CN103901201B - 头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速、灵敏、操作简便的头孢氨苄残留量的荧光免疫层析检测试纸条及其制备，该试纸条包括在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线和质控线，结合垫上涂覆有荧光标记的头孢氨苄单克隆抗体。该头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法包括：头孢氨苄‑卵清蛋白包被抗原的合成，羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的制备，而后包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线；荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备，后涂覆于玻璃纤维上作为结合垫；在背板上顺次相互搭接地粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫；得到的试纸条切割成4mm宽度于常温保存。
Description
技术领域
本发明涉及一种兽药残留的荧光免疫速测技术，特别是涉及一种用于头孢氨苄残留检测的荧光免疫层析检测试纸条及其制备。
背景技术
头孢氨苄(Cephalexin)是β-内酰胺类抗生素。兽医临床广泛用于控制奶牛的***炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害。针对该药物在食品中的残留，我国农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，牛奶中的最大残留限量为100μg/kg，肌肉、脂肪中的最大残留限量为200μg/kg。
目前，用于检测头孢氨苄的方法主要有微生物法、色谱法或色谱-质谱联用分析法、免疫分析法等。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联用技术虽然灵敏度高，但是样品前处理及测定操作繁琐、费用高，不适于大量样品的快速检测。
Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术(fluorescent antibody technique)。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用己知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，其中又以荧光抗体方法较常用。基于免疫荧光技术，同时结合色谱层析原理的分析方法称为荧光免疫层析法，以其具有灵敏、快速、特异、简便等优点，广泛应用于现场监控和大规模样品筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查，用于检测牛奶中头孢氨苄药物残留量的荧光免疫层析检测试纸条。
本发明所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条，在背板上依次粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫制成头孢氨苄残留荧光免疫定量层析试纸条。
优选地，所述结合垫上涂覆的稀土荧光纳米颗粒的直径范围为50-100nm。
所述稀土荧光纳米颗粒，可以发射的波长范围是600-630nm，荧光纳米颗粒含有稀土络合物，在基态下是稳定的，在激发光源(340-365nm)的作用下能够发射出波长范围在600-630nm的荧光。
优选地，所述结合垫上涂覆的荧光纳米颗粒标记抗体为稀土荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体，硝酸纤维素膜上面包被有检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原。
本发明的另一目的在于提供一种头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法。
本发明所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
A.头孢氨苄单克隆抗体的具体制备过程为：
(1)动物免疫：采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄与载体蛋白牛血清白蛋白偶联物为免疫原；
(2)细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(3)单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株106个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，-20℃保存。
B.荧光纳米颗粒的醛基化：
取2mg荧光纳米颗粒(20mg/mL，100μL)，以25mM的碳酸盐缓冲液(pH＝9.5)洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后悬浮于100μL上述碳酸盐缓冲液中。加入120μL醛基化的葡聚糖，混匀，短时超声，避光反应3-4小时(室温)。以上述碳酸盐缓冲液洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后，悬浮于100μL碳酸盐缓冲液中。1500r/min离心1分钟，去除杂质，放置在4℃备标记抗体之用。
C.荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备：
将0.5mg头孢氨苄单克隆抗体用碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，与上述醛基化的荧光纳米颗粒混合，4℃反应过夜。然后，加入硼***，终浓度为5mM，4℃反应2-4小时。再加入等体积的封闭液(50mM tris-HClpH7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封闭12小时或过夜；最后用50mM tris-HCl pH7.8洗涤标记好的抗体3遍(12000r/min，4分钟，4℃)，然后用100μL50mM tris-HCl pH7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.05％Tween-20)悬浮，4℃避光储存备用。
D.涂覆有荧光标记抗体的结合垫：
将玻璃纤维膜浸泡于0.2mol/L Tris-HCl(pH7.8)，1.0％TritonX-100，3.0％BSA的处理液中，于4℃条件下浸泡2小时；然后于37℃下烘干2小时，备用。再将玻璃纤维膜切成10mm的宽度，然后在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头喷到玻璃纤维膜，在37℃下烘干1小时，备用。
E.检测线和质控线包被到硝酸纤维素膜上：
所述检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原；将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。取头孢氨苄10mg溶于5mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入1％戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于1mL PBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存。羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成。分别用包被稀释液将头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体调节到0.3-1.0mg/mL，膜液量为25μL/25-30cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4-7mm，然后于37℃下烘干2小时，封袋，以备试纸背板贴板之用。
F.在背板上一次相互搭接的粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸条，按照要求切割为4mm宽，与干燥剂一起密封备用。
本发明还提供一种利用所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条检测头孢氨苄残留的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：牛奶样品离心(12000r/min，10min)脱脂后直接测定；
(2)用试纸条检测：在试纸条的上样点直接滴加上述离心脱脂牛奶样品，层析15-20分钟后，测615nm处的荧光强度值；
(3)检测结果分析：
用所获得的每个浓度的标准品溶液的检测线的荧光强度平均值(H)除以第一个标准品溶液(0标准)的检测线荧光强度值(H0)再乘以100％，得到百分检测线荧光强度值；计算公式为：检测线百分荧光强度值(％)=(H/H0)×100％；公式中H为标准溶液的检测线平均荧光强度值，H0为0μg/L标准溶液的检测线平均荧光强度值；以头孢氨苄标准品浓度的半对数值为X轴，检测线百分检测线荧光强度值为Y轴，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的检测线百分荧光强度值，相对应出一个样品的浓度，从标准曲线上读出样品中头孢氨苄的残留量。
本发明的检测原理为：
当供试品沿试纸条通过毛细作用从下向上虹吸时，根据层析原理，在层析移动过程中，经试纸条检测端，向另一端移动，先后依次经过结合垫、硝酸纤维素膜上检测线和质控线到达吸水垫。层析后，若在紫外灯照射下，质控线未出现红色荧光条带，则试纸条视为无效；质控线出现红色荧光条带，则试纸条视为有效。层析后用现场检测仪检测时，质控线荧光信号强度小于100，则试纸条视为无效；质控线荧光信号强度大于100，则试纸条视为有效；以检测线荧光条带深浅(或者荧光信号强度)分析样品中头孢氨苄浓度，荧光条带越深(信号强度越强)，则样品中头孢氨苄浓度越低。
本发明中检测动物性食品中头孢氨苄的荧光免疫层析检测试纸条定性或定量检测牛奶中头孢氨苄的残留量，样品前处理过程简单，牛奶样品离心脱脂后，可直接测定，并且能同时检测大批样品。测定方法简单、省时，整个检测过程只需30分钟可以完成。牛奶中头孢氨苄残留的最低检测线为0.16μg/L，具有特异性高、灵敏度高等特点，可在动物性食品中头孢氨苄的残留检测中发挥重要作用。
附图说明
图1为实施例1中的头孢氨苄的检测标准曲线图。
具体实施方式
实施例1：头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条的制备
1.蛋白偶联抗原的合成
(1)头孢氨苄免疫抗原的合成
将头孢氨苄和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亚胺法进行偶联得到免疫抗原。
具体操作如下：取头孢氨苄15mg溶于5mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入25mg碳二亚胺(EDC)和10mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌30分钟，取BSA10mg溶于活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，再4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄免疫抗原，分装冻存。
(2)头孢氨苄包被抗原的合成
将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。
具体操作如下：取头孢氨苄10mg溶于5mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入1％戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于1mLPBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存。
2.单克隆抗体的制备
(1)动物免疫
将合成的免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射8周龄雌性BALB/C小鼠，剂量为100μg/只。然后以100μg/只的剂量加弗氏不完全佐剂腹腔注射加强免疫3次，间隔2周。分别于每次免疫后10天小鼠眼眶后缘静脉采血，测定抗体效价。
(2)细胞融合和克隆化
取免疫小鼠的脾细胞，按5∶1比例与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备杂交瘤细胞。采用有限稀释法筛选能够稳定分泌头孢氨苄单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩大培养后液氮冻存。
(3)单克隆抗体的制备与纯化
使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，5天后腹腔注射杂交瘤细胞106个/只，7天后取小鼠腹水，经辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，分装，-20℃保存。
3.荧光纳米颗粒的醛基化：
取2mg荧光纳米颗粒(20mg/mL，100μL)，以25mM的碳酸盐缓冲液(pH=9.5)洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后悬浮于100μL上述碳酸盐缓冲液中。加入120μL醛基化的葡聚糖，混匀，短时超声，避光反应3-4小时(室温)。以上述碳酸盐缓冲液洗涤3遍(12000r/min，4分钟)后，悬浮于100μL碳酸盐缓冲液中。1500r/min离心1分钟，去除杂质，放置在4℃备标记抗体之用。
4.荧光纳米颗粒标记头孢氨苄单克隆抗体的制备：
将0.5mg头孢氨苄单克隆抗体用碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，与上述醛基化的荧光纳米颗粒混合，4℃反应过夜。然后，加入硼***，终浓度为5mM，4℃反应2-4小时。再加入等体积的封闭液(50mM tris-HClpH7.8，含2％BSA、4％蔗糖)，封闭12小时或过夜；最后用50mM tris-HCl pH7.8洗涤标记好的抗体3遍(12000r/min，4分钟，4℃)，然后用100μL50mM tris-HCl pH7.8(含0.9％NaCl、0.2％BSA、0.05％Tween-20)悬浮，4℃避光储存备用。
5.涂覆有荧光标记抗体的结合垫：
将玻璃纤维膜浸泡于0.2mol/L Tris-HCl(pH7.8)，1.0％TritonX-100，3.0％BSA的处理液中，于4℃条件下浸泡2小时；然后于37℃下烘干2小时，备用。再将玻璃纤维膜切成10mm的宽度，然后在Bio-Dot XYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头喷到玻璃纤维膜，在37℃下烘干1小时，备用。
6.检测线和质控线包被到硝酸纤维素膜上：
所述检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原；将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。取头孢氨苄10mg溶于5mL PBS(0.01mol/L，pH7.4)中，加入1％戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于1mLPBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存。羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成。分别用包被稀释液将头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体调节到0.3-1.0mg/mL，膜液量为25μL/25-30cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4-7mm，然后于37℃下烘干2小时，封袋，以备试纸背板贴板之用。
7.试纸条的制备
在背板上一次相互搭接的粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，得到试纸条，按照要求切割为4mm宽，与干燥剂一起密封备用。
所述玻璃纤维膜上涂覆的荧光纳米颗粒的直径范围是70nm，上述方法制备中的所述荧光纳米颗粒，可以发射的波长范围是600-630nm。
实施例1制备试纸条的试验例：
试验例1
样品中头孢氨苄残留的检测
(1)样品前处理
牛奶样本：取适量牛奶样本，4℃，12000r/min，离心10分钟，去除上层脂肪，取下层溶液用样品150μL用于分析。
(2)用试纸条检测
在试纸条上样点直接滴加上述离心脱脂牛奶样品，层析15-20分钟后，用自制的现场检测仪检测读数，或者用荧光扫描仪得到荧光强度值；
(3)检测结果分析：
用所获得的每个浓度的标准品溶液的检测线的荧光强度平均值(H)除以第一个标准品溶液(0标准)的检测线荧光强度值(H0)再乘以100％，得到百分检测线荧光强度值；计算公式为：检测线百分荧光强度值(％)=(H/H0)×100％；公式中H为标准溶液的检测线平均荧光强度值，H0为0μg/L标准溶液的检测线平均荧光强度值；以头孢氨苄标准品浓度的半对数值为X轴，检测线百分检测线荧光强度值为Y轴，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的检测线百分荧光强度值，相对应出一个样品的浓度，从标准曲线上读出样品中头孢氨苄的残留量。
试验例2
试纸条灵敏度实验
分别测定20个不同批次的空白标准液，计算平均百分检测线高度值(H0)和标准差(S)，在标准曲线上查出H0+3S对应的质量浓度为理论检测下限(LOD)，该浓度即为灵敏度。
结果表明本发明开发的试纸条对牛奶样品中头孢氨苄残留的最低检测限为0.09μg/L。
试验例3
试纸条特异性测定
选择包括与头孢氨苄结构和功能类似青霉素及其他5类抗生素测定交叉反应率。通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率：
交叉反应率(％)=(引起50％抑制头孢氨苄的浓度/引起50％抑制的类似物浓度)×100％。
试验结果如表1所示，测试的6种药物与头孢氨苄没有交叉反应。
表1头孢氨苄检测试剂盒的交叉反应性
| 药物名称 | 交叉反应率(100％) |
| 头孢氨苄 | 100 |
| 磺胺嘧啶 | <0.01 |
| 氯霉素 | <0.01 |
| 土霉素 | <0.01 |
| 庆大霉素 | <0.01 |
| 红霉素 | <0.01 |
| 青霉素 | <0.01 |
试验例4
精密度、准确度试验
样品精密度试验：
1)取头孢氨苄标准样品，配制不同浓度样品，分别取四个不同批次的试纸条各三个，每个浓度重复4次，分别计算相对标准偏差。结果表明，牛奶中的相对标准偏差均低于18％。
2)在空白牛奶中添加头孢氨苄标准液至终浓度为5μg/L、1.25μg/L和0.16μg/L。分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算准确度。结果表明牛奶、组织样品添加准确度在100-115％之间。
试验例5
试纸条保存期试验
试纸条保存条件为常温，经过3个月的测定，试纸条的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、头孢氨苄添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试纸条在37℃保存的条件下放置4天，进行加速老化实验，结果表明该试纸条各项指标完全符合要求。从以上结果可得出试纸条可以在常温下，至少可以保存3个月以上。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：在背板上依次粘贴经过处理的样品垫、涂覆有荧光标记抗体的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜包被有检测线为头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原和质控线为羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体。头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条中各部分含有以下成分：
A.结合垫，上面涂覆有荧光标记抗体，所述标记抗体为稀土荧光纳米颗粒与头孢氨苄特异性抗体采用化学交联法进行连接得到的偶联物，具体制备过程为：
(1)头孢氨苄-牛血清白蛋白免疫抗原的合成：将头孢氨苄和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亚胺法进行偶联得到免疫抗原。取头孢氨苄15mg溶于5mL磷酸盐缓冲液PBS中，其中，PBS中磷酸根的浓度为0.01mol/L，溶液的pH为7.4，加入25mg碳二亚胺(EDC)和10mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)搅拌30分钟，取BSA10mg溶于活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，再4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄免疫抗原，分装冻存；
(2)动物免疫：采用雌性BALB/C纯系小鼠作为免疫动物，以头孢氨苄-牛血清白蛋白偶联物为免疫原；
(3)细胞融合与克隆化：取免疫BALB/C小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(4)单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂，5天后腹腔注射杂交瘤细胞株106个/只，7天后取小鼠腹水，进行纯化后得单克隆抗体分装，-20℃保存；
(5)免疫探针制备：取荧光纳米颗粒用碳酸盐缓冲液pH9.5离心洗涤，悬浮，加入醛基化的葡聚糖反应4h，加入上述头孢氨苄单克隆抗体混合4℃过夜。加入硼***溶液于4℃反应4h，洗涤、4℃储存，备用。
B.硝酸纤维素膜，上面包被有检测线和质控线，检测线为头孢氨苄与卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法进行偶联得到的包被原，质控线为羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)，具体制备过程为：
(1)头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原的合成：将头孢氨苄和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法进行偶联得到包被抗原。取头孢氨苄10mg溶于5mL磷酸盐缓冲液PBS中，其中，PBS中磷酸根的浓度为0.01mol/L，溶液的pH为7.4，加入1％戊二醛溶液搅拌30分钟，取OVA30mg溶于1mLPBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，4℃反应过夜。4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分装冻存；
(2)羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作为抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗体球蛋白制成；
(3)分别用包被稀释液将头孢氨苄-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗体调节到0.3-1.0mg/mL，膜液量为25μL/25-30cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔4-7mm，然后于37℃下烘干2小时。
C.样品垫，具体处理为：将玻璃纤维膜浸泡于0.2mol/LTris-HCl，溶液的pH为7.8，1.0％TritonX-100，3.0％BSA的处理液中，于4℃条件下浸泡2小时；然后于37℃下烘干2小时，备用。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述荧光纳米颗粒发射的波长范围是600-630nm。
3.一种利用权利要求1所述的头孢氨苄残留荧光免疫层析检测试纸条检测头孢氨苄残留的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)样品前处理：牛奶样品离心，条件为转速12000r/min，时间为10分钟，脱脂后直接测定；
(2)用试纸条检测：在试纸条的上样点直接滴加上述离心脱脂牛奶样品，层析15-20分钟后，测615nm处的荧光强度值；
(3)检测结果分析：
用所获得的每个浓度的标准品溶液的检测线的荧光强度平均值(H)除以第一个标准品溶液(0标准)的检测线荧光强度值(H0)再乘以100％，得到百分检测线荧光强度值；计算公式为：百分检测线荧光强度值(％)＝(H/H0)×100％；公式中H为标准溶液的检测线平均荧光强度值，H0为0μg/L标准溶液的检测线平均荧光强度值；以头孢氨苄标准品浓度的半对数值为X轴，百分检测线荧光强度值为Y轴，绘制标准曲线图；用同样的办法计算样品溶液的百分检测线荧光强度值，相对应出一个样品的浓度，从标准曲线上读出样品中头孢氨苄的残留量。
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