CN103897085A

CN103897085A - 一种苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）及其合成、以及荧光探针的制备

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Publication number: CN103897085A
Application number: CN201410077054.8A
Authority: CN
Inventors: 王国杰; 张瑞辰; 许琛; 周茹意
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2014-03-04
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: CN103897085B

Abstract

本发明涉及一种苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）及其合成、以及荧光探针的制备，属于功能高分子技术、分析化学和生物分析化学领域。本发明所述的合成方法为将苝甲溴接枝到聚（4-乙烯基吡啶）上；将上述产物用碘甲烷质子化得到苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM阳离子聚电解质；并公开了应用上述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）制备荧光探针的方法。本发明公开的非共轭聚电解质PFPM的合成方法容易操作，当PFPM溶液中加入DNA形成复合探针时，PFPM会产生聚集，荧光强度增加；本发明是嵌插作用和聚集诱导发光的双重检测机理，此前未曾报道过，且对于今后的研究有很好的借鉴意义。

Description

一种苝接枝的聚(4-乙烯基吡啶)及其合成、以及荧光探针的制备

技术领域

本发明属于功能高分子技术、分析化学和生物分析化学领域，涉及一种水溶性、具有聚集诱导发光性质的荧光聚电解质的合成方法以及利用这种聚电解质制备检测寡核酸序列的荧光探针的方法。

背景技术

功能高分子是在其大分子链中结合了特定的功能基团，或大分子与具有特定功能的其他材料进行了复合，或者二者兼而有之而形成的具有某种特定功能的高分子材料，其在生物分析化学领域，尤其是在生物大分子检测方面的应用已经引起国内外学者的密切关注。利用具有荧光特性的功能高分子作为荧光探针对核酸进行特异性识别已经成为当前国际研究热点。

标记型荧光探针是指将荧光基团通过共价键连接到单链或复链寡聚核酸分子上，这种荧光标记的分子探针只能与碱基序列互补的核酸分子通过 Watson-Crick 碱基配对法则形成杂化复链，靶向杂化前后的荧光性能发生重大变化，从而实现了荧光探针特异性识别核酸分子。1996年，Tyagi和Kramer首次在同一个寡核苷酸探针的5′末端标记一种荧光素、3′末端标记一种荧光淬灭剂，共同建立了分子信标探针模型。但是标记型的荧光探针制备过程较为复杂，因此一些研究人员着手发展非标记型荧光探针，比较有代表性的为通过荧光嵌入剂或通过荧光大分子构象的变化来达到检测核酸的目的，当目标单链与探针单链互不配对时，荧光嵌入剂可嵌插到双链结构中，通过荧光共振能量转移作用发光增强，或者通过荧光大分子的构象变化引起荧光信号的变化，以此判断目标核酸是否与探针核酸互补配对。

上述实验的荧光能量共振转移效率不够高，从而影响了产物的荧光效率及测试结果。

发明内容

本发明的目的在于合成一种水溶性的、具有聚集诱导发光性质的阳离子聚电解质苝功能化的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM，并用该聚电解质和单链寡聚核苷酸制备复合探针来检测目标DNA特定的碱基序列。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成，合成方法为将苝甲溴接枝到聚（4-乙烯基吡啶）上；将上述产物用碘甲烷质子化得到苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM阳离子聚电解质。

具体合成步骤为：将聚（4-乙烯基吡啶）加入到三颈瓶中，加入适量三氯甲烷溶解，再加入0.02-0.1倍于P4VP重复单元摩尔量的苝甲溴，通氮气保护，68℃下冷凝回流约24小时。反应结束后，将反应液缓慢滴加到大量四氢呋喃中，得到沉淀物，反复溶沉，再真空干燥后得到PFP。将PFP溶于适量无水乙醇中，再加入大量碘甲烷，通氮气保护，40℃下搅拌回流24小时。反应结束后，将反应液真空旋转蒸馏，得到固体粉末状产物，再进一步真空干燥得到最终产物PFPM。

制备PFPM时的苝甲溴的量不能超过P4VP重复单元摩尔量的1/10，否则难以得到产物。

具体合成路线如下式所示：

对PFPM聚集诱导发光性质进行了验证。PFPM较容易溶于水，而基本不溶于THF，而水和THF可以任意比例互溶，因此我们选择水和THF作为溶剂证明 PFPM的AIE性质。当溶剂中含有不良溶剂THF时，PFPM会出现一定的聚集，当THF含量增加时，PFPM的聚集会加剧。将相同浓度的PFPM溶于不同THF含量的水/THF混合溶剂中，其荧光强度发生非常明显的变化，大体变化趋势为随着THF含量的增加，荧光强度也增大。

本发明还涉及苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）制备荧光探针的方法，将一定量的PFPM溶于PBS缓冲液形成稀溶液，再加入于PFPM为1.4~1.6摩尔浓度的单链DNA形成复合探针，当检测目标单链DNA时需要先将样品在90℃条件下保温约14~17分钟，再缓慢降至室温。

制备复合探针时的PFPM浓度不能太高，需控制在1 × 10^-7 M到1 × 10^-6 M之间，且DNA的浓度需是PFPM的1.5倍左右。

本发明的特点在于：非共轭聚电解质PFPM的合成方法容易操作，当PFPM溶液中加入DNA形成复合探针时，PFPM会产生聚集，荧光强度增加。该探针检测非互补的目标单链时，荧光强度因为PFPM聚集程度的增强而进一步增加，而检测完全互补配对的目标单链时，因为苝分子嵌插到DNA双链中，同时PFPM的聚集同样增强，嵌插作用导致的英冠减弱与聚集作用导致的荧光增强抵消，使得此时的荧光强度较探针没有明显变化。根据荧光强度最终的不同可以判断目标单链DNA是否与探针单链DNA互补。

本发明是嵌插作用和聚集诱导发光的双重检测机理，是前人从未报道过的，且对于今后的研究有很好的借鉴意义。并且本发明方法制备的产物荧光能量共振转移效率显著提高，使其荧光效率进一步提高。

附图说明

图1为PFPM的¹H NMR图谱；

图2为PFPM与DNA形成复合探针及其检测原理示意图；

图3为PFPM的聚集诱导发光性质荧光图谱；

图4为PFPM的聚集诱导发光性质的荧光积分面积走势图；

图5为DNA不同浓度对PFPM的荧光强度的影响图；

图6为实施例1制备的复合探针检测互补ssDNA2及不互补ssDNAt的荧光光谱图；

图7为实施例2制备复合探针的圆二色图谱证实嵌插作用；

图8为实施例2制备复合探针的KI淬灭实验证实嵌插作用。

具体实施方式

实施例1：

一种苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成：将5 mmol重均分子量为60000的聚（4-乙烯基吡啶）加入到三颈瓶中，加入15mL三氯甲烷溶解，再加入0.2mmol苝甲溴，通氮气保护，68℃下冷凝回流约24小时。反应结束后，将反应液缓慢滴加到大量四氢呋喃中，得到沉淀物，反复溶沉，再真空干燥后得到PFP。将PFP溶于适量无水乙醇中，再加入大量碘甲烷，通氮气保护，40℃下搅拌回流24小时。反应结束后，将反应液真空旋转蒸馏，得到固体粉末状产物，再进一步真空干燥得到最终产物PFPM。最终测得的PFPM中苝的接枝率为2.5%，重均分子量为114000。

将PFPM分别溶于含四氢呋喃体积分数为0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的水/THF混合溶剂中，测其荧光强度，结果显示为，含90%THF的溶剂中的荧光强度是不含THF的约600倍，说明PFPM是聚集诱导发光分子。

苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）制备荧光探针的方法：

（1）配制样品：用PBS（10 mM, pH = 7.4）缓冲液去配制样品溶液，1）保持PFPM的浓度为2.0×10^-7M 不变，ssDNA1的浓度逐渐从0增加到3×10^-6M的七个样品； 2）PFPM、PFPM /ssDNA1、PFPM /ssDNA1+ssDNA2、PFPM /ssDNA1+ssDNAt，每个样品溶液中的聚电解质最终浓度为2.0×10^-7M，每种DNA浓度都为3.0×10^-7M。其中ssDNA1、ssDNA2、ssDNAt的碱基序列分别为5’- CAA GTA GAA TGT ATG TGC-3’， 5’- GCA CAT ACA TTC TAC TTG-3’， 5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3’。

（2）热处理样品：将（1）中所配好的样品放入90℃烘干箱中热处理15分钟，然后缓慢降温至室温。

（3）对样品做荧光检测：在415nm激发波长条件下，测各样品的荧光强度。结果显示随着DNA浓度的增加，荧光强度也在增加，但增加速度在逐渐变慢。当PFPM与DNA形成复合探针时，荧光强度较纯PFPM增强。当加入互补目标单链DNA时，荧光强度较探针没有明显变化；当加入非互补目标单链DNA时，荧光强度较探针增强，由此检测单链DNA。

实施例2：

苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）制备荧光探针的方法：

（1）配制样品：用PBS（10 mM, pH = 7.4）缓冲液去配制一组样品溶液， PFPM、PFPM /ssDNA1、PFPM /ssDNA1+ssDNA2、PFPM /ssDNA1+ssDNA2-n，每个样品溶液中的聚电解质最终浓度为2.0×10^-7M，每种DNA浓度都为3.0×10^-7M。其中ssDNA1、ssDNA2、ssDNA2-n的碱基序列分别为5’- CAA GTA GAA TGT ATG TGC-3’， 5’- GCA CAT ACA TTC TAC TTG-3’， 5’-AGT CTA GGT TAC GGC GTG-3’。

（3）对样品做荧光检测：在415nm激发波长条件下，测各样品的荧光强度。结果与实施例3中的检测结果基本一致，显示随着DNA浓度的增加，荧光强度也在增加，但增加速度在逐渐变慢。当PFPM与DNA形成复合探针时，荧光强度较纯PFPM增强。当加入互补目标单链DNA时，荧光强度较探针没有明显变化；当加入非互补目标单链DNA时，荧光强度较探针增强，由此检测单链DNA。

对样品做圆二色谱测试：做圆二色谱测试是为了证实苝分子确实嵌插到了DNA双螺旋结构中去。加入聚电解质PFPM后的圆二色谱强度明显下降，导致这种结果的唯一可能就是嵌插作用，因为剩下的两种可能相互作用静电和沟壑作用都不会对双链结构产生如此大的作用使其圆二色谱有这样的变化。

KI淬灭实验：用PBS缓冲液（10 mM, pH = 7.4）配备KI溶液，浓度为0.2M，每次取10μL逐次加入实施例3第二组后两个样品中，分别测其荧光强度，结果显示，加入互补链的样品的荧光淬灭速率更慢，说明双链结构对苝形成了保护，即苝分子嵌插到了DNA双链中。

Claims

1.一种苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成，其特征在于，合成方法为将苝甲溴接枝到聚（4-乙烯基吡啶）上；将上述产物用碘甲烷质子化得到苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM阳离子聚电解质。

2.根据权利要求1所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成，其特征在于，包括以下的制备步骤：

（1）将聚（4-乙烯基吡啶）（P4VP）加入到三颈瓶中，加入三氯甲烷溶解，再加入0.02-0.1倍于P4VP重复单元摩尔量的苝甲溴，通氮气保护，冷凝回流；

（2）将步骤（1）的反应液缓慢滴加到四氢呋喃或强极性溶剂中，得到沉淀物，反复溶沉，再真空干燥后得到PFP；

（3）将步骤（2）得到的产物PFP溶于适量无水乙醇中，再加入大量碘甲烷得到反应溶液，通氮气保护，搅拌回流，干燥得到产物苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM。

3.根据权利要求2所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成，其特征在于，步骤（1）所述回流工艺为，68℃冷凝回流24小时。

4.根据权利要求2所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成，其特征在于，步骤（3）中所述搅拌回流工艺为，40℃下搅拌回流24小时。

5.根据权利要求2所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的合成，其特征在于，步骤（3）的干燥工艺为，将反应溶液进行真空旋转蒸馏，得到固体物后，真空干燥得到产物PFPM。

6.如权利要求1~5所述任一种合成方法制备的苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶），其特征在于，所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）的分子结构如下：

。

7.根据权利要求6所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶），其特征在于，苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM中苝的接枝率为2.5%，重均分子量为114000，分子量分布为1.21。

8.如权利要求6所述苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）制备荧光探针的方法，其特征在于，将苝接枝的聚（4-乙烯基吡啶）PFPM溶于10 mM, pH = 7.4的PBS缓冲液形成混合溶液，再加入于PFPM为1.4~1.6倍摩尔浓度的单链DNA，其通过静电作用与PFPM形成复合探针。

9.根据权利要求8所述制备荧光探针的方法，其特征在于，所述复合探针检测目标单链DNA时，需要先将复合探针在90℃条件下保温14~17分钟，再缓慢降至室温。

10.根据权利要求8所述制备荧光探针的方法，其特征在于，所述PFPM混合溶液的浓度为1 × 10^-7 M~1 × 10^-6 M。