的至少一种聚合物，和另一组分具有至少一种水性溶剂，其中组分在施用前即刻或在施用期间彼此掺合在一起并且通过喷射施用，其中本发明的组分原位形成基质，该基质在预定时间段后分解，并且在该时间段中以控制方式释放任选地包括的活性剂。

通过根据本发明的体系形成的膜具有高品质并且在其发挥作用所在的施用位点处保持预定时间。仅通过本发明特征的组合，就可以获得具有理想性质的载体材料。

本发明的重要特征是聚合物类型和溶剂类型以及施用形式，即，在喷射前即刻或喷射时或喷射期间使两种组分接触。

根据本发明的体系的其中一个基本特征是亲脂性组分，其包括基于乙醇酸和乳酸的至少一种聚合物和所述聚合物的至少一种生物相容性溶剂，该溶剂具有预定logP值，如下文更详细描述。这种亲脂性组分然后在喷射前即刻或喷射时与包括至少一种水性溶剂的至少一种亲水性组分掺合，通过聚合物的沉淀产生基质，该基质在喷射位点形成物理屏障，能够有效防止外科粘连。在优选的实施方式中，亲脂性组分和/或亲水性组分包括至少一种活性剂，其在喷射和膜形成期间嵌入膜，并以控制方式从中释放，另外通过生理学和/或生物学手段阻止外科粘连。

本施用体系的具体优点在于，由于具体施用组分的选择，聚合物基质通过聚合物从溶剂中沉淀而在喷射期间形成。活性剂嵌入在这种聚合物基质中——如果组合物包含活性剂。聚合物沉淀将意为，超过聚合物的溶解极限并且聚合物不再溶解或完全溶解在溶剂中。通过调节各个组分，可以预先确定沉淀速率和膜形成速率和因此所得基质的多孔性，这导致控制释放性质。鉴于这些聚合物的可变性，存在多种可能性以调节最佳性质；但是，找到用于具体情况的最佳溶液不一定容易。因此，在下文中描述能够实现最佳体系选择的参数。

本发明体系的关键因素主要是：所用的聚合物，用于溶解聚合物的溶剂，聚合物、溶剂和水性组分含量，以及任选地活性剂的含量和形式。

用于基质形成的材料应是可灭菌的，并且其必须允许包含的活性剂在一定时间段——其中可发生粘连形成或瘢痕形成——的控制释放。该时间段的范围为至少两周多达六周，优选二至四周。此外，材料必须具有一定品质，使得其保持其稳定性足以实现理想目标的时间，即，用于防止粘连。

适当聚合物选择的重要参数是摩尔质量（分子量）。适当分子大小的选择建立在固有粘度（基于溶解物的浓度C的相对粘度的自然对数）的基础上。以本身已知的方式，通过在25℃下在CHCl₃中以0.1%测量PLGA聚合物的固有粘度。对于本发明体系而言，优选这样的聚合物：其固有粘度的范围为0.1至0.8，具体地0.15至0.7。如果该值低于0.1，则聚合物通常过小，而不能持续足够长的活性。如果该值过大，则无法保证足够的膜品质；此外，直到释放开始的延迟可能过长。为实现最佳性质，也可以使用具有不同摩尔质量的聚合物混合物。

PLGA聚合物的摩尔质量也可通过常规方法确定，例如，通过凝胶渗透色谱法。发现摩尔质量在10至63kDA范围内的PLGA聚合物非常适合。

存在进一步的因素有助于选择适于本发明的施用体系的聚合物。本发明的体系必须是可喷射的，这表示其必须是可溶或可悬浮于生物相容性溶剂。

由本发明的施用体系形成的膜的品质和机械稳定性的度量是基质和/或膜的品质，其可通过实施例中描述的方法来确定。图2显示关于多种聚合物和溶剂组合的膜品质在实施例中描述的测试结果。膜品质基本上由溶剂选择和聚合物摩尔质量确定。关于其确定，明确基于所用聚合物总量聚合物在上清液（损耗）和在沉淀（基质品质）中的百分比。所得层或所得膜的基质品质对于本发明的体系至关重要，因为体系必须作用至少两周和多达六周。这只有在形成的膜或形成的层足够稳定同时提供理想释放动力学的情况下是可能的。因此，基质品质应处于下列范围：80至100%，优选地90至100%，最优选95至100%，其中该值在室温下确定，即，约25℃，其中该方法被描述于实施例中。

基质品质取决于聚合物的摩尔质量等。已发现，在聚合物具有较高摩尔质量的情况下，可以将较大量聚合物掺入基质，而在聚合物具有较低摩尔质量的情况下，存在聚合物损耗（用于膜形成）。例如，发现对于丙交酯与乙交酯的比为75：25并且固有粘度为0.5至0.7的PLGA聚合物而言——即具有相对高的摩尔质量和使用具有酯化端基的聚合物，几乎100%的所用聚合物量形成基质。相反，发现对于丙交酯与乙交酯的比为50：50并且固有粘度<0.6并且具有游离端基的PLGA聚合物而言，聚合物在基质形成期间流失，即，其未嵌入基质。这种效应可通过溶剂被增高或提高。

如上所述，所用聚合物是体系基本组分之一。根据本发明，乙醇酸基和乳酸基聚合物，即聚(丙交酯-共聚-乙交酯)，通常是聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯)，在下文中也被称为PLGA聚合物，被用于施用体系。可以使用基于D,L-丙交酯的聚合物和基于对映纯L-丙交酯的聚合物。

已知乳酸基和/或乙醇酸基聚合物相当一段时间，控制释放体系也是。总体上，PLGA聚合物被加工成微粒或植入物，然后其可以多种方式应用。PLGA聚合物是可生物相容的和可生物降解的，并且其性质可适于不同用途。

本发明利用溶解在溶剂中的乙醇酸基和乳酸基聚合物。这些聚合物的释放动力学通过其分子量、分子量分布及其端基来调节。

因此，通过具体选择聚合物和溶剂，可选择所得基质是否实现扩散主导的，侵蚀主导的，或扩散主导和侵蚀主导两者的释放。根据本发明实现的高品质迅速基质形成构成实现线性释放动力学而无初始活性剂损耗的重要工具。

已发现，PLGA聚合物比纯聚丙交酯（PLA）或纯聚乙交酯（PGA）更适于本发明的体系。通过调节乳酸单元与乙醇酸单元的比，可以精确地以本身已知的方式控制性质，具体地降解性质。在本发明的施用体系中，这样的PLGA聚合物已被证明是优选的：其丙交酯单元与乙交酯单元的比在约75比约25至约25比约75范围内。表述“丙交酯单元与乙交酯单元的比”始终意指聚合物中的单元的摩尔比。还可以使用不同类型的PLGA聚合物的混合物。可以使用任何类型的PLGA聚合物的混合物，例如，其中丙交酯单元与乙交酯单元的摩尔比和/或摩尔质量或固有粘度和/或丙交酯单元种类（D/L或L）和/或端基不同的聚合物混合物。可通过常规测试找到最适于具体用途的混合物。

PLGA聚合物的降解速率取决于PGA或PLA含量，其中PLGA共聚物降解速率通常短于PLA聚合物或PGA聚合物。因此，优选PLGA聚合物。最短的降解时间通过丙交酯与乙交酯的比为50：50的聚合物实现。由于乳酸单体中另外的甲基，PLA含量的增加阻碍了聚合物的水解，同时增加疏水性，这导致降解时间较长。而且，聚合物中PGA含量的增加或纯立体对映体L-乳酸的使用，与单体D-/L-乳酸相比，延长了聚合物降解时间——通过增加聚合物结晶度，因为水更容易扩散到无定形区域中。因此，这些区域比结晶区域更加迅速地降解。因此，聚合物结晶度在降解期间稳定地增加。因此，通过调节该比例，可以设置结晶度和降解时间为预定值。此外，可通过较短聚合物链和游离端基促进降解速率。游离端基，即，游离羟基和游离羧基，增加聚合物的亲水性，使得聚合物基质中的水及其内含物的扩散速率增加。此外，游离羧基通过降低基质内的pH值而催化聚合物水解。因此，具有游离端基的聚合物根据本发明被优选使用。

根据本发明，优选使用这样的PLGA聚合物：具有游离端基，其丙交酯单元与乙交酯单元的比为40：60至60：40，更优选约50：50，和/或其固有粘度小于0.6。当使用具有酯化端基的PLGA聚合物时，优选丙交酯单元与乙交酯单元的比为75：25的PLGA聚合物。

适当的PLGA聚合物可被购买，如resomer聚合物（可购自Evonik Industries AG，Essen，Germany），具体地，来自系列或系列的resomers。尤其特别适当的聚合物是，例如，502H、503H和504H或RG755S。下表1列举了优选聚合物的一些性质：

表1：所用聚合物的性质

*固有粘度（静脉；0.1%氯仿溶液，在25℃下）

**酸基数（电位滴定法），得自制造商信息。

***摩尔质量，通过GPC测量，和

****释放数据，源自Eliaz等的公开，[44[Eliaz，2000#257]。755S和503H的释放数据涉及白蛋白从牛血清的释放[44]，502H和504H的释放数据涉及胸腺DNA[45]从可注射的植入物（10%至20%PLGA（m/v）的四甘醇）的释放。

聚合物基质通过酯水解降解成生物相容性单体乳酸和乙醇酸，其随后通过克雷布斯循环被代谢成CO₂和水。PLGA植入物的降解模式基于本体侵蚀，其特征在于，水扩散进入聚合物基质快于聚合物降解。因此，这导致聚合物基质整个横截面的均匀质量损耗。降解过程可总体上被细分成三个部分：

1.水合：聚合物吸收水并膨胀，其中小部分酯键已被破坏。但是，质量损耗还未发生。

2.降解：平均摩尔质量显著降低。酯键断裂后产生的羧酸基团导致基质中pH值下降，因此导致酯断裂的自动催化。聚合物的机械强度和/或机械稳定性丧失。

3.溶液：在接近降解结束时，低分子量片段和寡聚物溶解在周围的介质中，并且溶解的聚合物片段进而被水解成游离羧酸。

降解时间决定被包封的大分子和纳米级载体材料的释放，因为，鉴于其尺寸，其主要通过基质侵蚀被释放，使得可以通过降解速率具体地控制释放速率。PLGA聚合物的降解时间可通过其组成和聚合物的摩尔质量来控制。在可购买的PLGA聚合物的情况下，固有粘度通常被显示成摩尔质量大小。

体系的粘弹性同样起作用，如图3和实施例所示。

对于本发明的施用体系而言至关重要的是，产生保持其机械强度和/或稳定性足够长时间以防止粘连并随后降解的高品质材料。当由本发明的施用体系形成的载体体系被加载活性剂时，另外需要活性剂以理想的释放动力学释放。

通过本发明的施用体系获得的膜的基质品质取决于所用聚合物、用于其溶液的溶剂、及其水溶解度。已发现，用于溶解PLGA聚合物的溶剂对用其生产的基质的品质具有相当的影响。因此，溶解在溶剂中的PLGA与水相组合后所产生的基质取决于溶剂的类型和用量，具体地取决于其亲水性。

另一方面，溶剂的选择还取决于所用聚合物类型。聚合物亲脂性越高，溶剂亲脂性必须越高。聚合物的亲脂性取决于其端基等等，因为具有游离酸基的PLGA比具有酯化端基的PLGA更具亲水性。

一方面，溶剂必须使选择的聚合物溶解至聚合物可喷射的程度，另一方面，溶剂在水中的溶解度必须足够高，以使两种组分喷射后迅速发生沉淀。适当溶剂选择的有用参数是logP值。

因为，如上所示，基质品质也通过溶剂根据聚合物摩尔质量而改变，本发明的进一步重要特征是溶剂。选择溶剂的重要参数是与水的混溶度。与水的混溶度越高，基质形成越快，但是，多孔性也增加。水混溶度越低，基质形成越慢，并且品质越高。

溶剂的水混溶度可通过logP值确定。

logP值表示辛醇/水分配系数，即，两相体系中1-辛醇和水溶剂的浓度比。logP值被限定如下：

$\log P=\log \frac{c_0^{s_i}}{c_{\mathrm{\&Omega;}}^{s_i}}=\log c_0^{s_i}-\log c_{\mathrm{\&Omega;}}^{s_i}.$

logP值的计算或确定本身是已知的。适于确定logP值的算法是XlogP3，如Cheng等所述（Cheng T.，Zhaoy，Lix，Lin F.，Xu Y.，Zhang X。et al.，Computation of Octanol-Water Partition Coefficients by Guiding an Additive Model withKnowledge.J.Chem.Inf.Model.2007；47：2140-2148）。以此方式计算的logP值对于亲脂性物质生成正值和对于亲水性物质生成负值。已发现，在本发明的体系中，可使用亲脂性不很高的物质，使得优选具有XlogP3负值或至少极小XlogP3正值的溶剂。

已证明这样的溶剂适于本发明的体系：其XlogP3值低于0.2，优选低于0，特别是在-0.2至-1.5的范围内，特别优选XlogP3值在-0.25和-1.0之间的溶剂。如果XlogP3值较高，则所用聚合物的亲脂性较高。

已发现，当溶剂logP低于0.2的聚合物溶液与水性组分混合并被喷射到施用位点上时，沉淀以可预先确定和再现的形式发生，这产生具有理想性质的聚合物膜。

所用聚合物的亲脂性越高，所用溶剂的亲脂性必须越高，并且其水混溶度必须越低。在溶剂或水中的聚合物溶解度之间的差异越大，对膜形成动力学的影响越大。因此，如果所用PLGA聚合物是具有酯化端基并因此具有较高亲脂性的PLGA聚合物，则所用溶剂应同样具有较高亲脂性。较高亲脂性的溶剂具有较差水混溶度，因此导致高基质品质。已发现，当聚合物和溶剂的体系接近溶解极限并且溶剂具有可能的最佳水混溶度时，获得最佳结果，使得在水相添加后，膜形成迅速且完全，其中高百分比的聚合物存在于基质中。

聚合物在溶剂中的溶解度同样具有影响。聚合物在溶剂中溶解越充分，稍后需要越多水从膜沉淀聚合物和形成膜。另一方面，溶解度必须使得足量聚合物可溶解在溶剂中。已发现，这样的溶剂适于形成高品质膜：对于所用的PLGA而言，其室温下的溶解度为至少5%（质量/体积）（m/v），优选5至60%，特别是溶解度10至30%。适当溶剂的选择应基于下列相关性：溶剂对于聚合物的溶解度随聚合物摩尔质量增加而减少。聚合物的亲脂性越高，即，聚合物酯化程度越高和/或聚合物链越长，溶剂的亲脂性必须越高。因此，当使用高亲脂性聚合物与高水溶性溶剂时，聚合物将仅以极小的程度溶解，而亲脂性较低的聚合物，例如，具有游离酸基和较低摩尔质量的聚合物，易溶于亲水性溶剂。另一方面，聚合物溶解越充分，则沉淀需要越多水。当选择溶解度为5至15%并且溶剂的XlogP3值在-0.3至-1.0的范围内的聚合物和溶剂时，可获得极好的结果。在这种组合下，聚合物在添加水时非常迅速地沉淀和形成高品质膜。XlogP3值在此范围内的溶剂对于本领域技术人员而言是已知的。

因此，高度适合的溶剂将组合良好的水混溶度与如下聚合物溶解度：在理想量的聚合物的情况下，溶剂中的溶解度接近施用温度——即，30至40℃——下的饱和极限。在任何情况下，室温下的溶解度必须足够高以形成稳定的溶液。

四甘醇，甘油缩甲醛和二甲基异山梨醇酯（DMI）已被发现特别适用。溶剂四氢糠醇聚乙二醇，也被称为四甘醇或糖原质(glycofurol)，是已长期胃肠外应用的溶剂。多达50%的浓度被应用，并且在此稀释液中，溶剂仅显示低毒性。

甘油缩甲醛是无嗅溶剂，具有低毒性，由1,3-二烷-5-醇和1,3-二氧戊环-4-甲醇的混合物组成。其是多种药物和化妆品的优良溶剂。特别在兽药中，其被用作注射溶剂。甘油缩甲醛是可购买的，例如，以和。0.27%的Ivumec^TM已被批准在猪皮下施用，并且通常以0.1mg/kg应用。

二甲基异山梨醇酯（DMI）已知用于局部施用。包含DMI的市售制剂是和。DMI被局部应用，作为渗透增强物质。已观察到低溶血活性。

已发现，通过本发明的施用体系形成的膜的膜品质越高，所用溶剂的水混溶度越高。实施例公开了确定膜品质的测试。图4显示多种PLGA聚合物和溶剂组合的膜品质。上述溶剂的水溶解度依下列顺序减少：甘油缩甲醛>DMI>四甘醇。因此，在多数情况下，甘油缩甲醛将是本发明施用体系的最优选溶剂，只要其能够溶解足够的聚合物。下表2提供一些测试溶剂的性质概况：

表2：一些溶剂的性质

*动力学粘度η在25℃下通过旋转粘度计（MRC100，Paar Physics）确定，

**XlogP3数据是计算值[32]

***溶解度数据得自Matschke等，2002的公开[33]。

通过本发明的喷射体系形成的基质的膜厚度对水扩散速率具有影响。例如，对于膜厚度为150至300μm的PLGA体系而言——其中水扩散速率被限制，可另外检测到表面侵蚀。与所用溶剂无关，在粘弹性测试中，测量基于502H的膜的约300μm膜层。但是，相反，较长链聚合物膜的膜厚度的增加类似于观察到的从DMI经由甘油缩甲醛至四甘醇的释放动力学。

本发明施用体系所用溶剂的进一步非常重要的特征是其生物相容性或组织耐受性。在本申请中，组织耐受性通过溶剂经过11小时的时间对代谢细胞存活力的影响来确定。确定方法在实施例中描述。发现LD₅₀值是毒性度量。考虑用于本发明施用体系的溶剂的LD₅₀值必须至少为1，优选至少10mg/ml。上述特别优选的溶剂满足这项要求。因此，已发现甘油缩甲醛特别适用。在6小时以下的温育时间下其LD₅₀值为约1g/ml。因此，甘油缩甲醛是本发明体系的特别优选溶剂。图5显示优选溶剂的LD₅₀值作为温育时间的函数。

在一个实施方式中，本发明的施用体系仅包括一种具有聚合物和溶剂的亲脂性组分，如上所述；和水，作为第二组分。如果其满足上述要求，则可以通过混合和喷射，利用这些组分原位生产可有效防止外科粘连的膜。

对于本发明至关重要的是，本发明的喷射体系包含亲脂性组分和水性组分，其相互分离直到喷射。组分可仅在喷射时或喷射前即刻或喷射期间混合。已发现，相对少量水的添加已导致聚合物沉淀。过早沉淀可干扰膜形成，并且喷射装置也可能由于聚合物沉积而堵塞。因此，混合应优选直接发生在喷射期间，例如，通过将各自量的两种组分供应到混合室中，然后直接在混合期间将其喷射。因此，混合和喷射应优选地基本上同时发生。

在进一步的实施方式中，提供还包括活性剂的施用体系。适当的活性剂是所有有效用于目标施用位点的物质。本发明的施用体系尤其有效用于释放核酸、蛋白质和肽。为此，可以直接释放蛋白质和肽以及其编码核酸或甚至其混合物。已发现，本发明的施用体系和所得膜释放其可以随后表达的形式的核酸。由于本发明的体系被提供用于防止粘连，优选纤溶蛋白和肽和/或将编码其的相应核酸用作活性剂。

活性剂可存在于处于溶解或分散状态的两种组分之一中。已发现，水相量过高可（消极地）影响形成膜的品质。因此，如果添加水溶解度不足够高以生成高浓度溶液的活性剂，则优选添加已经是沉淀形式的活性剂，例如，干燥形式。可分散在亲脂性组分中的小尺寸固体形式的冻干物或多聚复合物（polyplexes）特别适用。这具有进一步的优势：在其固体形式下，活性剂具有较高储存稳定性。

如上所述，特别是组织特异性纤溶酶原激活因子及其抑制剂在粘连的形成中具有影响。因此，根据本发明的一个实施方式，原位形成的“基因激活”膜通过喷射被局部施用，以治疗腹膜粘连。由于如上所述，在腹腔中手术后2至3周的时段内，永久性粘连可发生，并且由于假设这是由组织特异性纤溶酶原激活因子（tPA）与其抑制剂（PAI-1）之间的失衡触发的，根据本发明通过提供tPA和/或抑制PAI-1改变这种失衡。这是原位形成的膜进行的，该膜包括tPA和/或PAI-1抑制剂和/或编码其的核酸。已发现，当使用本发明的喷射体系时——该喷射体系包含编码tPA的质粒，在膜形成时，质粒被掺入膜基质，从中逐渐释放，并且至少两周升高生理环境中的tPA水平。喷射膜的生理环境中的tPA水平也可通过将PAI-1抑制剂引入该环境或通过二者组合而升高。在实施例和图10和11中，描述了通过这种膜获得的性质和结果。

为此，显示在细胞培养物分析中tPA编码质粒在本发明的基于甘油缩甲醛与504H的膜中的掺入可使tPA水平在16天的时间升高至2ng/ml。这相应于tPA浓度与对照相比增加4倍。由于在已进行过手术的组织和发炎组织中，tPA浓度可降至标准值的五分之一和更低，因此可以利用通过本发明的喷射体系生成的膜长时间实现治疗相关的tPA水平增加，其不可通过现有技术制剂实现。

此外发现，在应激和/或发炎组织中，抑制剂水平可增加至17倍，导致tPA水平显著降低。因此，tPA/PAI-1比可从正常状态的3.5变化至发炎组织的0.4。因此，为更有效控制在手术后发生的过程和更成功地抵抗粘连，本发明的喷射体系特别优选包括至少一种组织特异性纤溶酶原激活因子或其编码核酸和至少一种纤溶酶原激活因子抑制剂或其编码核酸的抑制剂。如实施例所示，可通过如下有效恢复tPA/PAI-1平衡：利用本发明的喷射体系生成膜，该膜导致tPA编码质粒DNA和抗PAI-1的siRNA的共转染。可显示，tPA编码质粒DNA和抗PAI-1的siRNA的这种共转染导致，在转染后48h，tPA/PAI-1比增加8.3倍，而质粒单独施用将仅导致4.5倍增加。因此，取决于理想的作用，本发明的喷射体系可包括组织特异性纤溶酶原激活因子，或至少一种PAI-1抑制剂，或二者的组合，和/或每种情况下相应的核酸。因此，本发明提供的体系允许对理想作用高度可变的控制。

在上述实施方式中，核酸可以是RNA、DNA、mRNA、siRNA、miRNA、piRNA、shRNA、反义核酸、适配体、核酶、催化DNA和/或其混合物。术语DNA包括全部适当形式的DNA，如cDNA、ssDNA、dsDNA等；术语RNA包括全部适当形式的RNA，如mRNA、siRNA、miRNA、piRNA、shRNA等。

核酸可以是线性或环状的，其可以是单链的或双链的。术语“核酸”还包括可编码相同或不同蛋白质或肽的核酸的混合物。所有编码预期蛋白或肽并且能够在理想位点使其表达的核酸形式均是适当的。本领域技术人员知道适当的核酸形式，因此能够选择最适当的核酸形式。核酸可来自任何来源，例如，来自生物或合成来源，来自基因库或基因集合，其可以是基因组或亚基因组DNA，得自细胞或微生物的RNA或合成生成的RNA，等。核酸可包括其扩增和表达所需的元件，如启动子、增强子、信号序列、核糖体结合位点、尾部等。

核酸可以是DNA或RNA，并且其可包括一个或多个基因或片段。核酸可以是自主复制序列或整合序列，其可以质粒、载体形式或其他本领域技术人员公知的形式存在。其可以是线性或环状的以及单链或双链的。细胞中的任何核酸活性在此是适当的。由于“裸”核酸不是非常稳定并且在细胞中迅速失活或分解，优选将核酸涂层，其中所谓多聚复合物是特别优选的实施方式。

为保护核酸，其可以所谓的多聚复合物的形式被应用。多聚复合物是被聚合物外壳包围的核酸分子。优选地，阳离子聚合物被用作外壳材料。已发现，阳离子带电颗粒可比中性或阴离子带电颗粒更容易被细胞摄取。但是，其也可促进更多非特异性吸附。关于包封作为活性剂的核酸，优选阳离子外壳材料，因为核酸可易被阳离子物质包封和保护。各种技术对于本领域技术人员而言是公知的。

外壳材料可以是天然存在的，合成的或阳离子型衍生的天然物质，如脂质或聚合物或寡聚物。天然寡聚物的实例是精胺。合成聚合物的实例是含氮的可生物降解聚合物，特别是具有可质子化的氮原子的那些。特别适当的是聚乙烯亚胺，具体地分支聚乙烯亚胺，其是可购买的。适当的是，例如，平均分子量为25kDa的分支聚乙烯亚胺，其是可购买的。已发现，这种聚合物与本发明的喷射体系的其他组分充分相容。还可以使用脂质，具体地阳离子或中性脂质，作为天然或任选地衍生的膜形成外壳材料。脂质可以多种变体获得，并且可用于例如形成脂质体。

当多聚复合物用作活性剂时，应以本身已知的方式调节外壳材料与核酸的比，使得核酸被充分保护，但仍可在释放后表达。如果没有足够的外壳材料，核酸将得不到充分保护。如果外壳材料量过高，这在一方面可导致耐受性问题，并且在另一方面可导致，在过高外壳材料量的情况下，核酸可不再被释放和/或不再被表达。在这两种情况下，转移效力均被降低。通过少量常规测试，本领域技术人员可找到对于具体情况最适当的比。已发现，基于重量，10：1至1：4范围内的外壳材料与核酸的比是特别适当的。特别优选的是4：1至1：4的外壳材料与核酸的比。当多聚复合物包含聚乙烯亚胺作为聚合物时，聚合物含量也可由聚合物氮含量与DNA磷酸含量的摩尔比（N/P）表示；优选地NP比处于1至10的范围，特别优选地4至8。

多聚复合物分子被设计，使得核酸在储存、运输、和直到施用期间得到保护，并且核酸被释放和表达在目标位点。在文献中，已于多种情况下描述适当的聚合物，本领域技术人员可从大量材料中选择最适当的材料。

自1989年的首次临床研究，已获得超过1400个临床研究中的利用核酸作为药物物质的经验。除逆转录病毒基因转移体系外，还主要使用腺病毒基因转移体系，一个很大的优势是这些体系的效力。因此，可显示出单个病毒颗粒的结合已足以感染目标细胞。关于免疫原性和潜在的突变，非病毒基因转移体系相对于病毒体系是安全的选择。参考非病毒基因治疗方法，已描述了裸核酸与物理方法如电穿孔的组合应用，以及纳米级复合物连同合成载体体系如阳离子聚合物的应用，其也被称为多聚复合物。关于多聚复合物生产和应用的信息可在例如Godbey WT,Mikos AG,,,Recent progress in gene delivery using non-viral transfer complexes”.(J Control Release,2001,72:115-125)的文章中找到；和关于阳离子脂质体（脂质复合物，lipoplexes）的信息可在Lee RJ,Huang L.,,Lipidicvector systems for gene transfer“(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1997;14:173-206)和Simoes S,Filipe A,Faneca H,Mano M,Penacho N,Duzgunes N,et al.,,Cationic liposomes for gene delivery“(Expert Opin Drug Deliv.2005,2:237-254)的文章中找到。复合体系基于下列原理：在生理条件下，带正电的核酸和带负电的载体材料自发地积累至纳米级颗粒（“自组装”）。

本发明的喷射体系提供新型且有前途的方法以实现长效基因表达。通过形成这样的膜——处于基因激活的储存体系的形式，其局部施用可导致在施用区域、在限定时间段内的恒定核酸水平——实现了有益的性质。因此，可以降低频繁用药和剂量，以防止不利的副作用，如转染其他组织，即，所谓“脱靶效应”，从而避免非生理学蛋白水平和核酸和载体材料为患者造成负担，和提高患者接受度。

如上所述，假设PA与PAI-1抑制剂的比对外科粘连形成和瘢痕形成具有影响。因此，在进一步的实施方式中，提供这样的喷射体系：包括PA和PAI-1抑制剂和/或其编码核酸的组合作为活性剂。在此，PA与PAI-1抑制剂的比处于5：1至1：5的范围内；当使用相应的核酸时，可以设置该比例，使得在表达后，发现目标位点的PA：PAI-1抑制剂的比为5：1至1：5。已发现，当应用这种组合时，可以特别有效地抑制外科粘连形成。

本发明的喷射体系的特征在于，在混合两种组分后，聚合物非常迅速地沉淀，形成膜，其中活性剂任选地被包含在一种或两种组分中，该组分被同时共同整合到膜中。因此，这两种组分——在使用前被储存在独立的容器中，以这样的方式被喷射：其喷射时或在喷射前即刻被混合，或其在混合的同时被喷射。因此，本发明的喷射体系的这两种组分被混合以施用。优选地，这两种独立的组分被供应至混合室以进行喷射，并且直接被从中喷射。优选用于喷射的是本身已知的装置，其中，在喷射阀激活后，各个剂从两个储存库被供应至混合室，并从此一起被喷射。以这种方式，混合直接在喷射施用装置中于喷射后进行，从而防止过早沉淀，过早沉淀可导致喷射喷嘴堵塞。在从独立的喷射施用装置相继喷射两种组分的情况下，不能生成高品质膜。对于本发明至关重要的是，这两种组分，在其施用前保持彼此分离，在喷射期间相互接触，使得，在喷雾碰撞后，通过聚合物沉淀形成的膜可沉降在目标位点处。适于混合/喷射之前保持分离的两种组分的喷射施用装置在现有技术中是已知的。适合根据本发明施用的已知装置显示在图8中，并且喷射套组可以购自Baxter公司。

可以控制两种组分的供应剂量。各个剂量取决于应用类型、组分类型和任选地活性剂。在施用后，两种组分应以下列比例（基于溶液体积/液体体积）混合：10：90至90：10，优选25：75至75：25，更优选40：60至60：40的比。用于生成膜的组分供应量取决于膜的理想尺寸和厚度。其可以本身已知的方式被调节。对于腹腔施用，已发现各组分0.5至5ml，优选0.7至3ml的量是适当的。

下列组合已被发现特别有利：

亲脂性组分：在甘油缩甲醛、四甘醇或DMI中的10%（m/v）PLGA溶液（H系列），

亲水性组分：注射用水，

活性剂：pDNA/l-PEI多聚复合物，作为冻干物溶解在亲水相中（掺入选择A），或通过均质器分散在亲脂性PLGA溶液中（掺入选择B）。

任选地，浓度为10%（m/v）的蔗糖作为冻干法的冷冻保护剂。

本发明的喷射体系被提供用于治疗应用。通过其生成的基质体系的施用区域是预防术后粘连，腹腔中术后粘连在手术后可发展成永久性粘连，其由组织特异性纤溶酶原激活因子与其抑制剂之间的失衡造成[56，64，65]。在此关键的是2周的时间框，包括手术后2至5天的急性期。包含tPA编码质粒作为活性剂的贮存体系特别适用。除药理学活性组分外，聚合物膜还构成另外的抗粘连屏障，抵抗粘连。例如，还可以通过内窥镜喷射本发明的喷射体系，例如腹腔中内窥镜干预的情况下。

本发明通过附图得到进一步示例。

附图显示本发明的实施方式和通过其获得的结果。

图1显示关于外科粘连的发病机理的示意图。

图2显示比较地显示选择的聚合物的膜品质图：A）PLGA50：50，H系列，B）PLGA75：25，S系列。其显示形成喷射膜的所用聚合物的百分比，而其余部分，作为可溶性部分，丢失在上清液中。数据以平均值±标准偏差（n=4）给出。统计学显著差异用星号标记（P<0.05（*），P<0.01（**））。

图3显示膜粘弹性测试的结果图：H系列的A）储存模量（G`），B）损耗模量（G``），在不同溶剂的情况下，在1Hz的频率下进行比较。

图4显示通过测试溶剂实现的膜品质：A）利用503H原位形成的膜；B）针对分配系数P绘制的膜品质。数据以平均值±标准偏差显示，n=4制剂。

图5比较显示测试溶剂的LD₅₀值：测试溶剂的LD₅₀作为间皮细胞温育时间的函数。在各情况下，代谢细胞存活力通过ATPlite Assay确定。

图6显示关于原位形成的膜的不同配方的释放动力学图：（A）RG502H，亲水相中的多聚复合物；（B）RG502H，亲脂性相中的多聚复合物；（C）504H，亲水相中的多聚复合物；（D）504H，亲脂性相中的多聚复合物。利用不同的聚合物溶液（DMI（●），四甘醇（○）和甘油缩甲醛（▼）），将冻干的多聚复合物掺入膜中，并分析pDNA的释放30天。数据以平均值±距平均值的标准偏差（n=3）给出。

图7显示利用不同冷冻保护剂的冻干l-PEI/pDNA多聚复合物对于肺细胞系的转染效力。在添加硫酸乙酰肝素（HS）下，通过琼脂糖凝胶电泳来分离DNA拓扑-冻干pDNA/l-PEI多聚复合物。为此目的，将多聚复合物重悬浮在注射用水（WfI）中。数据以平均值±标准偏差（（a）n=7，（b）n=4））显示。统计学显著差异由星号标记（P<0.05（*），P<0.01（**））标记。pCMV-Luc对照（C），尺寸标记（L），注射用水（WfI），（UT），均质器（H）。

图8显示生成原位形成的膜的实验设置。

图9显示发明的膜对于间皮细胞体外施用的结果图：在基于504H的膜在间皮细胞上施用后的荧光素酶基因表达。将质粒DNA/l-PEI多聚复合物掺入亲水相中，并经过29天的时间通过荧光素酶分析研究其表达。在背景校正后测量发射的光子（RLU）10s。结果以平均值±SEM（平均值的标准误差）（n=3）给出。

图10显示原位形成的膜对于间皮细胞体外施用的结果。（A）基于RG504H的膜的基质释放，和（B）用碘化丙啶（propidium iodide）染色后，掺入的质粒-DNA的荧光记录。将pCMV-tPA-IRES-Luc/l-PEI多聚复合物溶解在亲水相中，将喷射膜喷射在间皮细胞上，和经过29天通过ELISA确定tPA水平。结果以平均值±SEM（n=3）给出。

图11显示质粒DNA/siRNA对于间皮细胞的共转染：a）48h后Western Blot中的PAI-1和tPA检测，b）tPA/PAI-1比，作为时间的函数。利用l-PEI在N/P比为10（基于pDNA量）的情况下于HBS中制备包括pCMV-tPA-IRES-Luc（ptPA）或对照质粒（pUC）和不同siRNAs（PAI-1，EGFP）的多聚复合物。为进行比较，显示未处理细胞（UN）的表达。在不同时间通过WesternBlot确定上清液中的tPA-和PAI-1水平。

图12显示pCMV-tPA-IRES-Luc质粒的示意图。

图13显示l-PEI/pDNA多聚复合物在PBS中的稀释液系列。

图14显示人tPA抗原分析的标准曲线。

图15显示采用不同冷冻保护剂的粉末形式的多聚复合物的转染效力：冻干l-PEI/pDNA多聚复合物对于肺细胞系的转染效力，（A）采用不同冷冻保护剂（10%（m/v）蔗糖或甘露糖，4%（m/v）葡聚糖5000），B）在冻干多聚复合物的均质化后——采用10%（m/v）蔗糖作为冷冻保护剂。

本发明通过下列实施例被进一步示例，但不以任何方式受限于此：

实施例1

材料和方法

核酸

质粒pCMVLuc，可如[19]所述获得，其包含在CMV启动子控制下的萤火虫Photinuspyralis的荧光素酶基因（Luc），启动子来自巨细胞病毒。同样，在CMV启动子的控制下，构建体pMetLuc编码海洋桡足类Metridia longa的荧光素酶基因——分泌型荧光素酶[20]。

克隆构建体pCMV-tPA-IRES-Luc，并将其示意性地显示在图12中。除荧光素酶（Luc）和组织特异性纤溶酶原激活因子（tPA）的序列外，其还包括CMV启动子（CMV-IE，巨细胞病毒-立刻-早期）。

利用pIRES-Luc载体克隆pCMV-tPA-IRES-Luc质粒[21]。通过利用限制性内切酶MluI和FseI（New England Biolabs Inc.，USA），在CMV启动子的控制下，将编码组织特异性纤溶酶原激活因子（tPA）的序列克隆到该载体中。因此，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增质粒pCMV-tPA的序列（***物）[22]。除荧光素酶基因外，pIRES-Luc载体还包含内部核糖体进入位点（IRES），该内部核糖体进入位点使得能够相互独立地翻译转录物。

pUC21载体（Invitrogen，Germany），其无表达盒并且仅包含细菌骨架，用作对照质粒。

合成下列寡核苷酸：使用针对纤溶酶原激活因子抑制剂1的siRNA（PAI-1，5′-GGAACAAGGAUGAGAUCAG[4，23]-3′），和作为对照，使用针对EGFP的siRNA（5′-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU[dT][dT]-3′）。将冻干的样品以20μM溶解在重悬浮缓冲液（Qiagen）中和对于释放研究溶解在100μM原液中，在90℃下温育1.5min，在37℃下轻轻摇动1h，并在-20℃下以等份储存。

聚乙烯亚胺

根据Plank等[24]的配方，合成摩尔质量为22kDa的线性聚乙烯亚胺。类似于该配方，通过丙酸酰胺聚(2-乙基-2-唑啉)50Da的酸性水解获得线性PEI，其中释放的丙酸被连续作为共沸混合物从合成批次中抽出，使得反应可几乎完全按常规发展。随后，将游离碱通过氢氧化钠在pH12下沉淀，洗涤并冻干。将冻干的l-PEI储存在4℃下，并且如需，溶解在蒸馏水中，调节至7.4的pH值，透析（ZelluTrans透析膜T2，MWCO8-10kDa），并进行除菌过滤。

利用硫酸铜测试，在285nm下，于分光光度计（Ultrospec3100Pro）上，光度法定量PEI溶液[25]。已知浓度的l-PEI批次用作参考。通过¹H-NMR波普（Bruker250MHz，Karlsruhe）检测合成产物的纯度。利用多角度激光散射检测器（GPC-MALLS），通过凝胶渗透色谱法，测量摩尔质量，并显示出20-22kDa的摩尔质量。

PLGA聚合物

下列聚合物，来自Boehringer Ingelheim公司，Germany，用于膜的制备：

·502，503和504H

·752，755S

细胞系

使用ATCC，Germany（CRL-9444）的胸膜间皮细胞（人），在短Met5A中。将细胞系在37℃、5%CO₂和100%湿度下于M199（Gibco-BRL，Great Britain）和MCDB105（Sigma-Aldrich，Germany）的1：2混合物中培养。除10%胎牛血清（PPA Laboratories，Austria）外，还将表皮生长因子（5ng/ml，Sigma-Aldrich，Germany）和氢化可的松（400ng/ml，Sigma-Aldrich，Germany）加入培养基[26]。此外，将在约80%会合的细胞传代，并用于多达20代的测试。

多聚复合物的制备

复合物的形成通过静电结合力自发地进行。形成的多聚复合物的性质基本上取决于培养基的离子强度、所用聚合物和N/P比。后者表示聚合物结构的质子化氮原子（N）与核酸中的带负电磷原子（P）的摩尔比。为获得小型单分散性颗粒，等体积的具有较低电荷密度的溶液——核酸溶液，用移液管移入具有较高电荷密度的溶液——聚合物溶液，并通过移液管添加和去除进行混合（5至8次）。随后，将溶液在室温（RT）下温育20分钟，然后进行进一步测试。注射用水（siRNA，质粒DNA冻干物）和HBS pH7.4（质粒-DNA液体）用作介质。

粉末形式的多聚复合物的制备和表征

以10的N/P比利用pCMVLuc和l-PEI在注射用水中制备多聚复合物，如上所述。为测试不同的冷冻保护物质，将多聚复合物在温育期后用20%（m/v）蔗糖溶液、20%（m/v）甘露糖溶液或4%（m/v）葡聚糖5,000溶液1：2稀释，混合，并等分。然后可将等份在液氮中迅速冷冻，并在冷冻干燥器的最大功率下冻干约24h。将冻干物在各种介质中重悬浮至0.02μg/μl的最终浓度（相等的初始浓度），并对96孔板中的BEAS-2B细胞进行转染，其方式类似于下文所述。

在10min的温育时间后，添加粉末形式的蔗糖，并将复合物再温育10min，其中在添加蔗糖之前和之后通过PCS控制颗粒尺寸。在冻干后，可在带杵研钵中均质化粉末，随后利用均质器、带有玻璃杵圆柱形玻璃容器（Schütt Labortechnik，Germany）、或通过（水平3，14sec，Ika Labortechnik，Germany），将其悬浮于PLGA溶液中。可选地，将粉末直接重悬浮在注射用水中或在研钵中均质化后重悬浮在注射用水中。将冻干物在各个介质中重悬浮至0.02μg/μl的最终浓度。

确定颗粒尺寸和ζ电位

通过在具有600μl多聚复合物的双蒸水溶液（0.02μg/μl pDNA）的半微型比色皿中的光子相关光谱，确定多聚复合物的流体动力学截面，在具有1.6ml多聚复合物溶液（分别为0.02和0.1μg/μl pDNA）的大比色皿中通过电泳光散射的ζ电位。应用下列设置：5次测量（尺寸测量），每个样品每10个周期5次运行（ζ电位）；水粘度（0.89cP）和/或HBS（1.14cP）；折射率1.33；介电常数78.5；温度25℃。根据Smoluchowski计算ζ电位。在标准曲线的基础上进行尺寸评价。通过尺寸为92nm的聚苯乙烯橡胶颗粒（Duke Scientific Cooperation，CA，USA）和带电+50mV的ζ电位参考Bl-LC-ZRZ（Laborchemie，Vienna，Austria），定期检查设备。

琼脂糖凝胶电泳

利用琼脂糖凝胶电泳可以确定核酸（质粒DNA，mRNA）在多聚复合物中的复合程度。因此，如上所述，与6倍浓缩的负载缓冲液组合，制备多聚复合物，并将100ng pDNA分别施加于含有溴化乙锭（10μg/100μl）的0.8%琼脂糖凝胶。相应的尺寸标记用作参考。在1×TAE缓冲液中于125V下进行电泳约1.5h。随后，在UV光（360nm）下检测核酸带，并通过凝胶凝胶相机拍摄。

在琼脂糖凝胶中，可基于凝胶中游离核酸的存在与留在凝胶袋（gel pocket）中的多聚复合物识别不完全复合。进一步，可以从凝胶袋中的信号强度得出关于缩合程度的结论。下列适用：带越弱，通过阳离子聚合物缩合的核酸越多。通过添加聚阴离子（0.1μg硫酸乙酰肝素（HS）/μg pDNA，温育时间45min），从复合物移去核酸，并且可以检查核酸完整度（拓扑结构，降解）。

实施例2

原位形成的膜的表征

根据生物材料和溶剂确定膜品质

为能够根据所用溶剂和聚合物类型进一步表征膜形成，在皮氏培养皿中进行喷射测试。为此，在各溶剂中制备10%（m/v）聚合物溶液，并在1.5bar下分别喷射1ml聚合物溶液（注射器1）和1ml注射用水（注射器2）。5min的等待时间意味着允许基质完全形成。为进行基质的视觉检查，将水相用亮蓝G染色，并将与喷射表面的距离至设置为11cm。无需固定进行进一步测试，因为由此能够获得更均质的膜。结果显示在图4中。

为能够更好地评价基质品质，将上清液去除，并在真空体系（Speed-Vac，DieterPiatkowski，Germany）中干燥，直到重量恒定。类似地，将基质在冷冻干燥器（Lyovac GT2，LH Leybold，Germany）中干燥，直到重量恒定。然后能够基于聚合物总用量确定上清液中（损耗）和沉淀中（基质品质）的聚合物含量。

确定溶剂的组织耐受性

通过基于ATP的分析（ATPlite，Perkin Elmer）确定溶剂的细胞毒性。在分析前24h将细胞接种于96孔板中，在分析前即刻去除介质，用PBS洗涤细胞一次，并添加50μl含血清介质，其中添加抗生素（青霉素/链霉素0.1%（v/v）；庆大霉素0.5%（v/v），Gibco-BRL，GreatBritain）。然后，添加50μl在注射用水中稀释的每种不同溶剂浓度（16-500μg/μl），并在37℃、5%CO₂和100%湿度下温育不同长度的时间（15、30、60、221、360和640min）。在温育期后，将介质吸出，用PBS洗涤细胞一次，每孔添加50μl PBS，并根据制造商的说明确定细胞存活力。在板读取器（Wallac Victor2/1420Multilabel Counter，PerkinElmer Inc.，USA）中测量发光度，其中未处理细胞（50μl注射用水）的发光度用作100%存活力参考值。对于各时间点，针对测量的细胞存活力（平均值±标准偏差，来自n=4运行）绘制溶剂浓度，并采用非线性标准函数：

y=min+[(max-min)/(1+(x/EC50)^{Hill斜率(Hillslope)})]

该函数对于全部溶剂均显示出良好的调节：四甘醇（R2=0.9181-0.9900），甘油缩甲醛（R2=0.9268-0.9945），二甲基异山梨醇酯（R2=0.9647-0.9894）。LD₅₀值得自所绘制的回归曲线的估测值。其是可测得细胞存活力仍为50%所处的浓度。

原位形成的膜的粘弹性

为了解基质的粘弹性，进行流变学测试。因此，将膜喷射在旋转粘度计（PhysicaMCR301）的板上，并在动态剪切测试中根据所用溶剂测试生物材料（RG504H和502H）。在此，将具有限定振幅和频率的谐振剪切应力施加于样品，并确定所得的剪切变形——其通过两个响应参数表征，响应振幅和响应频率，其也被称为相移。两个响应参数均可通过数学方法转换成储存模量G`和损耗模量G``，其中储存模量表征引入的动能和/或变形能中的储存份额，因此是可重复使用的份额（弹性份额）；而损耗模量是由于振动以热形式释放的能量的度量，因此是失去的份额（摩擦份额）。

确定释放动力学的测试

在37℃下，于可封闭的皮氏培养皿（皮氏培养皿，无吸收剂50×9mm，PAll）中，进行确定释放动力学的测试，其中在温育箱中连续摇动。因此，通过注射用水将样品如上所述喷射。之前将冻干的l-PEI/pCMVLuc复合物（N/P比10，10%蔗糖，25μg pDNA/制剂）以均质化形式（研钵和杵）分散在PLGA溶液中，或重悬浮于水相中。注射用水用作对照。在喷射后，等待5min，将其去除上清液（0h值）并添加1ml PBS。然后定期完全交换上清液，其中样品储存在-20℃下，直到分析。

通过光度法定量从原位形成的基质释放的质粒DNA。为此目的，在测量前用氯仿萃取样品（1ml，400g，RT，10min）以分离将会干扰光度法定量的PLGA降解产物[27]。随后通过在260nm下通过光度法测量样品（Nanodrop-1000，PEQLAB Biotech，Germany）。在预备阶段，在注射用水中生成l-PEI/pDNA多聚复合物（pDNA浓度100μg/ml），并在5个单独天在260nm下确定用PBS稀释的逐级稀释液的标准系列，然后在此基础上可以计算复合质粒DNA的释放浓度。结果显示在图13中。作为对照，分析未负载膜（背景校正），通过在水密度基础上称量样品来考虑少量体积偏差。

实施例3

体外分析

转染

为进行体外转染研究，在转染前24h每孔接种90,000至120,000个细胞（24孔板）。仅将到第20代的细胞用于转染。这导致转染当天约70%的会合。在转染前即刻，去除介质，将细胞用PBS洗涤一次，并添加200μl（24孔板）无血清介质。随后，将50μl多聚复合物——相应于1μg的质粒DNA量（24孔板）——加入介质。在37℃、5%CO₂和100%湿度下4h温育期后，去除多聚复合物，将细胞再次用PBS洗涤一次，并更换为含血清介质，其中添加抗生素（青霉素/链霉素0.1%（v/v），庆大霉素0.5%（v/v），Gibco-BRL，Great Britain）。

喷射测试的实现

如上所述配制L-PEI/质粒DNA多聚复合物（N/P比10，100μg pDNA/制剂），将其利用10%蔗糖冻干，并通过研钵和杵使其均质化，使得其可按重量被给予，或者被分散在之前经过除菌过滤的PLGA溶液中，或重悬浮于水相中（注射用水）。无添加剂的注射用水用作阴性对照。pMetLuc和pCMV-tPA-IRES-Luc以等量应用，作为质粒DNA。

测试前3天，将Met5A细胞接种于具有聚对苯二甲酸乙二酯-（PET）膜的悬挂***物（1μm PET Millicell）上，其允许通过光学显微镜控制细胞。每个提供1.5ml细胞培养基，使***物在其中平衡2min，随后将每孔250,000个细胞接种于1.5ml培养基（介质）中的膜上。在测试前，去除培养基，用PBS洗涤一次，并将样品喷射到细胞上，如上所述。初始，每日进行取样，之后每二至三日取样，并完全更换培养基。将样品直接置于冰上，并储存在-80℃下，直到分析确定。

通过荧光素酶活性测量结果确定转染效力

为通过利用编码报告基因荧光素酶的pCMVLuc质粒分析基因转移效力，在转染后24h通过如下测量荧光素酶活性：用PBS洗涤细胞一次，每孔添加100μl1×细胞裂解缓冲液（25mM Tris/HCl pH7.8，0.01%Triton-X100），并在RT下10min温育时间后，将其摇动60sec。随后，可以自动添加100μl荧光素底物（470μM D-荧光素，270μM辅酶，33.3mM DTT，530μMATP，1.07mM（MgCO₃）₄Mg₂×5H₂O，2.67mM MgSO₄，0.1mM EDTA0.1mM，20mM tricin）至50μl的等份，和在板读取器（Wallac Victor²/1420Multilabel Counter，PerkinElmer Inc.，USA）中测量5sec时间的发光。在添加底物前，同样确定5sec时间的背景。将以发射光子（相对光单位，RLU）测量的荧光素酶活性在背景校正10sec的时间后并且基于细胞质量的总蛋白量整合。总蛋白之前已通过标准蛋白分析（根据Biorad的方法）被确定。

通过Metridia荧光素酶的表达确定转染效力

第一次体外喷射测试利用l-PEI/pMetLuc和l-PEI/pIRES-Luc-tPA多聚复合物的混合物进行。pMetLuc质粒编码细胞分泌的荧光素酶，Metridia荧光素酶，因此能够通过样品上清液中的酶表达测量基因转移效力。荧光素酶催化荧光素——在本案中为腔肠素——的氧化脱羧，同时发射波长482nm的光。在选择的取样时间，通过Ready-To-GlowAutomation Kit（Clontech，A Takara Bio Company，France）分析样品——通过将其在冰上解冻，和根据制造商的说明在板读取器（Wallac Victor²/1420Multilabel Counter，PerkinElmer Inc.，USA）中测量5sec时间的发光而不用先前稀释。在添加底物前，同样确定5sec时间的背景，使得荧光素酶活性（RLU值）可在背景校正后被整合10sec的时间，并且各个阴性对照可从该值中被减去。未处理细胞充当团注给予（注射用水中全pDNA量的单次给予）的阴性对照，并且未负载膜用作基质体系的阴性对照。

通过ELISA确定组织纤溶酶原总浓度

在选择的样品中，除确定荧光素酶活性外，还通过ELISA（Human tPATotalAntigenassays，Innovative Research，Dunn Labortechnik GmbH，Germany）确定细胞上清液中的组织纤溶酶原总浓度。所用分析不仅检测游离且因此具有活性的tPA，还检测其结合于抑制剂的潜在形式。由于上清液得自细胞培养物，以与所用细胞的细胞培养基样品类似的方式稀释标准品——无FCS的情况下。阳性对照（团注给予）稀释如下：1：50（48h，9d），1：10（16，23和29d）。将来自内室的样品补足（30μl样品加至100μl），而在不稀释的情况下分析来自外室的样品。分析根据制造商的说明进行，并且在板读取器（Wallac Victor²/1420Multilabel Counter，PerkinElmer Inc.，USA）中测量450nm下、0.1sec时间的吸光度。标准曲线显示在图14中。阴性对照的使用如上所述。

荧光显微图像

在喷射测试完成后，去除培养基，并将留在基质中的质粒DNA用碘化丙啶染色。为此，在RT下于1：10的PBS稀释液中温育基质与碘化丙啶10min，在图片拍摄前再次用PBS洗涤，并利用落射荧光显微镜（Axiovert135，Carl Zeiss，Jena，10x透镜）拍摄图片。碘化丙啶的激励在470±20nm下进行，而发射在540±25nm下检测。利用软件Axiovision LE4.5进行评价，并且在明场（Brightfield）处利用Alexa560nm过滤器进行分析。

实施例4

siRNA和质粒DNA的共转染和通过蛋白质印迹确定tPA/PAI-1比

如上在24孔板中进行转染，但有若干区别特征。在每种情况下，使用750ng质粒DNA和30pmol siRNA——与l-PEI以N/P比为10进行复合（基于质粒DNA量）。在6h后更换培养基。在转染后，通过蛋白质印迹分析蛋白质，即，组织特异性纤溶酶原激活因子和类型1纤溶酶原激活因子抑制剂（PAI-1）。由于蛋白质是分泌型蛋白质，其可在细胞上清液中被检测到，使得在不同的时间点去除20μl各细胞上清液，将每种制备物的样品（n=3）合并，并在14.000rcf和4℃下离心10min，以分离死亡细胞。将样品始终储存在冰上，并在-20℃下冷冻，直到最终分析。

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）使蛋白质根据其摩尔质量被分离。为破坏蛋白质的二级和三级结构，制备物（3.75μl样品，15μl4×负载缓冲液（130mM Tris/HClpH7.4，20%甘氨酸，10%SDS，0.06%溴酚蓝，4%DTT）添加60μl注射用水），之前已在95℃下变性5min。将20μl各制备物通过电泳在7.5%Tris-HCl凝胶（Bio-Rad Laboratories GmbH，Germany）上分离，并电转移（1h，200mA，转印缓冲液）至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。在印迹后，切割膜，用于与各种第一抗体一起温育，在50Da（尺寸标准，精确值加蛋白质标准）下，并在RT、伴有轻轻摇动的情况下，在阻断缓冲液（5%奶粉，在20mM Tris/HCl pH7.4，137mM NaCl，0.1%Tween20中）中阻断非特异性蛋白结合位点1h。与第一抗体的温育在4℃、伴有轻轻摇动的情况下过夜进行（小鼠抗-α-肌动蛋白1：15,000Chemicon，Germany；小鼠抗-huPAI-1单克隆1：200American Diagnostics，Germany；鼠抗-hutPA单克隆1：400Calbiochem，Germany，在1：10的稀释阻断缓冲液中）。关于检测，应用在1：10,000稀释液（tPA，PAI-1）或1：20,000稀释液（肌动蛋白）中的第二抗体（结合的山羊-抗-小鼠HRP，Bio-Rad Laboratories，Germany），并将膜在RT、伴有轻轻摇动的情况下温育1.5h。随后，可通过ECL化学发光（Amersham Bioscience，USA）检测膜（Amersham Hyperfilm ECL，GE Healthcare，Germany）上的标记蛋白质，并通过Image J Basics Version1.38进行定量分析。基于未处理细胞的肌动蛋白带使值标准化。

统计学评价

除非另外说明，结果以平均值±标准偏差给出。借助于非配对t检验计算统计学显著差异。假设统计学显著性分别处于α=0.05（*）或α=0.01（**）。

适当溶剂选择的相关参数是i）药物适用度，ii）良好组织耐受度，iii）水混溶度，和iv）聚合物在溶剂中的溶解度。基于这些参数，选择一些溶剂用于进一步筛选。

广泛用于施用可注射储存体系的溶剂是四甘醇（四氢糠醇聚乙二醇），也被称为糖原质[28，29]。自六十年代以来，四甘醇就已经以多达50%（v/v）的浓度被用作胃肠外溶剂（静脉，肌肉），并且在此稀释度下仅显示低毒性[30]。

甘油缩甲醛是无味溶剂，同样具有低毒性，由1,3-二烷-5-醇和1,3-二氧戊环-4-甲醇的混合物组成[30]。其是多种药物和化妆品的优良溶剂。近来，其主要用于兽药，作为注射溶剂。例如，Ivomec^TM0.27%被批准用于猪的皮下施用，并且以0.1ml/kg应用[31]。

关于二甲基异山梨醇酯（DMI）和乳酸乙酯，几乎没有任何研究建立在溶剂的相容性上。乳酸乙酯被用作类固醇制剂的胃肠外适用载体，并且不考虑其GRAS数，被认为具有与麻醉剂相关的毒性和轻微溶血活性。DMI主要被局部地用作渗透增强剂，其同样被观察到轻微溶血活性[30，34]。此外，Matschke等的研究可显示，甘油酯具有良好的耐受性，是PLGA/PLA聚合物的适当溶剂[33]。为此，测试三乙酰甘油酯，具有低毒性的短链甘油三酯[35，36]，其此前已被描述，作为替代NMP和DMSO的替代选择，用于原位形成的延长释放的制剂[29，37-39]。

根据所用溶剂确定膜品质

形成原位形成的储存体系的重要前提条件是聚合物在溶剂中的溶解度。在文献中，基于PLGA假设原位形成体系的溶解度为至少10%（m/v）[40]。不同PLGA聚合物在典型溶剂如NMP和DMSO中以及在乳酸乙酯中的溶解度数据已被收集[41]。各研究显示，聚合物的溶解度随摩尔质量增加而减少。此外，原位沉淀所需的水量与聚合物在所用溶剂中的溶解度有关。聚合物在所用溶剂中的溶解度越好，形成储存基质所需的水越多。相反，需要的水量随聚合物含量增加而减少。

第一制剂和溶解度测试利用模型聚合物RG503H进行。为了更好可视化，水相用蓝色染料亮蓝进行染色。对于全部测试溶剂，可制备10%（m/v）聚合物溶液。但是膜，关于稳定性，均质性和水相在基质中的掺入，已经视觉地显示出清楚的差异。结果在显示在图4中。可见，在三乙酰甘油酯作为溶剂的情况下，不能够实现均质膜，相反形成清楚可见的W/O乳液。其他溶剂全部导致膜形成，其中水相的掺入显著不同。基于基质染色，水相的掺入依下列次序减少：三乙酰甘油酯≤乳酸乙酯<<四甘醇<甘油缩甲醛～DMI。

如果利用各个溶剂的LogP值比较图4中水相在聚合物基质中的掺入，就会清楚存在膜品质与所用溶剂的水溶解度的相关性，其由聚合物在上清液中的低损耗表征。必须假设三乙酰甘油酯和乳酸乙酯，作为亲脂性溶剂（XlogP>0），其水混溶度低于另一溶剂，因此可解释基质的不良膜品质。因此，对于极具亲脂性的PLGA聚合物的溶液将仅考虑这些溶剂。可能地，溶剂混合物更加适合。虽然在利用三乙酰甘油的测试设置的情况下不能生成喷射膜，但乳酸乙酯导致相当不均质的多孔膜结构，其中仅可掺入极少量染料。相反，当使用甘油缩甲醛、DMI或四甘醇时，形成原位膜。因此，如果可以，优选XlogP值为小于0的溶剂。

为能够更好地评价膜品质，在喷射测试中通过回称（backweighing）干燥基质来定量上清液中（损耗）和沉淀中（植入物）的聚合物量。当针对基质品质绘制溶剂分配系数P时，如图4B所示，发现膜品质是溶剂水混溶度的线性函数。图表清楚地显示，基质形成可随溶剂水混溶度增加而提高。在<0.25的P值下，约80%的聚合物用量被掺入基质。

关于进一步测试，测试与溶剂甘油缩甲醛、DMI和四甘醇组合的不同聚合物。三乙酰甘油酯由于不良膜形成未被进一步研究，乳酸乙酯由于不稳定和多孔的不均质膜结构并且由于其强溶血活性的未被进一步研究。

溶剂的组织耐受性

此外，研究11小时时间段的溶剂对代谢细胞存活力的影响。代谢细胞存活力通过细胞ATP值来确定，细胞ATP值是存活力的度量。在物质具有急性毒性的情况下，该值迅速下降，因此能够鉴定溶剂的组织耐受性。图5显示所有测试溶剂的由测试计算的LD₅₀值，作为温育时间的函数。

溶剂的耐受性依下列次序减少：甘油缩甲醛>>DMI>四甘醇。在LD₅₀值为约1g/ml的情况下，在小于6h的温育时间下，甘油缩甲醛显示出测试溶剂中的最低毒性。与DMI和四甘醇相比，这表明耐受性在测试结束时分别升高220倍和400倍。

实施例5

生物材料分析

分析的生物材料是乳酸和乙醇酸的可生物降解共聚物，聚(D,L-乳酸-共聚-乙醇酸)（PLGA）聚合物，来自Boehringer Ingelheim（商品名），其已被FDA批准用于胃肠外施用。

基质品质与选择的聚合物的相关性

如上所述，可掺入膜的聚合物含量百分比根据所用溶剂的水溶解度而改变。类似地，将要更详细地利用不同聚合物研究基质品质。由于关于测试聚合物，四甘醇不可被蒸发，因此没有该溶剂的数据。图2显示具有如下组成的聚合物的结果：（a）PLA/PGA50：50，具有游离酸基（H系列）；和（b）PLA/PGA75：25，具有酯化端基（S系列）。由于其较高乳酸含量和酯化端基，后者比H系列更具亲脂性。

图表示例，在聚合物摩尔质量较高的情况下，两系列中均有较大量聚合物可被掺入基质。该效果在H系列中对于DMI是显著的，并且在S系列中对于两种溶剂均是显著的。当使用甘油缩甲醛和755S时，几乎100%的聚合物用量形成基质（97.6±0.6%）。

聚合物系列与测试溶剂组合的比较显示，与H系列相比并且与两聚合物系列中的DMI相比，甘油缩甲醛与S系列的聚合物用量损耗降低20%。这些结果可再一次通过两种溶剂的不同水混溶度来解释，其导致聚合物在溶剂中的不同溶解度，并且对膜形成的动力学具有显著影响。虽然两系列均可易溶于DMI，但S系列与H系列相比难溶于甘油缩甲醛。后者显示出强烈的膨胀表现。因此，必须假设，在甘油缩甲醛中的S系列构成接近于溶解极限的体系。结合甘油缩甲醛的良好水混溶度，这导致迅速且完全的膜形成。

原位形成的膜的粘弹性

在动态剪切测试中，分析膜的粘弹性。为此，将具有限定振幅和频率的振动剪切应力施加于样品，并确定所得的剪切变形，其同样通过振幅和频率表征——也被称为相移。这两种响应参数可随后通过数学方法转换成储存模量G`和损耗模量G``，其中储存模量表征引入的动力学或变形能量中的储存份额，因此是可重复使用的份额（弹性份额），而损耗模量是由于振动以热形式释放的能量的度量，因此构成失去的份额（粘性份额）。在图3中，H系列的不同膜的两模量均显示在1Hz的激励频率处。

当相互比较两种膜的弹性和粘性份额时，得到不同溶剂相比之下不同的粘弹性灵敏度。虽然在502H膜的情况下，粘弹性可通过选择适当的溶剂（最大因数：分别为29（G`）和22（G``））而被相当宽泛地调节，但504H膜显示出流变学表现，而与所用溶剂无关。后者显示出可匹敌肌肉纤维（8至17kPa）的2至4kPa的机械强度[46]，并且具有主要以弹性为主的损耗因数（G`/G``）>1，使得在测试中这些膜的表现类似于固体。唯一的例外是DMI，其原位膜以粘性为主，其损耗因数为0.85。厚度>500μm的这些膜与502H膜相比相对较厚（DMI：500μm，甘油缩甲醛：600μm，四甘醇：800μm）。后者在流变仪的板上蔓延，并显示出仅300μm的厚度，而与所用溶剂无关。

基于502H的膜的损耗因数全部<1，并显示出凝胶样表现，溶剂之间的显著强度差异显而易见。仅在四甘醇的情况下，可实现膜强度可匹敌504H，其损耗因数为0.79。强度分别为130和900Pa的DMI和甘油缩甲醛甚至不是大致相当的，而且显示出显著粘性为主的表现（损耗因数>0.5）。

实施例6

原位形成的膜的制剂

基于来自已经进行的喷射测试的经验，研发了这样的制剂：包括i）PLGA聚合物，溶解于已用过的三种溶剂中的一种中，ii）水相，和iii）质粒DNA，作为模型活性剂。在理论上，“裸露”和复合形式的质粒DNA可被掺入基质。但是，由于“裸露”质粒DNA仅相当低效地转染细胞，在嵌入膜前将质粒DNA与l-PEI复合（N/P比10），并作为纳米级多聚复合物掺入基质。通过如此，其还可防止基质内pH下降，pH下降发生在聚合物结构降解期间——通过聚合物单体释放在基质中，并且通常构成敏感性大分子的问题[47]。

多聚复合物可如下被掺入基质——溶解在水相中[44]或分散在PLGA溶液中[28，45]。但是，在利用PLGA/四甘醇体系作为实例的初步测试中已发现，直接添加少量水（约5%）可引起聚合物沉淀。因此，在喷射膜高负载的情况下，需要使用高浓度质粒DNA溶液，但是，高浓度质粒DNA溶液具有低稳定性并且容易形成聚集物。因此，类似于蛋白质制剂[28，45]在PLGA溶液中分散作为冻干物的多聚复合物或在使用前将其重悬浮在水相中是有利的。通常，制剂组成如下：

1)亲脂相（1ml）：在甘油缩甲醛、四甘醇或DMI中的10%（m/v）PLGA聚合物（502H，504H）

2)亲水相（1ml）：注射用水

3)活性剂：重悬浮在亲脂性或亲水相中的冻干多聚复合物

粉末形式的多聚复合物制剂

在制药行业中，冻干是在储存期间稳定制剂的标准方法之一。通过将分子嵌入佐剂基质中，可在干燥期间稳定制剂。取决于干燥相，可使用不同的保护剂。因此，冷冻保护剂防止溶液在冷冻过程中结晶。体系固化成过冷熔体，而没有完全相分离（固化液体，玻璃）。相反，冻干保护剂提供在冷冻过程的进一步进展中的保护。其在氢桥的形成下取代活性剂与水的键。

多聚复合物也可在添加冷冻保护剂和冻干保护剂下被冻干，使得可防止重悬浮后的聚集物形成[48，49]。作为冻干物，多聚复合物可被更好地储存[48]，并且多达1mg/ml的质粒DNA浓度的溶液浓度变得可能[50]。糖，如蔗糖或海藻糖，充当冻干保护剂和冷冻保护剂，并且已被发现适于稳定多聚复合物[48，49]。与其相似的水溶性物质可进一步促进大分子活性剂从原位形成的基于PLGA膜释放。在基质形成期间，水填充的孔由于这些物质溶解而产生，通过该孔活性剂可随后从基质扩散。关于基质高负载的类似效应被描述过[27，33]。

测试在标准基础上使用的浓度的不同糖[48，49]。将基于l-PEI的多聚复合物在冻干后重悬浮于注射用水中，此前不进行均质化，并且测试其对人支气管上皮细胞的转染效力。在与二糖蔗糖一起应用的各浓度下实现良好的转染率，其效力与新制多聚复合物相比增加10倍。结果显示在图15中。相当的值已经由Talsma等[48]描述过。可预期可导致颗粒在细胞中的掺入增加的渗透效应仅2倍浓度以上[50]。但是，颗粒尺寸测量显示，颗粒尺寸在冻干后略微增加。新制的颗粒的颗粒尺寸为～100nm，而取决于所用的分散介质，颗粒在冻干后在PI<0.2下生长至200-300nm。

为能够施用粉末形式的多聚复合物和将其掺入制剂，应将其在冻干后在研钵中均质化和通过Ultra-Turrax（UT）或玻璃均质器（H）分散在PLGA溶液中。通过转染测试和琼脂糖凝胶电泳分析多聚复合物在均质化后的稳定性和随后在注射用水中的重悬浮。对肺细胞系的测试结果显示均质化不改变转染效力（图15B）。添加硫酸乙酰肝素下的质粒DNA拓扑对照同样没有显示出注射用水中冻干多聚复合物之间的差异（图7）。

对于所有三种分散方法（UT，均质器，溶解），重悬浮在注射用水（未处理）中的样品和在重悬浮前经过均质化（在研钵中研磨）的那些多聚复合物均显示出类似的带图。与对照——未复合的质粒DNA——相比，在全部情况下均观察到松弛形式（relaxed form）略微增加。对于注射用水，质粒DNA的降解不明显。

作为实例，甘油缩甲醛显示作为溶剂。未处理的或均质化前的样品与水对照的带图之间未发现差异。利用均质器作为分散方法，也无变化可被观察到。利用Ultra-Turrax，pDNA主要以复合形式留在凝胶袋中。在此，对于未处理样品，与另一样品相比，可检测到两个略弱的带。但是，应注意，当使用等量硫酸乙酰肝素时，在甘油缩甲醛的影响下，通常较大量pDNA以复合形式留在袋中。关于均质化的UT样品，凝胶中观察到略微污迹；但是，在此重申，无片段形式的质粒DNA破坏可被观察到。

实施例7

确定制备的质粒-DNA多聚复合物的释放动力学

活性剂从植入物的释放在理论上可由于i）活性剂从聚合物基质扩散（扩散主导的释放）或ii）基质的侵蚀（侵蚀主导的释放）[51，52]。关于活性剂从本体侵蚀聚合物基质的释放，如PLGA体系的情况，根据药物负载、所用聚合物摩尔质量和聚合物浓度描述一相或两相释放特征[53，54]。

此外，可发生活性剂的初始释放，甚至直至聚合物完全沉淀。根据聚合物的摩尔质量、所用溶剂和掺入选择，测试原位形成的膜的释放动力学。测试下列组合：

1.亲脂相（1ml）：502H或504H10%（m/v），溶解在甘油缩甲醛、四甘醇或DMI中

2.亲水相（1ml）：注射用水

3.活性剂：冻干的多聚复合物（l-PEI/pDNA），均质化形式

在冻干后，将多聚复合物在研钵中均质化，并重悬浮于亲水相中（掺入选择A）或通过均质器分散在亲脂性PLGA溶液中（掺入选择B）。502H和504H采用不同溶剂的两种掺入选择的释放特征显示在图6中。

图线显示：图（A）：502H，亲水相中的多聚复合物；图（B）：RG502H，亲脂相中的多聚复合物；图（C）：504H，亲水相中的多聚复合物，图（D）：504H，亲脂相中的多聚复合物。

当先观察多聚复合物通过溶于亲水相中而掺入膜时，可清楚地看到所用聚合物的摩尔质量和所用溶剂对释放动力学的显著影响（图6A，C）。利用DMI作为溶剂，组合短链聚合物502H，活性剂不可被掺入（图6A）。在聚合物沉淀期间，100%的多聚复合物就已被释放。但是，利用较长链聚合物——504H，实现了一般的两相释放。这包括初始扩散主导的释放（阶段1，凹形释放特征），然后侵蚀主导的释放（阶段2，线性动力学）（图6C）。为此，显而易见的是，当使用DMI时，在全部情况下均实现最高的初始释放，其根据掺入选择和聚合物链长度而在10%至100%之间变化。

相反，甘油缩甲醛显示低初始释放，然后缓慢的扩散主导的释放。仅随着基质侵蚀开始侵蚀，观察到多聚复合物加速释放，其取决于所用聚合物的链长度分别在15和26天后开始。但是，基于四甘醇的膜显示，在分别32%（502H）和50%（504H）的中等初始释放后，在观察的时间框中的中等至零释放。仅在较长链聚合物的情况下，存在在26天后由于基质侵蚀造成的低释放（图6C）。

但是，当多聚复合物分散在亲脂性PLGA溶液中（掺入选择B）时，全部聚合物/溶剂组合的多聚复合物初始释放速率和从基质的扩散均降低，并且释放主要进行侵蚀主导的释放（图6B，D）。测试溶剂显示出类似的具有不同强度延迟的释放曲线，其中释放速率依下列次序增加：四甘醇<<甘油缩甲醛<DMI。虽然DMI和甘油缩甲醛的释放特征清楚显示出短链502H聚合物的侵蚀速率短于长链504H聚合物（第17天-比-第29天），但在四甘醇的情况下，由于基质的强延迟，聚合物之间无差异可被观察到（在30天后5.4%-比-8.8%累积释放）。

总之，DMI对于长链或短链聚合物和不同掺入选择的全部组合显示出最快的释放。多达100%活性剂释放的连续释放可利用504H、通过将活性剂掺入亲水相来实现。掺入基于四甘醇的膜的多聚复合物显示无扩散主导的释放。在观察时期中，在初始释放后，另外可释放多达14%的pDNA量，其中初始释放在0和48%之间变化。在掺入选择A的情况下，其相对较高，而当多聚复合物分散在亲脂相中时，无初始释放可被观察到。基于甘油缩甲醛的膜显示出低初始释放，而与嵌入方法无关；但是，即使在使用这些膜时，多聚复合物也仅可在23天后通过基质侵蚀被释放。

实施例8

分析体外转染效力

首先确定体外释放特征——如上所述，通过利用报告基因荧光素酶进行。在这些数据和剂型要求的基础上，选择聚合物504H，组合DMI作为溶剂，来用于膜。两种活性剂将以冻干形式被掺入基质的亲水相。通过初步测试，预期55%的活性剂初始释放。这可极大地有利于在术后粘连区域的施用以覆盖手术后急性期（第2至5天）[79-81]。但是，在此，应避免tPA浓度的非生理增加，因为会增加腹膜中的渗出（bleeding）风险。可选地，测试由504H和甘油缩甲醛组成的无初始释放的膜。在此重申，多聚复合物溶解在亲水相中。先利用活性剂1体外分析制剂，该活性剂1与l-PEI复合并在添加10%蔗糖下冻干。另外，以1：1混合物形式使用编码由细胞分泌的荧光素酶的pMetLuc质粒，作为对照。

关于细胞分析中的体外测试，使间皮细胞（Met5A）在***物上生长，并随后将聚合物膜喷射到细胞层上。***物的应用能够将孔分成双室体系，其中外室和内室相当于腹膜的原位解剖，其之间可以进行恒定的物质交换，使得细胞可从顶侧和底侧被供应以介质。细胞形态通过光学显微镜被光学控制，但是膜上喷射致使其存在困难。可通过利用***物分析两室中经过30天时间的报告基因荧光素酶的表达。

图10显示上室。与团注给予——其中在注射用水中施用完整质粒DNA剂量，而无需释放体系——相比，原位形成的膜显示出荧光素酶水平降低10³至10⁴倍。基因表达如上所述进行。在这些关于释放动力学的研究中，DMI基础的膜显示出56%pDNA用量的初始释放，并且在进一步的进程中，直到第26天显示出进一步38%的释放。根据此释放特征，对于DMI基础的膜而言，在2天后已经观察到基因表达增加，在再7天后下降至基值，和到第23天再一次增加至中等值。相反，当甘油缩甲醛用作溶剂时，基因表达在两相中发生，而无多聚复合物的初始释放。之前10天表达速率第一次中等增加后，可在23天后观察到进一步的最大值，其中基因表达增加两倍。细胞培养基中的低分子量片段指示开始侵蚀。

包括甘油缩甲醛和504H的基质的tPA表达显示在图10A中——与单独药剂和无活性剂的膜（无活性膜）比较。类似于荧光素酶表达，无储存体系的活性剂的单独药剂在经过29天的时间产生极高的蛋白水平，其中tPA浓度与基值相比增加100至40倍。类似的浓度在腹膜内给予血浆中的重组tPA（阿替普酶）后实现[82]。因此，通过基质制剂可实现的值呈现出非常接近于生理条件。对于血浆和腹膜流体，4至6ng/ml的游离tPA-抗原浓度已被描述[82-84]，另外1.3ng/ml tPA的平均值被限制于PAI-1[84]。惊讶的是，通过无活性膜的施用已经略微增加的值，其中在释放开始时通过活性膜（具有嵌入的活性剂）与无活性膜相比实现4倍增加。该效果直到第16天走平，并且在2ng/ml，tPA水平降至基值。这被假设是因为如下事实：到第15天几乎没有更多多聚复合物可从基质被释放（参见第7.3章）。在测试结束时，基质没有被完全侵蚀，使得嵌入多聚复合物可在喷射膜中被检测到（图10B）。

实施例9

通过共同应用siRNA和pDNA造成的组织纤溶酶原浓度增加

通过施用tPA编码质粒造成的胞外tPA浓度增加可在间皮细胞上成功地显示。下文将分析可通过同时施用抗PAI-1的siRNA实现多少tPA/PAI-1比增加。

之前研究已经显示，l-PEI主要适于体内施用siRNA和质粒DNA[23]。因此，将pDNA/siRNA/l-PEI多聚复合物在HBS中以N/P比10（基于pDNA浓度）制备，并且测试针对PAI-1的不同siRNA序列。不同pDNA/siRNA组合的tPA/PAI-1比显示在图11中。所用的siRNA序列是在初步测试中在最佳浓度0.12μM下最有效抑制PAI-1表达（PAI-1A）的siRNA序列。在转染后48h，共同施用情况下的tPA/PAI-1比与未处理细胞相比增加8倍。通过单独施用pDNA或组合非功能性siRNA（EGFP siRNA）施用pDNA，分别仅可实现4倍和5倍增加。当使用对照质粒时（pUC），发现siRNA导致tPA/PAI-1比增加2倍。

实施例10

用于多聚复合物控制释放的原位形成的膜的研发建立在Baxter公司的施用体系的基础上，如图8所示。因此，双注射器体系加载有亲脂性组分（注射器1）——包括溶解在有机溶剂中的可生物降解的聚合物，和水性组分（注射器2）——注射用水。冻干的pDNA/l-PEI多聚复合物用作活性剂。这些可随后分散在亲脂相中或溶解在亲水相中。关于释放动力学，对两种掺入选择进行分析，如上所述。

实施例11

在细胞存活力测试中，甘油缩甲醛显示在间皮细胞上的最佳相容性。在此，测量出LD₅₀值与DMI和四甘醇相比分别高200和400倍。在6h的温育期下，这些保留约1g/ml，即，当使用约780μl纯甘油缩甲醛时，50%的间皮细胞死亡。文献数据公开了在啮齿动物体内静脉给予后DMI和甘油缩甲醛的可匹敌的LD₅₀值，而四甘醇的毒性高2至3倍。通过制造商关于兽用抗寄生虫药物的信息，在静脉施用50%甘油缩甲醛溶液后，可获得4至4.8g/kg体重（小鼠）的LD₅₀。这类似于在Committee for Veterinary Products[85]的综述报告中的EMA的描述。在静脉给予DMI后急性毒性仅最低限度地区别于甘油缩甲醛。通过在施用40%DMI等渗盐水溶液（v/v）后LD₅₀为5.4g/kg体重（大鼠）在施用20%溶液后和LD₅₀为6.9g/kg体重（小鼠），DMI似乎在静脉给予后被更好地耐受。自六十年代以来，四甘醇已经以多达50%（v/v）的浓度被用作胃肠外溶剂（静脉，肌肉），并且在此稀释度下被归类为无刺激性。LD₅₀在未经稀释的情况下被静脉给予后为3.8g/kg体重（小鼠），低于对于其他两种溶剂的描述[86]。

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Claims (21)

1.用于生成原位形成的基质的喷射体系，包括

a)至少一种亲脂性组分，其包括基于乙醇酸和乳酸的至少一种聚合物，和XlogP3值小于0.2的至少一种生物相容性溶剂，和

b)至少一种亲水性组分，

其中所述至少两种组分在施用前彼此分离地存在，并且仅混合用于喷射或在喷射时混合，其中所述组分在喷射到人组织上时形成膜。

2.根据权利要求1所述的喷射体系，其特征在于，其进一步包括活性剂，所述活性剂被溶解和/或分散在所述两种组分中的一种中或在两种组分中。

3.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述亲脂性组分包括PLGA聚合物和所述PLGA聚合物的生物相容性溶剂。

4.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述生物相容性溶剂的XlogP3值为0.2至-1.0。

5.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述生物相容性溶剂选自四甘醇、二甲基异山梨醇酯和/或甘油缩甲醛。

6.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述溶剂的LD₅₀为至少1mg/ml。

7.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述聚合物是聚(D,L-丙交酯-共聚-乙交酯)聚合物，其中丙交酯与乙交酯的比为25：75至75：25；和/或所述聚合物是固有粘度值为0.16至0.70dl/g的PLGA；和/或所述PLGA聚合物通过凝胶渗透色谱法测量的摩尔质量为10至63kDa。

8.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，PLGA和生物相容性溶剂被选择，使得每100份溶剂溶解5至60份PLGA。

9.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述亲水性组分是水，任选地，其中溶解或分散活性剂。

10.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，在喷射后形成的所述膜在所述施用位点的降解速率为2至6周。

11.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述活性剂包括至少一种核酸。

12.根据前述权利要求所述的喷射体系，其特征在于，其包括编码纤溶因子的核酸。

13.根据权利要求12所述的喷射体系，其中所述纤溶因子为tPA。

14.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述活性剂包括抑制纤溶酶原激活因子抑制剂的物质。

15.根据前述权利要求所述的喷射体系，其特征在于，所述抑制所述PAI的物质是siRNA。

16.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述核酸与载体物质一起存在于复合物中；所述载体物质为具有带正电基团的载体物质。

17.根据权利要求16所述的喷射体系，其中所述载体物质为聚乙烯亚胺。

18.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，所述形成的膜显示两相释放动力学。

19.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，其包括N/P比为1至10的多聚复合物。

20.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其特征在于，其包括tPA编码DNA和PAI抑制剂，其比例为5：1至1：5。

21.根据前述权利要求中任一项所述的喷射体系，其用于在腹膜上施用，具体地用于防止外科粘连和瘢痕形成。