CN103901020B - 以电化学发光生物传感器检测dna 甲基转移酶的方法及应用 - Google Patents
以电化学发光生物传感器检测dna 甲基转移酶的方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103901020B CN103901020B CN201410128514.5A CN201410128514A CN103901020B CN 103901020 B CN103901020 B CN 103901020B CN 201410128514 A CN201410128514 A CN 201410128514A CN 103901020 B CN103901020 B CN 103901020B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electrode
- graphene oxide
- transmethylase
- phenanthroline ruthenium
- electrochemiluminescence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及的一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法,将S1含有甲基化位点GATC的发夹DNA序列自组装在金电极的表面,组成电化学发光生物传感器;将修饰电极用甲基转移酶甲基化,再用甲基化限制性内切酶酶切,淋洗后,用S2带氨基的互补DNA进行杂交,再将氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物通过EDC-NHS的耦合连接到电极上进行电化学发光检测,以此来实现对甲基转移酶的测定。本发明采用氧化石墨烯提供相对大的比表面积用于负载邻菲啰啉钌,且氧化石墨烯与邻菲啰啉钌是非共价结合,能有效地负载和易于操作并且能保持氧化石墨的电子结构,以此为发光材料使本发明的传感器对甲基转移酶有很高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及电化学发光生物传感器,具体涉及一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法及应用。
背景技术
DNA甲基化在许多生物过程中有重要的作用,包括转录,基因组印记,细胞分化,染色质结构和胚胎形成。研究发现许多人类的疾病与异常基因甲基化有关。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNA MTase)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在GATC和CCA/TGG上,即腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位。这种异常的DNA甲基转移酶的活性与癌症的发病机制有关,这种关系提供了一个在疾病的诊断和治疗的潜在目标。此外,DNA MTase是用于治疗癌症的药理学家族的新成员。因此,一种灵敏、快速的检测DNA甲基化及DNA MTase活性的方法无疑对癌症的早期诊断提供了强有力的手段,为研究基因调控的基本机制提供了见解,同时为研发新的抗癌药物提供了依据。用于DNA甲基化转移酶活性的测定的传统的方法依赖放射性同位素标记的基底,基于PCR的不同技术,毛细管电泳和高效液相色谱。这些方法时间密集,耗费DNA,需要费力的处理和特殊的同位素标记。
电化学发光(电致化学发光),简称ECL,是通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流,电极氧化还原产物之间或电极氧化还原产物与体系其它共存物质之间发生化学反应并生成某种不稳定的中间态物质,该物质分解而产生的化学发光现 象。电化学发光技术是电化学与化学发光相结合的检测技术,该技术既集成了发光与电化学分析技术的优点,又具有二者结合产生的可控性、选择性、重现性好、灵敏度高、检测限低及动力学响应范围宽等新优势。
发明内容
针对测定DNA甲基转移酶的现有技术灵敏度不高、测定方法复杂等缺陷,本发明旨在提供一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法及应用。
申请人拟设计含有甲基化特定位点的发夹DNA捕获探针,利用限制性内切酶对识别位点甲基化敏感的特性,以不同的甲基转移酶为例,建立快速甲基转移酶活性的分析方法。同时,用此方法考察不同抗癌药物对于甲基化转移酶活性的影响,建立了一种在分子水平进行药物筛选的新思路。本发明充分利用了核酸甲基化转移酶、限制性内切酶和核酸分子探针的性质和功能,进一步发展了核酸分子技术在DNA-蛋白质(酶)相互作用研究中的应用,为研究生命活动过程提供了新的手段和方法。
邻菲啰啉钌(Ru(phen)3 2+)是常用的电化学发光物质,由于其良好的性能即在中性水溶液中能够稳定存在并且具有高灵敏度,因此在电化学发光传感器中得到了广泛的研究。近年来,纳米材料成为人们研究的热点领域,因此各种纳米材料被用来负载Ru(phen)3 2+和钌联吡啶(Ru(bpy)3 2+)。氧化石墨烯(GO)是单层的氧化石墨构成的,因为具有高的表面体积比、在水中和有机溶剂中高的可分散性和它表面结合的广泛的活性官能团,使得基于氧化石墨烯的材料在生物传感的研究和应用有独特的吸引力。最近石墨烯组装Ru(bpy)3 2+复合物已经被报道,例如,利用全氟磺酸将Ru(bpy)3 2+固定在石墨烯上用于TPA的电化学发光检测显示了很好的灵敏性和稳定性。氧化石墨烯组装硫堇放大信号电化学检测DNA甲基转移酶的应用也已经有报 道(Wen Li,Ping Wu,Hui Zhang,and Chenxin Cai.Analytical Chemistry,2012,84,7583-7590)。与电化学发光试剂Ru(bpy)3 2+相比,Ru(phen)3 2+具有更好的吸附性,氧化石墨烯带有负电荷且其基面上还含有很多π共轭芳香基团,因此易于通过静电作用、π-π堆积作用与Ru(phen)3 2+强烈结合并具有出色的长期稳定性(Scott Gilje,Song Han,Minsheng Wang,Kang L.Wang,and Richard B.Kaner,Nano Letters,2007,7,3394-3398;Yali Yuan,Haijuan Li,Shuang Han,Lianzhe Hu,Saima Parveen,Haoran Cai,and Guobao Xu.Anal.Chim.Acta,2012,720,38–42.)。因此,基于氧化石墨烯对邻菲啰啉钌高负载能力、良好的生物相容性和稳定性,我们设计一种基于氧化石墨烯负载电化学发光活性物质对甲基酶活性的分析方法。
本发明提供一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法,包括如下步骤:
1)将S1通过金巯键自组装固定在金电极上;所述S1为含有甲基化位点GATC的发夹DNA;
2)以待测甲基转移酶(Dam MTase)对步骤1)固定在电极上的S1进行甲基化;
3)用甲基化限制性内切酶(Dpn I)酶切步骤2)甲基化后的S1;
4)以S2与步骤3)酶切后保留在电极上的S1杂交;所述S2为带氨基的互补DNA;
5)把氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物(Ru(phen)3 2+/GO)通过EDC-NHS的耦合连接到步骤4)杂交后的电极上;
6)对步骤5)的电极进行电化学发光检测,由此测定待测的甲基转移酶活性。
其中,所述S1的序列如下:
5’-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGATCGCAAT-3’(如SEQ ID No.1所示)。
其中,所述S2的序列如下:
5’-NH2-(CH2)6-TCGCAATCAGTA-3’(如SEQ ID No.2所示)。
其中,步骤1)所述将S1通过金巯键固定在金电极上,具体步骤为:将金电极浸入到2μM S1的500uL的缓冲溶液中37℃固定4小时,在金电极表面形成自组装膜,用PBS溶液淋洗去除非特异性吸附的S1,再用1mM的6-巯基己醇(MCH)封闭,用PBS溶液淋洗金电极。
其中,步骤1)所述金电极为按如下方法预处理后的金电极:
在麂皮上分别用0.3和0.05μm的氧化铝粉末抛光打磨至镜面,再用水、无水乙醇分别超声洗涤2min,以除去电极表面粘附的氧化铝粉末,最后用Milli-Q水淋洗干净,然后将电极置于0.1mol/L H2SO4溶液中在﹣0.2~1.6V(vs.Ag∕AgCl)电位范围内以100mV/s的扫速扫描至得到稳定的循环伏安图,随后用Milli-Q水淋洗电极,并用N2吹干保存备用。
其中,步骤1)所述金电极的直径优选为2mm。
其中,步骤2)所述进行甲基化,所用反应体系为500μL1×Dam buffer(50mM pH7.5的Tris-HCl,10mM NaCl,10mM EDTA,5mM巯基乙醇)和160mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和待测甲基转移酶。
其中,步骤2)所述进行甲基化,所用反应条件为37℃保温60min。
其中,步骤3)所述酶切,所用反应体系为500μL1×NEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,1mM DTT,pH7.9)和80U Dpn I。
其中,步骤3)所述酶切,所用反应条件为37℃保温2h。
其中,步骤4)所述杂交,所用反应体系为5μL2.0μM S2带氨基的互补DNA,10mM Tris-HCl buffer,pH7.4。
其中,步骤5)所述氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物,通过如下方法制备:把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg邻菲啰啉钌的5 mL水溶液中,超声15分钟,室温搅拌过夜,超声5分钟,每分钟8000转离心10分钟去除多余的邻菲啰啉钌,去离子水和无水乙醇洗涤,干燥,得到氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物。
其中,所述氧化石墨烯以Hummers法制备。Hummers法制备的具体步骤优选为在冰水浴中,将59g石墨粉和2.59g硝酸钠与115mL的浓硫酸混合均匀,搅拌中缓慢加入15g KMnO4,保持2℃以下持续反应l h,将其转移至35℃水浴,反应30min逐步加入250mL去离子水,温度升至98℃继续反应15min后,可明显观察到混合物由棕褐色变成亮黄色,进一步连续加水稀释,并用质量百分含量30%的H2O2,溶液处理,中和未反应的高锰酸钾,将上述溶液趁热抽滤除去大部分的水和强酸等,再将滤饼放入透析袋中,在体积百分含量的5%HCI溶液中洗涤,以除去金属离子,再在蒸馏水中反复洗涤直到成中性,抽滤并将滤饼放入烘箱中80℃充分干燥得到氧化石墨烯。
其中,步骤5)把氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物通过EDC-NHS的耦合连接到步骤4)杂交后的电极上,具体为把氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物使用前在EDC-NHS混合溶液中(5mM EDC,10mM NHS in Tris-HCl buffer,pH7.4)活化30min,把步骤4)杂交后的电极浸没在500μL1mg/mL的氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物溶液中180min,S2上的氨基和氧化石墨烯活化的羧基反应,使得氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物共价连接到步骤4)杂交后的电极上。
其中,步骤6)所述进行电化学发光检测,检测液为含有0.02mol/LTPA的0.1mol/L PBS溶液2.0mL。
其中,步骤6)所述进行电化学发光检测,在室温下进行,将电解池置于暗盒中,连接好三电极体系,在0~+1.25V的电位范围内,以100mV/s的扫速进行循环伏安扫描,记录其ECL信号并进行定量分析。
本发明的另一目的是提供所述电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法的应用。
本发明的优点是:
与现有技术相比,本发明涉及的电化学发光生物传感器具有如下的优点和显著地进步:采用氧化石墨烯提供相对大的比表面积用于负载邻菲啰啉钌,并且氧化石墨烯对邻菲啰啉钌的负载采用的是非共价结合,相比于共价结合,非共价结合通过超分子反应如π-π堆积能有效地负载和易于操作并且能保持氧化石墨的电子结构。另外,根据实验发光强度可以看出,氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物可以作为发光材料,并且对于没有甲基转移酶或者剪切酶的情况下,发光强度远远低于有甲基转移酶和剪切酶的情况,这说明该传感器对甲基转移酶检测有很高的选择性。因此,本发明设计的基于氧化石墨烯电化学发光传感器在构建对一些工具酶的研究方法中体现出良好地发展前景。
附图说明
图1为本发明以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法的流程图。
图2为不同修饰电极的电化学阻抗图(EIS)图。其中,a为裸金电极;b为S1修饰电极;c为MCH/S1修饰电极;d为MCH/S1修饰电极先后经Dam和Dpn I处理后的电极;e为Ru(phen)3 2+/GO/S2/MCH/S1修饰电极。
图3为不同修饰阶段的电极经不同处理后的电化学发光曲线图。其中,a为1mg/mL Ru(phen)3 2+/GO和0.02M TPA;b为S1修饰电极经Dam、DpnI和S2、Ru(phen)3 2+/GO;c为S1修饰电极经DpnI和S2、Ru(phen)3 2+/GO;d为S1修饰电极直接和S2、Ru(phen)3 2+/GO;e为S3修饰电极经Dam、DpnI和S2、Ru(phen)3 2+/GO。
图4为发夹DNA的甲基化时间优化结果图。
图5为Ru(phen)3 2+/GO浓度优化结果图。
图6为Ru(phen)3 2+/GO的耦合时间优化结果图。
图7为实施例1中氧化石墨烯(GO)和Ru(phen)3 2+/GO的表征图。其中,A为GO的透射电镜图,B为Ru(phen)3 2+/GO的透射电镜图,C为GO和Ru(phen)3 2+/GO的拉曼光谱,D为Ru(phen)3 2+/GO的能谱图。
图8为实施例1中不同浓度甲基转移酶的ECL信号测定结果图。其中,A为不同浓度甲基转移酶的ECL信号响应,曲线a-j分别是浓度0,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,5.0,10,20,40U/mL;B为甲基转移酶浓度与ECL信号的线性关系图。
图9为实施例2中不同庆大霉素浓度影响甲基转移酶活性的测定结果图。其中,A为不同庆大霉素浓度处理后ECL信号响应,B为不同浓度庆大霉素与相对活性曲线图,庆大霉素的浓度分别是0,0.1,0.3,0.5,0.8,1.0,2.0μM。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
本发明涉及的一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法,将S1含有甲基化位点GATC的发夹DNA序列自组装在金电极的表面,组成电化学发光生物传感器;将修饰电极用甲基转移酶甲基化,再用甲基化限制性内切酶切割,淋洗后,用S2带氨基的互补DNA进行杂交,再将氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物通过EDC-NHS的耦合连接到电极上进行电化学发光检测,以此来实现对甲基转移酶的测定。
本发明是一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法,具体的实验原理如图1所示,包括以下步骤:
1)将金电极(即裸金电极)侵入到2μM S1的500uL的缓冲溶液中37℃固定4小时,在金电极表面形成自组装膜,用PBS溶液淋 洗去除非特异性吸附的S1,得到S1修饰电极,再用1mM的6-巯基己醇封闭,用PBS溶液淋洗,得到MCH/S1修饰电极。金电极需预先进行如下处理:在麂皮上分别用0.3和0.05μm的氧化铝粉末抛光打磨至镜面,再用水、无水乙醇分别超声洗涤2min,以除去电极表面粘附的氧化铝粉末,最后用Milli-Q水淋洗干净,然后将电极置于0.1mol/L H2SO4溶液中在﹣0.2~1.6V(vs.Ag∕AgCl)电位范围内以100mV/s的扫速扫描至得到稳定的循环伏安图,随后用Milli-Q水淋洗,并用N2吹干保存备用。
2)对发夹DNA进行甲基化,其中甲基化体系500μL包括50mM Tris-HCl pH7.5,10mM NaCl,10mM EDTA,5mM巯基乙醇(2-mercaptohexanol),160mM SAM和不同浓度的待测甲基转移酶Dam MTase,37℃保温60min。
3)将甲基化的修饰电极用限制性内切酶Dpn I酶切,其中酶切体系500μL包括1×NEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,1mM DTT,pH7.9)和80U Dpn I,37℃保温2h。得到的电极为MCH/S1修饰电极先后经Dam和Dpn I处理后的电极。
4)将酶切过的修饰电极浸没在5μL包含2.0μM S2DNA探针(in10mM Tris-HCl buffer,pH7.4),使保留在电极上的DNA末端与S2DNA杂交。
5)利用Hummers法制备出氧化石墨烯,再进一步合成氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物(Ru(phen)3 2+/GO);
Ru(phen)3 2+/GO使用前在EDC-NHS混合溶液中(5mM EDC,10mM NHS in Tris-HCl buffer,pH7.4))活化30min;把杂交后的电极浸没在500μL1mg/mL的Ru(phen)3 2+/GO溶液中180min,得到Ru(phen)3 2+/GO/S2/MCH/S1修饰电极。
6)将修饰好的电极进行电化学发光测量,测量体系2.0mL0.10MPBS(pH7.4)包含0.02M三丙胺(TPA)。
针对上述不同修饰阶段的电极绘制电化学阻抗图,见图2。
为实验上述不同修饰阶段的电极经不同处理后的电化学发光行为,设置了5个处理:a金电极经0.10M PBS(pH7.4)包含1mg/mL Ru(phen)3 2+/GO和0.02M TPA处理;b MCH/S1修饰的电极先后经100U/mL Dam,50U/mL Dpn I处理,S2杂交和Ru(phen)3 2+/GO复合物耦合;c MCH/S1修饰的电极直接经50U/mL Dpn I处理,S2杂交和Ru(phen)3 2+/GO复合物耦合;d MCH/S1修饰的电极与S2杂交和Ru(phen)3 2+/GO复合物耦合;e MCH/S3修饰的电极分别经100U/mL Dam,50U/mL Dpn I处理,S2杂交和Ru(phen)3 2+/GO复合物耦合。ECL测量在0.10M PBS(pH7.4)包含0.02M TPA中进行;扫描速度:0.1V/s,扫描范围:0-+1.25V。
其中,S1为含有甲基化位点GATC的发夹DNA序列:5’-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGA TCGCAAT-3’(如SEQ ID No.1所示)
S2为带氨基的互补DNA序列:5’-NH2-(CH2)6-TCGCAATCAGTA-3’(如SEQ ID No.2所示)
S3为不含有甲基化位点GATC的对照发夹DNA序列:5’-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGACTGAGAATGCTTTTGCATTCTCGA CTG CAAT-3’(如SEQ ID No.3所示)
具体结果见如图3,采用S1含有甲基化位点GATC的对照发夹DNA的处理b电化学发光行为明显,而采用S3不含有甲基化位点GATC的对照发夹DNA的处理e检测到非常弱电化学发光行为。且氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物作为发光材料在没有甲基转酶或者剪切酶的情况下发光强度远低于有甲基转移酶和剪切酶的情况,因此本发明的传感器对甲基转移酶检测有很高的选择性。
发明人还对本发明中的检测条件进行了优化,具体如下:
(1)发夹DNA的甲基化时间。对甲基化处理设置0-120分钟的 不同的时间长度(20U/mL Dam,1mg/mL Ru(phen)3 2+/GO,Ru(phen)3 2+/GO和S2探针耦合300min,其他参照上述步骤1)-6)进行),在实验结果如图4所示,在甲基化时间60min时能达到发光强度的99%,在120min时达到最大,为了节省整个测试过程的时间,我们选择甲基化时间为60min。
(2)Ru(phen)3 2+/GO浓度。对Ru(phen)3 2+/GO浓度设置0-3.0mg/mL的不同的浓度梯度(20U/mL Dam甲基化60min,Ru(phen)3 2+/GO和S2探针耦合300min,其他参照上述步骤1)-6)进行),实验结果如图5所示,Ru(phen)3 2+/GO浓度在0到0.5mg/mL时电化学发光强度增加的很快,在1mg/mL是达到最大值,因此,我们选择Ru(phen)3 2+/GO浓度为1mg/mL。
(3)Ru(phen)3 2+/GO的耦合时间。对Ru(phen)3 2+/GO耦合时间设置不同的长度(20U/mL Dam甲基化60min,1mg/mL Ru(phen)3 2+/GO,其他参照上述步骤1)-6)进行),实验结果如图6所示,耦合时间在10到100min时电化学发光强度增加的很快,在180min是达到最大信号值,因此,我们选择耦合时间为180min。
实施例1电化学发光生物传感器检测甲基转移酶浓度
1.实验部分
1.1仪器和试剂
MPI–E型电致化学发光分析***(西安瑞迈分析仪器有限公司);CHI660D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司);TGL–16G型离心机(上海安亭科学仪器厂);KH3200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);Milli-Q型超纯水仪(美国Millipore公司);实验采用三电极***:修饰有发夹DNA的金电极工作电极,Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极,铂丝电极为对电极。
石墨粉(99.998%),三-(2-羧乙基)磷酸盐酸盐(TCEP,98%),N-羟基丁二酰亚胺(NHS),乙基{3-(二甲氨基)丙基﹜碳二亚胺盐酸盐(EDC),三丙胺(TPA),6-巯基己醇(MCH),邻菲啰啉钌 (Ru(phen)3 2+),以上试剂都购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)有限公司,使用时无需二次纯化。S-腺苷甲硫氨酸(SAM),E.coli甲基转移酶Dam,E.coli限制性内切酶Dpn I购买于北京纽英伦生物技术有限公司。寡聚核苷酸链购自上海生物工程有限公司,碱基序列如下:
S1(含有甲基化位点GATC的发夹DNA):
5’-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTC GATCGCAAT-3’(如SEQ ID No.1所示)
S2(带氨基的互补DNA):
5’-NH2-(CH2)6-TCGCAATCAGTA-3’(如SEQ ID No.2所示)
S3(不含有甲基化位点GATC的对照发夹DNA):
5’-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGACTGAGAATGCTTTTGCATTCTC GACTG CAAT-3’(如SEQ ID No.3所示)
1.2实验步骤
1.2.1氧化石墨烯以及Ru(phen)3 2+/GO复合物的合成
冰水浴中,将59g石墨粉和2.59g硝酸钠与115mL的浓硫酸混合均匀,搅拌中缓慢加入15g KMnO4,保持2℃以下持续反应l h,将其转移至35℃水浴,反应30min逐步加入250mL去离子水,温度升至98℃继续反应15min后,可明显观察到混合物由棕褐色变成亮黄色,进一步连续加水稀释,并用质量百分含量30%的H2O2,溶液处理,中和未反应的高锰酸钾,将上述溶液趁热抽滤除去大部分的水和强酸等,再将滤饼放入透析袋中,在体积百分含量的5%HCI溶液中洗涤,以除去金属离子,再在蒸馏水中反复洗涤直到成中性,抽滤并将滤饼放入烘箱中80℃充分干燥得到氧化石墨烯。
把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg的邻菲啰啉钌的5mL的水溶液中,对混合溶液超声15分钟后,在室温下搅拌过夜。之后对混合溶液超声5分钟,用每分钟8000转离心10分钟去除多余的邻菲啰啉钌,接着用去离子水和无水乙醇进行洗涤,最后在真空干燥箱中干燥,得到Ru(phen)3 2+/GO。
制得的氧化石墨烯(GO)和Ru(phen)3 2+/GO复合物的表征图见图7。
图7A为GO的透射电镜图(TEM),B为Ru(phen)3 2+/GO的透射电镜图(TEM),图中合成的氧化石墨烯及其复合物层数很少,呈半透明并且有一些褶皱。图7C为GO和Ru(phen)3 2+/GO的拉曼光谱,从图中可以看出样品的D和G峰,ID/IG的比率经常可以用作展示石墨的碳样品上的化学修饰水平。GO和Ru(phen)3 2+/GO的ID/IG比率分别是0.78和0.81,这个增加的比率反映了无序程度的增加,因为氧化石墨烯上的供体原子导致的。此外,图7D为Ru(phen)3 2+/GO的能谱图,由图中可以看出这个复合物由三种元素构成,说明Ru(phen)3 2+/GO复合物的合成成功。
1.2.2电化学发光生物传感器的构建
1.金电极的处理。金电极(Φ=2mm)在麂皮上分别用0.3和0.05μm的氧化铝粉末仔细抛光打磨至镜面,再用水、无水乙醇分别超声洗涤2min,以除去电极表面粘附的氧化铝粉末,最后用Milli-Q水淋洗干净。然后将电极置于0.1mol/L H2SO4溶液中在﹣0.2~1.6V(vs.Ag/AgCl)电位范围内以100mV/s的扫速扫描至得到稳定的循环伏安图,随后用Milli-Q水淋洗,并用N2吹干保存备用。
2.电化学发光生物传感器的制备。将处理过的金电极侵入到2μMS1的500uL的缓冲溶液中37℃固定4小时,在金电极表面形成自组装膜,用PBS溶液淋洗去除非特异性吸附的S1,再用1mM的6-巯基己醇封闭,用PBS溶液淋洗金电极。从而制得电化学发光生物传感器。
1.2.3电化学发光检测DNA甲基转移酶
对发夹DNA进行甲基化,其中甲基化体系500μL包括50mM Tris-HCl pH7.5,10mM NaCl,10mM EDTA,5mM2-mercaptohexanol,160mM SAM和不同浓度的Dam MTase,37℃保温60min;将甲基化的修饰电极用限制性内切酶Dpn I酶切,其中酶切体系500μL包括1×NEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac,10 mM Mg(Ac)2,1mM DTT,pH7.9)和80U Dpn I,37℃保温2h;将酶切过的修饰电极浸没在5μL包含2.0μM S2DNA探针(in10mM Tris-HCl buffer,pH7.4),使保留在电极上的DNA末端与S2DNA杂交。把杂交后的电极浸没在500μL1mg/mL的Ru(phen)3 2+/GO溶液中180min;将修饰好的电极进行电化学发光测量,测量体系2.0mL0.10M PBS(pH7.4)包含0.02M TPA,将电解池置于暗盒中,连接好三电极,在0-+1.25的电位范围内,以0.1V/s的扫速进行循环伏安扫描记录其ECL信号并进行定量分析,结果见图8。
1.3结果与讨论
本发明在优选的最佳的实验条件下,研究了不同浓度的甲基转移酶与电化学发光强度的关系,得到了甲基转移酶的标准曲线,线性范围及线性方程。
在最佳的实验条件下,当甲基转移酶的浓度在0.05U/mL至40U/mL范围内,随着甲基转移酶Dam浓度的增加,电化学发光信号逐渐增强,其线性方程为I=912.32+545.78lgC(C的单位U/mL),r=0.9976。
与已报道的用于检测MTase活性的方法比较,结果见表1:本发明的方法线性范围更宽,检出限更低(0.02U/mL,S/N=3)。0.5U/mL的甲基转移酶的相对标准偏差是4.65%(n=5)。表明此方法有较好的灵敏度和重现性。
表1不同检测甲基转移酶方法的检出限
[1]Zheng,X.J.,Qiu,J.D.,Zhang,L.,Wang,Z.X.,Liang,R.P.,2013.Chemical Communications49,3546-3548.
[2]Wang,G.L.,Zhou,L.Y.,Luo,H.Q.,Li,N.B.,2013.Analytica Chimica Acta768,76–81.
[3]He,X.X.,Su,J.,Wang,Y.H.,Wang,K.M.,Ni,X.Q.,Chen,Z.F.,2011.Biosensors and Bioelectronics28,298–303.
[4]Wang,Y.H.,He,X.X.,Wang,K.M.,Su,J.,Chen,Z.F.,Yan,G.P.,Du,Y.D.,2013.Biosensors and Bioelectronics41,238-243.
[5]Ouyang,X.Y.,Liu,J.H.,Li,J.S.,Yang,R.H.,2012.Chemical Communications48,88–90.
实施例2电化学发光生物传感器评估抑制剂对甲基转移酶活性影响
以庆大霉素为模型,考察了该药物对Dam甲基转移酶活性影响:设置甲基转移酶浓度为40U/mL,在其中加入不同浓度庆大霉素,其他步骤同实施例1。
结果见图9。Dam甲基转移酶活性随着庆大霉素药物浓度的增加而降低,且抑制作用与药物浓度正相关,当0.3uM庆大霉素加入到40U/mL甲基转移酶体系时,化学发光强度下降了16%。这个结果表明了发明的这个电化学发光生物传感器可以用于对抗癌药物的筛选。
本发明是基于氧化石墨烯的扩增技术研制的一种高灵敏检测甲基转移酶的电化学发光生物传感器。研制的传感器具有如下优势:氧化石墨烯提供相对大的比表面积用于负载邻菲啰啉钌;氧化石墨烯对邻菲啰啉钌的组装采用的是非共价结合,相比于共价结合非共价结合通过超分子反应如π-π堆积能有效地负载和易于操作并且能保持氧化石墨的电子结构。因此设计的传感器操作简单,灵敏度 高,对一些工具酶的研究方法中体现出良好地发展前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种以电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)将S1通过金巯键自组装固定在金电极上;所述S1为含有甲基化位点GATC的发夹DNA序列;
2)以待测甲基转移酶对步骤1)固定在电极上的S1进行甲基化;
3)用甲基化限制性内切酶酶切步骤2)甲基化后的S1;
4)以S2与步骤3)酶切后保留在电极上的S1杂交;所述S2为带氨基的互补DNA;
5)把氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物通过EDC-NHS的耦合连接到步骤4)杂交后的电极上;
6)对步骤5)的电极进行电化学发光检测,由此测定待测的甲基转移酶。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述S1的序列如下:
5’-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGATCGCAAT-3’;
所述S2的序列如下:
5’-NH2-(CH2)6-TCGCAATCAGTA-3’。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述将S1通过金巯键自组装固定在金电极上,具体步骤为:将金电极浸入到2μM S1的500uL的缓冲溶液中37℃固定4小时,在金电极表面形成自组装膜,用PBS溶液淋洗去除非特异性吸附的S1,再用1mM的6-巯基己醇封闭,用PBS溶液淋洗金电极。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述进行甲基化,所用反应体系为500μL 1×Dam buffer和160mM S-腺苷甲硫氨酸和待测甲基转移酶;所述Dam buffer包括50mM pH 7.5的Tris-HCl,10mM NaCl,10mM EDTA,5mM巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述进行甲基化,所用反应条件为37℃保温60min。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)所述酶切,所用反应体系为500μL 1×NEB buffer 4和80U Dpn I;所述NEB buffer 4包括50mM KAc,20mM Tris-Ac,10mM Mg(Ac)2,1mMDTT,pH 7.9。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述杂交,所用反应体系为5μL 2.0μM S2带氨基的互补DNA,10mMTris-HCl buffer,pH 7.4。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)所述氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物,通过如下方法制备:把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg邻菲啰啉钌的5mL水溶液中,超声15分钟,室温搅拌过夜,超声5分钟,每分钟8000转离心10分钟去除多余的邻菲啰啉钌,去离子水和无水乙醇洗涤,干燥,得到氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤5)把氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物通过EDC-NHS的耦合连接到步骤4)杂交后的电极上,具体为把氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物使用前在EDC-NHS混合溶液中活化30min,把步骤4)杂交后的电极浸没在500μL 1mg/mL的氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物溶液中180min,S2上的氨基和氧化石墨烯活化的羧基反应,使得氧化石墨烯负载邻菲啰啉钌复合物共价连接到步骤4)杂交后的电极上;所述EDC-NHS混合溶液是指EDC浓度为5mM,NHS浓度为10mM且pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液。
10.权利要求1-9任一项所述电化学发光生物传感器检测DNA甲基转移酶的方法的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410128514.5A CN103901020B (zh) | 2014-03-31 | 2014-03-31 | 以电化学发光生物传感器检测dna 甲基转移酶的方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410128514.5A CN103901020B (zh) | 2014-03-31 | 2014-03-31 | 以电化学发光生物传感器检测dna 甲基转移酶的方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103901020A CN103901020A (zh) | 2014-07-02 |
CN103901020B true CN103901020B (zh) | 2015-10-21 |
Family
ID=50992481
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410128514.5A Expired - Fee Related CN103901020B (zh) | 2014-03-31 | 2014-03-31 | 以电化学发光生物传感器检测dna 甲基转移酶的方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103901020B (zh) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103323494B (zh) * | 2013-06-06 | 2015-08-26 | 江苏大学 | 一种基于石墨烯传感器检测dna突变的方法 |
CN104062334A (zh) * | 2014-07-11 | 2014-09-24 | 福州大学 | 一种针对dna甲基化监测的定量分析方法 |
CN104990973B (zh) * | 2015-07-06 | 2017-12-15 | 济南大学 | 一种固载甲基转移酶电极传感器的制备及应用 |
CN108627507A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-10-09 | 南昌大学 | 一种dna甲基转移酶活性的检测方法 |
CN109580597B (zh) * | 2019-01-28 | 2020-10-13 | 青岛科技大学 | 一种基于dna纳米管的电化学发光生物传感器及其制法和应用 |
CN113607794B (zh) * | 2021-07-30 | 2024-02-09 | 青岛科技大学 | 石墨烯修饰的电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070264672A1 (en) * | 2006-05-09 | 2007-11-15 | Bimalendu Dasmahapatra | Development of a novel assay for mgmt (methyl guanine methyl transferase) |
CN102707060B (zh) * | 2012-05-31 | 2015-05-20 | 杭州师范大学 | 一种检测mgmt活性的化学发光检测试剂盒及检测方法 |
CN102798717B (zh) * | 2012-06-15 | 2014-11-26 | 杭州师范大学 | 一种o6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶活性检测方法 |
-
2014
- 2014-03-31 CN CN201410128514.5A patent/CN103901020B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103901020A (zh) | 2014-07-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103901020B (zh) | 以电化学发光生物传感器检测dna 甲基转移酶的方法及应用 | |
Cui et al. | An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification | |
Li et al. | Supportless electrochemical sensor based on molecularly imprinted polymer modified nanoporous microrod for determination of dopamine at trace level | |
Amiri et al. | Electrocatalytic determination of sumatriptan on the surface of carbon-paste electrode modified with a composite of cobalt/Schiff-base complex and carbon nanotube | |
Wang et al. | β-Cyclodextrin incorporated carbon nanotubes-modified electrodes for simultaneous determination of adenine and guanine | |
Liu et al. | A highly sensitive method for determination of guanine, adenine and epinephrine using poly-melamine film modified glassy carbon electrode | |
Yang et al. | Electrochemical determination of toxic ractopamine at an ordered mesoporous carbon modified electrode | |
Zhang et al. | Decorating graphene sheets with gold nanoparticles for the detection of sequence-specific DNA | |
Bagheri et al. | Facile stripping voltammetric determination of haloperidol using a high performance magnetite/carbon nanotube paste electrode in pharmaceutical and biological samples | |
Lin et al. | Simultaneous determination for toxic ractopamine and salbutamol in pork sample using hybrid carbon nanotubes | |
Zhu et al. | Single-walled carbon nanotubes modified carbon ionic liquid electrode for sensitive electrochemical detection of rutin | |
Li et al. | A high effect polymer-free covalent layer by layer self-assemble carboxylated MWCNTs films modified GCE for the detection of paracetamol | |
Shahrokhian et al. | Multi-walled carbon nanotube paste electrode for selective voltammetric detection of isoniazid | |
Sheng et al. | Ultrasensitive electrochemical ***e biosensor based on reversible DNA nanostructure | |
Ge et al. | based biosensor relying on flower-like reduced graphene guided enzymatically deposition of polyaniline for Pb2+ detection | |
Zhu et al. | Simultaneous voltammetric determination of dihydroxybenzene isomers at single-walled carbon nanohorn modified glassy carbon electrode | |
Chang et al. | Carboxymethyl cellulose assisted preparation of water-processable halloysite nanotubular composites with carboxyl-functionalized multi-carbon nanotubes for simultaneous voltammetric detection of uric acid, guanine and adenine in biological samples | |
Wang et al. | Studies on electrochemical behaviors of acyclovir and its voltammetric determination with nano-structured film electrode | |
Xu et al. | Tetrahedral DNA framework based CRISPR electrochemical biosensor for amplification-free miRNA detection | |
Rezaei et al. | Nanolayer treatment to realize suitable configuration for electrochemical allopurinol sensor based on molecular imprinting recognition sites on multiwall carbon nanotube surface | |
Yang et al. | Electrochemical biosensor for Ni2+ detection based on a DNAzyme-CdSe nanocomposite | |
Asghary et al. | A novel self-powered and sensitive label-free DNA biosensor in microbial fuel cell | |
Yin et al. | Electrochemical biosensor for hydroxymethylated DNA detection and β-glucosyltransferase activity assay based on enzymatic catalysis triggering signal amplification | |
Lin et al. | Monolayer modification of glassy carbon electrode by using propionylcholine for selective detection of uric acid | |
Baig et al. | A cost-effective disposable graphene-based sensor for sensitive and selective detection of uric acid in human urine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20151021 Termination date: 20180331 |