CN103920153A - 一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料及其制备方法，所述材料由介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子和包覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳聚糖聚合电解质膜组成。所述方法包括：将介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分散到壳聚糖溶胶中，经搅拌、分离、洗涤、干燥得到壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料。

Description

一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种载药缓控释材料及其制备方法，具体涉及一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤导致的死亡率在我国已上升至第一位，其发病率也呈逐年上升的趋势。针对恶性肿瘤，目前主要的治疗手段为手术、放疗及化疗。化疗经历了近一个世纪的不断发展和完善，已成为恶性肿瘤综合治疗最重要的手段。但目前化疗的疗效却一直处于较低的水平，主要原因在于化疗药物用量大，且药物大多缺乏药理活性的专一性，对癌组织和正常组织均产生严重的毒副作用，患者在用药期间发生***反应并产生多重耐药性而被迫停药，贻误治疗时机。

随着纳米科技的发展，逐渐诞生了纳米药物控释***。所谓纳米药物控释***，通常包含两个方面的内容：一是依据病理变化将药物送到指定的病变部位，发挥药物的最大疗效，而对正常组织的伤害降到最低限度；二是控制药物的释放速度，使血药浓度控制在安全有效的范围内，从而减少给药剂量，减轻或避免毒副反应。简单的说，就是将制剂的特异靶向性和药物的释放可控性相结合的药物控释***。

要达到理想的控释行为，药物载体的选择是关键，在药物控释发展的最初阶段，用于药物可控释放的材料多为有机高分子[J.H.Kim et al.,J Control Release,2008,127,41-49；L.Bromberg,J Control Release,2008,128,99-112；W.Tsuruta et al.,Biomaterials,2009,30,118-125]，利用有机高分子聚合物作为活性制剂的载体或介质制成缓控释制剂，从而实现活性制剂的可控释放。虽然高分子材料在可控释放方面的应用与研究已经取得了长足的进展，但因有机材料机械强度低，化学稳定性差，有些有机材料生物相容性不理想，甚至有一定的毒性，使其应用受到局限。

2001年Vallet-Regi等首次报道了硅基介孔材料(介孔二氧化硅)用于药物缓控释***，从此拉开了介孔二氧化硅用于药物传输***的序幕。介孔二氧化硅具有有序的规则孔道结构，可调的孔径，良好的生物相容性和可降解性等特点，近年来被广泛地用作无机药物载体来组装智能药物控释***[Y.C.Zhu et al.,J.Am.Chem.Soc.,2010,132,1450；S.H.Wu et al.,Chem.Soc.Rev.,2013,42,3862-3875；F.Q.Tang et al.,Adv.Mater.,2012,24,1504-1534]。

通过在介孔二氧化硅的表面修饰上不同的基团，如CdS纳米粒子，金纳米粒子，或者软纳米粒子，如树枝状大分子，蛋白质或高聚物等作为控制药物释放的门结构，这种门结构在外加刺激，如光照、磁场变化、超声，以及氧化还原反应、pH变化、静电相互作用等作用下发生打开/闭合的转换，从而达到定时、定量靶向释放药物分子的功能。在这些药物缓控释***中，根据肿瘤组织与正常组织pH值不同这个特点，响应性地释放药物的pH响应性控释***，因为不需要额外的外加刺激，同时可以实现对肿瘤组织的靶向药物释放，而成为目前研究的热点[H.A.Meng et al.,J Am Chem Soc,2010,132,12690-12697；Y.L.Zhao etal.,J Am Chem Soc,2010,132,13016-13025；Y.J.Yang et al.,Acta Biomater,2010,6,3092-3100]。

壳聚糖因为具有良好的生物相容性，且含有可质子化的氨基，这些氨基在不同的pH环境中可以发生质子化/去质子化的转变，使壳聚糖发生弹性态/沉淀态之间的转变。通过在介孔二氧化硅表面进行壳聚糖修饰可以实现对所装载药物的pH响应性释放。

已见报道的聚合物修饰的介孔二氧化硅材料，例如：申请号为200610113976.5的中国发明专利中提供了一种双壳层药物缓控释载体材料，利用中空二氧化硅微球作为药物载体，通过外层的聚合阴离子和聚合阳离子多层膜来控制药物在不同外部环境中的释放速率，然而其需要交替沉积聚阴离子膜和聚阳离子膜，制备过程复杂；该法制得的材料虽然有缓释作用且释放速率响应于pH值，然而其在中性(正常细胞)的释放率高于在酸性(肿瘤细胞)的释放率，不利于对肿瘤细胞等的靶向释放。申请号为201010271960.3的中国发明专利中提供了一种载药缓控释纳米材料，以夹心二氧化硅纳米粒为载体，空腔中装载药物后在先在其外包裹一层γ-聚谷氨酸，然后再包裹壳聚糖膜，重复多次形成多层结构，调节空腔中药物的释放从而达到缓释药物的作用。从现有技术可以看出，目前对于壳聚糖修饰的药物缓控释研究呈现多样化，但是大部分的药物控释体系构成复杂，大多需要复杂的操作步骤，而且，在这些复杂的修饰过程中，有可能导致其中所装载的药物发生分解而失活。

因此，如何通过简单的工艺，得到装载量大、靶向性释药的材料，是该领域的研究方向之一。

发明内容

本发明旨在克服现有制备壳聚糖修饰载药缓控释材料的方法所具有的缺陷，本发明提供了一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料及其制备方法。

本发明提供了一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料，所述材料由介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子和包覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳聚糖聚合电解质膜组成。

本发明提供的材料仅由介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子和包覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳聚糖聚合电解质膜组成，相比现有技术结构简单，其中，介孔二氧化硅的孔容大，装载量大，壳聚糖聚合电解质膜在中性及微碱性(模拟正常细胞)的条件下，由于其表面的氨基质子化程度低，分子间氢键的作用大于静电斥力的作用，分子链团聚，成有序聚集状态，有效阻止装载的药物释放，而在酸性(模拟肿瘤细胞)的条件下，其表面的氨基质子化程度高，静电斥力大于分子间氢键，与水作用，成溶胶状态，使得装载的药物可以释放出来，达到靶向缓释作用。此外，二氧化硅和壳聚糖可生物降解，生物相容性好。

较佳地，所述孔二氧化硅纳米粒子的粒径可为50～400nm，介孔孔径可为1.9～10nm。

较佳地，所述壳聚糖聚合电解质膜的厚度可为2～30nm。

较佳地，可装载药物可为水溶性或脂溶性药物，所述亲水性药物包括阿霉素、丝裂霉素、维生素C，所述脂溶性药物包括喜树碱、紫杉醇、布洛芬、青蒿素。

本发明还提供了一种制备上述材料的方法，所述方法包括：

将介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分散到壳聚糖溶胶中，经搅拌、分离、洗涤、干燥得到壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料。

本发明还提供了一种制备上述材料的方法，所述方法包括：

将介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂反应以在其表面键接活性基团；以及

将表面键接有活性基团的介孔二氧化硅纳米粒子分散到壳聚糖溶胶中，经搅拌、分离、洗涤、干燥得到壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料。

较佳地，所述的硅烷偶联剂可为γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅氧烷、异氰酸丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。

较佳地，所述壳聚糖溶胶的pH值可为5.0～6.0。

较佳地，所述壳聚糖溶胶的浓度可为0.5～10％。

本发明的有益效果：

本发明所述的任一种壳聚糖修饰的载药缓控释材料具有如下优势：

1)采用生物相容性极高的壳聚糖和生物可降解的介孔二氧化硅纳米粒子，因而生物相容性强；

2)通过调节介孔二氧化硅纳米粒子尺寸及空腔大小，以及药物溶液的浓度可以方便的调节药物的装载量；

3)缓控释材料制备过程简单，物理包覆过程无需其它化学试剂的介导，通过物理吸附/静电作用来形成稳定的复合物。化学修饰过程采用简单的硅烷偶联剂一步即可实现壳聚糖的有效负载，因而简单有效，方便工艺化生产；

4)利用纳米粒子本身在肿瘤组织周围的EPR效应，可以实现缓控释材料对于肿瘤组织的靶向输运；

5)所制备的缓控释材料利用所修饰的壳聚糖聚合电解质的pH响应性能够实现对所装载药物的缓释和pH响应性释放；

6)所制备的缓控释材料利用所修饰的壳聚糖聚合电解质的pH响应性能够实现对肿瘤组织的靶向性药物释放和在正常组织处较少的药物释放。

附图说明

图1为本发明的一个实施方式中制备的表面包覆有壳聚糖并装载有IBU的介孔二氧化硅纳米复合物(IBUMSNs-Cs-1)的透射电子显微照片(TEM)；

图2为本发明的一个实施方式中制备的IBUMSNs-Cs-2的释放液的紫外/可见吸收光谱；

图3为本发明的一个实施方式中制备的键接壳聚糖并装载阿霉素的缓控释材料(DOXHMSNs-Cs)的透射电子显微照片(TEM)；

图4为本发明的一个实施方式中制备的ARTHMSNs-Cs中的ART在不同pH的PBS释放介质中的累积释放曲线；

图5为本发明中制备的载药缓控释材料在正常组织环境下不释药和在肿瘤组织环境下响应性释药的示意图。

具体实施方式

以下结合附图及下述具体实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式和/或附图仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明公开了一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料及其制备方法和应用。所述的载药缓控释材料是以介孔二氧化硅纳米粒子为载体，装载药物后在其外通过物理吸附或者化学键接壳聚糖聚合电解质膜。本发明具有较高的载药量，并且制备方法简单，外层的壳聚糖聚合电解质膜可根据所处生理介质pH的变化自动调节所装载药物的释放从而达到缓释药物以及pH响应性释放药物的功能。该释药体系因具有在酸性肿瘤组织(pH6.5)释药而在正常组织(pH7.4)不释药的特点，因而可以明显减轻所装载药物对正常组织的毒副作用，并实现对肿瘤组织的靶向性毒性，因而具有巨大的生理意义和临床应用价值。本发明针对现有技术的不足提供了一种以介孔二氧化硅纳米粒子为药物载体，壳聚糖聚合电解质修饰的pH响应性载药缓控释材料。本发明工艺简单、可规模化生产，而且装载量高，并可以实现药物在肿瘤组织靶向性释药，而在正常组织周围不释药，因而具有重要的生理意义和临床应用价值。

本发明提供了一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料，以介孔二氧化硅纳米粒子为载体，装载药物后在其外修饰壳聚糖聚合电解质膜。

所述的介孔二氧化硅纳米粒子，具有介孔孔道的介孔二氧化硅或者空心介孔二氧化硅纳米材料。尤其是空心介孔二氧化硅纳米粒子，因为具有巨大的空腔结构可以实现对药物高的装载量。

所述的载药缓控释材料，所述的药物通过物理浸渍装载在介孔二氧化硅孔道结构内。

所述的载药缓控释材料，介孔二氧化硅纳米粒子外层修饰壳聚糖聚合电解质膜。

所述的修饰壳聚糖聚合电解质膜的介孔二氧化硅载药缓控释材料的制备方法，壳聚糖聚合电解质膜经过物理吸附包覆，或者化学基团键接在介孔二氧化硅纳米材料的表面，通过硅烷偶联剂一步键接在介孔二氧化硅纳米粒子的表面。

本发明所述的载药缓控释材料，可装载各种水溶性和脂溶性药物，所述的亲水性药物选自阿霉素，丝裂霉素，维生素C的一种或一种以上的混合物。所述的脂溶性药物选自喜树碱，紫杉醇，布洛芬，青蒿素中的一种或一种以上的混合物。

所述的壳聚糖经化学基团键接在介孔二氧化硅纳米材料的表面，壳聚糖通过硅烷偶联剂键接在介孔二氧化硅表面。

所述的硅烷偶联剂选自γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅氧烷、异氰酸丙基三乙氧基硅烷中的任意一种。

所述的载药缓控释材料的制备方法，以介孔二氧化硅纳米粒子为载体，装载药物后，再经过表面修饰壳聚糖聚合电解质膜，具体步骤如下：

A)介孔二氧化硅纳米粒子载药

利用物理浸渍法将药物溶液经扩散装载到介孔二氧化硅纳米粒子的孔道结构内；

B)载药的介孔二氧化硅纳米粒子表面壳聚糖修饰

方法i)将载药的介孔二氧化硅纳米粒子分散到壳聚糖溶胶溶液中，经搅拌、静置得到包覆壳聚糖的载药介孔二氧化硅；

方法ii)将介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂相互作用，使介孔二氧化硅表面活化，将活化的介孔二氧化硅经物理浸渍装载药物后，利用活性基团与壳聚糖之间的加成反应，得到修饰壳聚糖的载药介孔二氧化硅；

步骤A)和步骤B)的顺序因具体的装载程序而有所优化。

所述的任一种壳聚糖修饰的载药缓控释材料的用途，利用所修饰的壳聚糖聚合电解质的pH响应性实现对所装载药物的缓释和pH响应性释放。

所述的任一种壳聚糖修饰的载药缓控释材料的用途，利用所修饰的壳聚糖聚合电解质的pH响应性实现对肿瘤组织的靶向性药物释放和在正常组织处较少的药物释放。

本发明所述的任一种壳聚糖修饰的载药缓控释材料具有如下优势：

1)采用生物相容性极高的壳聚糖和生物可降解的介孔二氧化硅纳米粒子，因而生物相容性强；

2)通过调节介孔二氧化硅纳米粒子尺寸及空腔大小，以及药物溶液的浓度可以方便的调节药物的装载量；

3)缓控释材料制备过程简单，物理包覆过程无需其它化学试剂的介导，通过物理吸附/静电作用来形成稳定的复合物。化学修饰过程采用简单的硅烷偶联剂一步即可实现壳聚糖的有效负载，因而简单有效，方便工艺化生产；

4)利用纳米粒子本身在肿瘤组织周围的EPR效应，可以实现缓控释材料对于肿瘤组织的靶向输运；

5)所制备的缓控释材料利用所修饰的壳聚糖聚合电解质的pH响应性能够实现对所装载药物的缓释和pH响应性释放；

6)所制备的缓控释材料利用所修饰的壳聚糖聚合电解质的pH响应性能够实现对肿瘤组织的靶向性药物释放和在正常组织处较少的药物释放。

图1为本发明的一个实施方式中制备的表面包覆有壳聚糖并装载有IBU的介孔二氧化硅纳米复合物(IBUMSNs-Cs-1)的透射电子显微照片(TEM)；

图2为本发明的一个实施方式中制备的IBUMSNs-Cs-2的释放液的紫外/可见吸收光谱；

图3为本发明的一个实施方式中制备的键接壳聚糖并装载阿霉素的缓控释材料(DOXHMSNs-Cs)的透射电子显微照片(TEM)；

图4为本发明的一个实施方式中制备的ARTHMSNs-Cs中的ART在不同pH的PBS释放介质中的累积释放曲线；

图5为本发明中制备的载药缓控释材料在正常组织环境下不释药和在肿瘤组织环境下响应性释药的示意图。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

制备直接包覆壳聚糖(Cs)和装载布洛芬(IBU)的介孔二氧化硅纳米粒子(IBUMSNs-Cs-1)

步骤A)制备介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)

将0.28g氢氧化钠(NaOH)和1.0g十六烷基三甲基溴化铵(C₁₆TAB)分散到480mL去离子水中，并在80℃下剧烈搅拌1个小时。之后将5.0mL正硅酸乙酯(TEOS)加入上述混合液中，并继续在80℃搅拌2小时。反应结束后将获得的白色沉淀物离心，用大量乙醇洗，之后真空冷冻干燥。最后，通过离子交换法去除所制备的介孔二氧化硅孔道内的表面活性剂C₁₆TAB：将上述获得的干燥后的样品(0.5g)分散到含有95％的乙醇水溶液和0.2g硝酸铵的混合液中，将混合物在60℃下磁力搅拌5小时，产物经离心、醇洗、真空干燥，即可得介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)；

步骤B)将布洛芬(IBU)装入介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)

采用简单的物理浸渍方法装载布洛芬(IBU)。首先将由步骤A)获得的MSNs分散到IBU正己烷溶液(20mg/mL)中，将此悬浊液在黑暗环境下常温搅拌24小时。之后，将获得的悬浮液离心，用少量水洗去表面吸附的IBU分子，真空室温干燥即可获得装载了IBU的MSNs，标记为IBUMSNs；

步骤C)对IBUMSNs进行表面壳聚糖(Cs)包覆

将1.0g壳聚糖加入到100mL10％的乙酸水溶液中常温搅拌24小时，得到1.0％的壳聚糖溶胶，然后用氢氧化钠将溶液的pH调节至6.0。将步骤B)中制得的IBUMSNs分散到上述的壳聚糖溶胶中，缓慢搅拌24小时。离心、水洗、干燥即得到壳聚糖(Cs)包覆的载有IBU的介孔二氧化硅纳米粒子，标记为IBUMSNs-Cs-1。

图1为所制备的表面包覆有壳聚糖并装载有IBU的介孔二氧化硅纳米复合物(IBUMSNs-Cs-1)的透射电子显微照片(TEM)。从图中可以看出，介孔二氧化硅的粒径为350nm，孔径为2.0nm，MSNs的表面有一层有机物分子覆盖，所形成的纳米复合物相对于之前的MSNs，颗粒尺寸因为壳聚糖的包覆而略有增加，壳聚糖层的厚度约为20nm，TEM清楚的表面了壳聚糖在纳米复合物表面的成功包覆。该缓控释材料中布洛芬的装载量经紫外可见分析为12.3％。

实施例2

制备键接壳聚糖(Cs)和装载布洛芬(IBU)的介孔二氧化硅纳米粒子(IBUMSNs-Cs-2)

步骤A)制备介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)

按照实施例1的步骤A)制备得到HMSNs；

步骤B)将布洛芬(IBU)装入MSNs

采用简单的物理浸渍方法将布洛芬(IBU)分子扩散进入MSNs的介孔孔道。将步骤A)获得的MSNs分散到布洛芬正己烷溶液(40mg/mL)中，在黑暗环境下常温搅拌24小时。之后，将获得的悬浮液离心，用少量水洗去表面吸附的IBU分子，真空室温干燥即可获得装载了IBU的MSNs，标记为IBUMSNs；

步骤C)对载药的介孔二氧化硅(IBUMSNs)表面进行γ-MPS修饰

利用MSNs表面富含硅羟基的特点，将IBUMSNs与硅烷偶联剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)反应，使IBUMSNs的表面修饰一层γ-MPS分子。将0.1mLγ-MPS加入4mL无水甲苯中，然后加入步骤B)中获得的IBUMSNs(0.1g)，将此悬浊液在黑暗条件下搅拌12小时，过滤、清洗后冷冻干燥，即可得到装载IBU的纳米复合物，标记为IBUMSNs-M；

步骤D)在IBUMSNs-M表面键接壳聚糖(Cs)

IBUMSNs-M表面键接了大量的丙烯酰氧基，利用丙烯酰氧基与壳聚糖的氨基之间的加成反应，将Cs键接到IBUHMSNs-M表面。将0.6g壳聚糖加入到100mL10％的乙酸水溶液中常温搅拌24小时，得到0.6％的壳聚糖溶胶，然后用氢氧化钠将溶液的pH调节至6.0。将步骤C)获得的IBUMSNs-M分散到上述的壳聚糖溶胶中，在黑暗条件下常温搅拌12小时，静置6小时，之后调节溶液的pH至7.4。经离心、水洗、干燥后即可得到表面键接壳聚糖(Cs)并装载IBU的二氧化硅纳米复合物，标记为：IBUMSNs-Cs-2。

图2是IBUMSNs-Cs-2的释放液的紫外/可见吸收光谱。从图中可以看出，释放介质中IBU在264nm处有一个明显的吸收峰，这与IBU水溶液的吸收峰(λmax＝264nm)是一致的，这就说明所释放出来的IBU保持了良好的稳定性。该缓控释材料中布洛芬的装载量经紫外可见分析为18.7％。

实施例3

制备键接壳聚糖(Cs)和装载喜树碱(CPT)的介孔二氧化硅纳米粒子(CPTMSNs-Cs)并评价其pH响应性的CPT释放

步骤A)制备介孔二氧化硅纳米粒子(MSNs)

按照实施例1的步骤A)制备得到MSNs；

步骤B)对介孔二氧化硅(MSNs)表面进行γ-MPS修饰

利用MSNs表面富含硅羟基的特点，将MSNs与硅烷偶联剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MPS)反应，使MSNs的表面修饰一层γ-MPS分子。将0.1mLγ-MPS加入4mL无水甲苯中，然后加入步骤A)中获得的MSNs，将此悬浊液在黑暗条件下搅拌24小时，过滤、清洗后冷冻干燥，即可得到表面进行γ-MPS修饰的介孔二氧化硅，标记为MSNs-M；

步骤C)将喜树碱(CPT)装入MSNs-M

采用简单的物理浸渍方法将喜树碱(CPT)分子扩散进入MSNs-M的介孔孔道。将步骤B)中获得的MSNs-M分散到CPT乙醇溶液中，在黑暗环境下常温搅拌24小时。之后，将获得的悬浮液离心，用少量水洗去表面吸附的CPT分子，真空室温干燥即可获得装载了CPT的MSNs-M，标记为CPTMSNs-M；

步骤D)在CPTMSNs-M表面键接壳聚糖(Cs)

步骤同实施例2中的步骤D)，所获得的产物标记为：CPTMSNs-Cs；

步骤E)评价CPTMSNs-Cs pH响应性的CPT释放

将CPTMSNs-Cs分散到不同pH的PBS溶液中以检测所制备的CPTMSNs-Cs中CPT的释放情况。选择pH7.4和6.5的PBS溶液是为了分别模拟正常组织细胞环境(pH～7.4)和发炎组织/癌细胞等病变组织环境(pH～6.5)。将获得的样品粉末用3MPa的压强对其进行1分钟的压片。将获得的压片至于37℃预热的pH7.4和6.5的PBS释放介质中，并置于37℃恒温摇床上轻轻摇晃。在特定的时间间隔，将混合液离心，并从上清液中取出5mL用于紫外/可见吸收光谱测定。于此同时，向离心后的混合液中加入5mL新的经37℃预热的释放介质，混合液经混匀后，继续至于摇床上，用于后续的药物释放分析。每份测试做三次，对三次的测试结果取平均值。该缓控释材料中喜树碱的装载量经紫外可见分析为14.1％。

根据紫外/可见吸收光谱分析所获得的CPT的累积释放曲线发现CPTMSNs-Cs中CPT的释放具有明显的pH响应性。在pH7.4的PBS环境中300分钟后CPT的释放量为31.4％，而在pH6.5的PBS环境中300分钟后的累积药物释放量为62.2％。可见，所制备的CPTMSNs-Cs在酸性的肿瘤环境(pH6.5)的释药量要明显高于它在正常组织环境(pH7.4)下的释放量。

实施例4

制备键接壳聚糖(Cs)和装载阿霉素(DOX)的空心介孔二氧化硅(DOXHMSNs-Cs)

步骤A)制备空心介孔二氧化硅纳米粒子(HMSNs)

首先利用stober方法制备实心二氧化硅纳米球。之后，将制备出来的实心二氧化硅纳米球(200mg)分散到40mL去离子水中，并超声15分钟以分散其中的纳米粒子。在此期间，将300mg十六烷基三甲基溴化铵(C₁₆TAB)分散到60mL去离子水，60mL乙醇和1.3mL氨水中，室温下混匀。之后，将上述超声后的实心二氧化硅纳米球悬浮液加入到C₁₆TAB混合液中并超声1小时。之后，向上述混合物中快速加入0.53mL正硅酸乙酯(TEOS)并继续搅拌7小时。反应结束后，将获得的白色沉淀物离心。之后，将这些沉淀物重新分散到0.4M Na₂CO₃水溶液中，并在50℃条件下磁力搅拌13小时。最终获得的白色沉淀物经离心、醇洗后真空干燥。最后，通过离子交换法去除所制备的空心介孔二氧化硅孔道内的表面活性剂C₁₆TAB：将上述获得的干燥后的样品(0.5g)分散到含有95％的乙醇水溶液和0.2g硝酸铵的混合液中，将此混合物在60℃下磁力搅拌5小时，产物经离心、醇洗后真空干燥，即可得空心介孔二氧化硅纳米粒子(HMSNs)；

步骤B)将阿霉素(DOX)装入HMSNs

采用简单的物理浸渍方法将阿霉素(DOX)分子扩散进入HMSNs的介孔孔道。将步骤A)中获得的HMSNs分散到DOX水溶液中，在黑暗环境下常温搅拌24小时。经离心、真空室温干燥，即可获得装载了DOX的HMSNs，标记为DOXHMSNs；

步骤C)对载药的空心介孔二氧化硅(DOXHMSNs)表面进行γ-GPTMS修饰

利用HMSNs表面富含硅羟基的特点，将DOXHMSNs与硅烷偶联剂γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(γ-GPTMS)反应，使DOXHMSNs的表面修饰一层环氧乙烷。将步骤B)中获得的DOXHMSNs(0.1g)分散到5mLγ-GPTMS中，将此悬浊液在黑暗条件下干燥的氮气氛围中回流12小时，过滤、清洗后冷冻干燥，即可得到装载DOX的纳米复合物，标记为DOXHMSNs-G；

步骤D)在DOXHMSNs-G表面键接壳聚糖(Cs)

DOXHMSNs-G表面键接了大量的环氧乙烷，利用环氧乙烷与壳聚糖的氨基在酸性条件下的环氧乙烷-氨基加成反应，将Cs键接到DOXHMSNs-G表面。将0.6g壳聚糖加入到100mL10％的乙酸水溶液中常温搅拌24小时，得到0.6％的壳聚糖溶胶，然后用氢氧化钠将溶液的pH调节至5.0。将步骤C)获得的DOXHMSNs-G分散到上述的壳聚糖溶胶中，在黑暗条件下常温搅拌12小时，静置6小时，之后调节溶液的pH至7.4。经离心、水洗、干燥后即可得到表面键接壳聚糖(Cs)并装载DOX的二氧化硅纳米复合物，标记为DOXHMSNs-Cs。

图3为所制得的键接壳聚糖并装载阿霉素的缓控释材料(DOXHMSNs-Cs)的透射电子显微照片(TEM)。从图中可以看出，与之前制备的HMSNs相比，壳聚糖修饰后的DOXHMSNs-Cs孔道结构变得不再分明，表面有一层有机物覆盖，说明了壳聚糖的成功键接。该缓控释材料中阿霉素的装载量经紫外可见分析为34.8％。

实施例5

制备键接壳聚糖(Cs)和装载青蒿素(ART)的空心介孔二氧化硅(ARTHMSNs-Cs)

步骤A)制备空心介孔二氧化硅纳米粒子(HMSNs)

制备步骤同实施例4的步骤A)；

步骤B)对介孔二氧化硅(HMSNs)表面进行γ-GPTMS修饰

利用HMSNs表面富含硅羟基的特点，将HMSNs与硅烷偶联剂γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-GPTMS)反应，使HMSNs的表面修饰一层环氧乙烷。将步骤A)中获得的HMSNs(0.1g)分散到5mLγ-GPTMS中，将此悬浊液在黑暗条件下干燥的氮气氛围中回流24小时，过滤、清洗后冷冻干燥，即可得到γ-GPTMS修饰的纳米复合物，标记为HMSNs-G；

步骤C)将青蒿素(ART)装入HMSNs-G

采用简单的物理浸渍方法将青蒿素(ART)分子扩散进入HMSNs-G的介孔孔道。将步骤B)获得的HMSNs-G分散到青蒿素(ART)丙酮溶液中，在黑暗环境下常温搅拌24小时。之后，将获得的悬浮液离心，用少量水洗去表面吸附的ART分子，真空室温干燥即可获得装载了ART的HMSNs-G，标记为ARTHMSNs-G；

步骤D)在ARTHMSNs-G表面键接壳聚糖(Cs)

步骤同实施例4中的步骤D)，所获得的产物标记为ARTHMSNs-Cs；

步骤E)ART释放性能评价

将上述制备出的干燥的ARTHMSNs-Cs分成2份，准确称重后，分别分散于10mL pH＝7.4和pH＝6.5的PBS释放介质中，并置于37℃恒温摇床上轻轻摇晃。在特定的时间间隔，将混合液离心，并从上清液中取出3mL用于紫外/可见吸收光谱测定。于此同时，向离心后的混合液中加入3mL新的经37℃预热的释放介质，混合液经混匀后，继续至于摇床上，用于后续的药物释放分析。根据测得的紫外/可见吸收峰的强度，并依据标准曲线，计算所释放的药物的浓度。每份测试做三次，对三次的测试结果取平均值；该缓控释材料中青蒿素的装载量经紫外可见分析为36.2％。

图4为ARTHMSNs-Cs中的ART的累积释放曲线，从图中可以看出，pH为7.4时，300分钟内ART的释放量为14.6％，pH为6.5时，300分钟内ART的释放量为28.8％。可见该壳聚糖修饰的载药缓控释材料在酸性的肿瘤组织(pH＝6.5)的释药量要远高于它在正常组织(pH＝7.4)处的释药量。

这种巨大的释放差异主要是由以下原因引起的：在不同的pH条件下，壳聚糖具有不同的相组成。pH较低时，壳聚糖分子链上的氨基质子化程度高，分子链因带有正电荷而相互排斥，当静电斥力大于氨基羟基之间的氢键作用时，壳聚糖分子链溶于水中，呈溶胶状态；当pH较高时，氨基质子化程度低，此时分子间氢键作用力大于静电斥力作用，分子链团聚现象比较严重，呈聚集状态；当pH处于中间值时，分子间氢键作用和静电斥力作用平衡，壳聚糖分子呈现出凝胶状态。当处于pH7.4的释放介质中，壳聚糖分子呈现有序的聚集态，壳聚糖塌陷的网络结构有效地阻止了ART从ARTHMSNs-Cs中释放出来。当处于酸性的微环境(pH6.5)下，壳聚糖分子呈现弹性的凝胶态，这就使得HMSNs表面部分的介孔孔道被释放，进而导致加速的ART释放。基于以上的分析，我们可以推断，壳聚糖赋予了HMSNs载体一种pH响应的可控性释放特性，也就是说，在病变组织附近，ART加速释放。但是，在正常组织的微环境下基本不会产生ART的泄露。这种pH响应下的ART释放特性增加了ART的治疗效率并降低了它对正常组织的毒副作用。

Claims (9)

1.一种壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料，其特征在于，所述材料由介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子和包覆所述介孔二氧化硅纳米粒子的壳聚糖聚合电解质膜组成。

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于，所述孔二氧化硅纳米粒子的粒径为50～400nm，介孔孔径为1.9～10nm。

3.根据权利要求1或2所述的材料，其特征在于，所述壳聚糖聚合电解质膜的厚度为2～30nm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的材料，其特征在于，可装载的药物为水溶性或脂溶性药物，所述亲水性药物包括阿霉素、丝裂霉素、维生素C，所述脂溶性药物包括喜树碱、紫杉醇、布洛芬、青蒿素。

5.一种制备权利要求1-4中任一项所述材料的方法，其特征在于，所述方法包括：

将介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子分散到壳聚糖溶胶中，经搅拌、分离、洗涤、干燥得到壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料。

6.一种制备权利要求1-4中任一项所述材料的方法，其特征在于，所述方法包括：

将介孔孔道可装载药物的介孔二氧化硅纳米粒子与硅烷偶联剂反应以在其表面键接活性基团；以及

将表面键接有活性基团的介孔二氧化硅纳米粒子分散到壳聚糖溶胶中，经搅拌、分离、洗涤、干燥得到壳聚糖修饰的pH响应性载药缓控释材料。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的硅烷偶联剂为γ-环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷、γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅氧烷、异氰酸丙基三乙氧基硅烷中的至少一种。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶胶的pH值为5.0～6.0。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖溶胶的浓度为0.5～10%。