CN103893190B - 一种黄杨生物碱化合物的医药用途 - Google Patents
一种黄杨生物碱化合物的医药用途 Download PDFInfo
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Abstract
本分案申请公开了一种黄杨生物碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，实验结果显示，在对野生型正常小鼠胚胎成纤维细胞无毒的浓度下，该化合物可以选择性地杀死带有肿瘤特异突变基因p53、Ras的小鼠肿瘤细胞，与此相一致的是，此类化合物对携带p53突变的人类结肠癌细胞株也有很强的杀伤活性，而对p53野生型的人类结肠癌细胞株杀伤活性不强；该黄杨类植物来源的化合物具有制备针对肿瘤特异突变基因p53、Ras的个性化治疗药物的应用潜力。
Description
本申请是申请号为201310104292.9、申请日2013年3月28日、发明名称“四种黄杨生物碱化合物的医药用途”的分案申请。
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种黄杨生物碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是一类严重威胁人类健康的致死性疾病，其发病机制尚未完全阐明，治疗效果亦不尽人意。目前常规用于肿瘤治疗的大部分药物，均是针对细胞增殖过程中DNA复制或细胞骨架的调控来设计的。这些药物在对快速增殖的肿瘤细胞进行杀伤的同时，对人体功能维持所需的正常增殖细胞（如骨髓干细胞等等）也有很大的毒性，导致接受治疗的病人机体正常功能严重受损，对于肿瘤的抵抗能力反而下降，难以取到很好的治疗效果。因此，利用分子靶向筛选技术，针对肿瘤细胞特异性基因突变产物，筛选可以抑制这些肿瘤特异突变分子活性或表达水平的小分子化合物，从而开发形成低毒、高效的靶向个性化治疗药物，已经成为肿瘤治疗药物研发的最新趋势。目前，进入临床应用的大部分靶向药物都是国外制药公司研发形成的，这些靶向治疗药物价格昂贵，给病人造成沉重的经济负担。开发具有自主知识产权的低毒、高效的靶向个性化治疗药物，也成为国内肿瘤转化医学研究者的重要方向。
黄杨属于黄杨科(Buxaceae)黄杨属（Buxus）植物，常绿灌木，又名(青明矮、千年矮、黄头艾、万年青、黄木、锦熟黄杨)，主要分布于我国南部各省、区及湖北；多分布于溪流的石沟中或溪岸边；亦有栽培的。黄杨作为药用植物早已记载于《本草纲目》，说它:“叶苦平无毒”，“主治妇人难产，入达生散中用，又主暑日生疖;捣烂涂之”。本药主要有行气活血、祛湿通络、清热解毒、祛风、止血等功能。民间用以治疗疟疾、梅毒、风湿、皮炎、和狂犬病。黄杨木粉民间流传治疗“心病”的有效药物。本属植物总生物碱一般有降压作用；黄杨生物碱作用于迷走神经和心脏，产生心博缓慢，局部缺血、窦室传导阻滞和心肌损伤；有些植物总生物碱对胆碱醋酶也有抑制作用，关于将黄杨生物碱用于***的内容还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄杨生物碱化合物的新医药用途，即该黄杨生物碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，即应用在制备靶向治疗携带p53和/或Ras突变肿瘤的抗癌药物中，将该黄杨生物碱化合物作为抗肿瘤药物的主要活性成分制成药物，作为靶向抗肿瘤药物来治疗癌症。
本发明中所述黄杨生物碱化合物是指下述式I、式II、式III、式IV所示化合物之一：
式I：9,19-yclo-5α,9β-pregnan-1-en-3-one,20α-(dimethylamino)-16α–hydroxy-4,4,14-trimethyl- (7CI,8CI)；Cyclomicrobuxinine （KBA01），中文名称：9,19-环-5α,9β-孕甾烷-1(2)-烯-3-酮, 20α-二甲氨基-16α-羟基-4,4,14-三甲基-(7CI,8CI)；
式II：9,19–Cyclo-5α,9β–pregnan-20-one,3β-(dimethylamino)-16α-hydroxy-14-methyl-4-methylene
-(7CI,8CI)；Buxippine K （KBA02），中文名称：9,19-环-5α,9β-孕甾烷-20-酮, 3β-二甲氨基-16α-羟基-14-甲基-4-亚甲基-(7CI,8CI)；
式III：9,19-Cyclo-5α,9β-pregnan-17(20)-en-16-one, 14-methyl-3β-(methylamino)-4-methylene- (7CI,8CI)； Buxmicrophylline B （KBA03），中文名称：9,19-环-5α,9β-孕甾烷-17(20)-烯-16-酮, 3β-二甲氨基-14-甲基-4-亚甲基-(7CI,8CI)；
式IV：9,19-Cyclo-5α,9β-pregnane-4α-hydroxymethyl,3β,20α-bis(dimethylamino)-16α- hydroxy- 4,14-dimethyl -(7CI,8CI)；Dihydrocyclomicrophylline （KBR18），中文名称：9,19-环-5α,9β-孕甾烷-4α-羟甲基, 3β,20α-二(二甲氨基)-16α-羟基-4,14-二甲基-(7CI,8CI)；
本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
本发明中靶向筛选体系以转基因小鼠细胞为基础，以最常见的肿瘤特异性突变基因p53和Ras构建靶向肿瘤细胞筛选体系，用MTT的实验方法体外筛选靶向抗肿瘤活性化合物。
这种靶向肿瘤细胞体系的优点是遗传背景清楚，具有不同抑癌基因突变状态和癌基因突变状态，以这些重组肿瘤细胞进行靶向筛选，我们可以较有效地筛选出针对重组细胞内携带的特异突变的活性化合物，从而实现靶向筛选的目的。
野生型的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibrobLast, MEF）作为对照细胞，这种正常对照细胞在药物筛选体系中的应用可以排除因为细胞毒性作用导致的细胞杀伤效应，筛选对肿瘤细胞有选择性杀伤，而对正常细胞没有毒性的天然活性物质。
抑癌基因p16的启动子与报告基因绿色荧光蛋白GFP融合，构建了p16靶分子的报告载体，这些报告载体被转染到不同遗传背景的肿瘤细胞内，可在活性药物诱导下表达其报告基因GFP，显示荧光，从而用于植物化合物大通量、快速靶向筛选出作用于p16启动子的抗肿瘤化合物，同时具有激活荧光表达的化合物再进一步通过蛋白免疫印迹的方法验证了化合物同时也能增加肿瘤细胞的p16蛋白表达。
实验结果表明，在对野生型正常小鼠胚胎成纤维细胞无毒的浓度下，KBA01、KBA02、KBA03和KBR18化合物可以选择性地杀死带有肿瘤特异突变基因p53和/或Ras的小鼠肿瘤细胞，而对野生型的正常小鼠胚胎成纤维细胞毒性较小；与此相一致的是，此类化合物对携带p53突变的人类结肠癌细胞株也有很强的杀伤活性，而对p53野生型的人类结肠癌细胞株杀伤活性不强，另外，基因启动子的GFP报告载体筛选体系显示，KBA02和03化合物可以激活抑癌基因p16的启动子，这些特性表明这四种黄杨类植物来源的化合物具有制备针对肿瘤特异突变基因p53、Ras和抑癌基因p16的个性化治疗药物的应用潜力。
附图说明
图1是本发明黄杨生物碱化合物KBR18作用于p53-/-+V+Ras和p53-/-+S+Ras 细胞株降低了分子伴侣HSP70表达的检测结果示意图，图中：DMSO36h是溶解药物的DMSO处理36小时；DMSO12h是溶解药物的DMSO处理12小时；KBR18 12h和36h是5μM的KBR18处理p53-/-+V+Ras细胞和p53-/-+S+Ras细胞 12小时和36小时；
图2是本发明黄杨生物碱化合物KBR18和KBA01作用于p53-/-+V+Ras和p53-/-+S+Ras细胞株降低了HSP90表达的检测结果示意图；
图3是本发明化合物KBA02处理的p53-/-+V+Ras、p53-/-+S+Ras细胞导致caspase-3切割的示意图；图中DMSO24h是指DMSO处理24h；KBA02 8h和KBA02 24h是指化合物KBA02作用于p53-/-+V+Ras和p53-/-+S+Ras细胞株8h和24h；
图4是本发明化合物 KBA01、KBA02和KBA03化合物降低了人结肠癌细胞HT29中p53mut，HSP90，HSP70蛋白的表达图，KBA01、KBA02和KBA03处理HT29细胞24h和48h。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。
实施例1：四种化合物的分离提取及鉴定
从昆明植物园采集的小叶黄杨(Buxus.microphylla)地上部分14Kg，植物种名由昆明植物所邱明华研究员鉴定，生药标本存放于中国科学院昆明植物所植物化学和西部植物资源持续利用国家重点实验室。
小叶黄杨地上部分 14Kg，粉碎后用70%丙酮常温渗滤提取3次，每次2天；合并提取液，减压浓缩至无丙酮蒸出，得到浸膏800 g，加酸水3000ml稀释调PH=2，分别用3000ml乙酸乙酯萃取3次，得到非生物碱部分；酸水液碱化至PH=10，用3000ml氯仿萃取3次得到生物碱部分135g；氯仿萃取部分 (135 g) 拌硅胶180 g 在常压硅胶柱 (硅胶400 g)上柱层析，氯仿-甲醇 (100:0, 50:1, 20:1, 10:1, 2:1) 梯度洗脱，用TLC 检测，得到5个部分(Fr.1-Fr.5)；氯仿-甲醇50:1的Fr.2部分 (18 g) 在硅胶柱上柱层析，用石油醚-丙酮(20:1，5:1)洗脱得到 Fr.2.1和Fr.2.2两个组分，Fr.2.1 (4 g) 继续上硅胶柱用石油醚-丙酮(40:1，20：1，10：1)梯度洗脱，得到石油醚-丙酮（20：1）洗脱液，浓缩后分离纯化，并用Sephadex LH-20进一步纯化得到45个组分，其中组分8-15为Buxippine K（KBA02）纯品（38 mg），组分21-28为Buxmicrophylline B（KBA03）纯品(29 mg)。
经鉴定Buxippine K：C25H39NO2, white powder; 1H NMR (ppm, CDCl3, 500 MHz): δ H 2.70 (m, H-3), 4.78, 4.58 (s, H-30), 0.04, 0.21 (d, J = 4.0, H-19), 1.10 (s, 18-CH3), 0.80 (s, 32-CH3), 2.24 (s, 3-N(CH3)2); 13C NMR (ppm, CDCl3, 125 MHz): δ C 31.2 (t, C-1), 27.5 (t, C-2), 68.5 (d, C-3), 151.3 (s, C-4), 44.4 (d, C-5), 23.6 (t, C-6), 27.0 (t, C-7), 47.1 (d, C-8), 22.4 (s, C-9), 32.0 (s, C-10), 25.3 (t, C-11), 26.6 (t, C-12), 48.3 (s, C-13), 48.9 (s, C-14), 45.6 (t C-15), 71.2 (d, C-16), 70.0 (d, C-17), 20.7 (q, 18-CH3), 20.4 (t, C-19), 210.7 (s, C-20), 31.2 (q, 21-CH3), 103.4 (t, C-30), 20.3 (q, 32-CH3), 42.4(q, 3-N(CH3)2); E1-MS: m/z 385 [M]+；
Buxmicrophylline B：C24H35NO, colorless needle; 1H NMR (ppm, CDCl3, 500 MHz): d H 2.86 (dd, J = 4.0, 11.6, H-3), 0.10, 0.35 (d, J = 4.4, H-19), 0.94 (s, 18-CH3), 1.29 (s, 32-CH3), 2.46 (s, 3-NCH3), 1.80 (d, J = 7.6, 21-CH3), 6.53 (q, J = 7.6, H-20), 4.57 (s, Ha-30), 4.80 (s, Hb-30); 13C NMR (ppm, CDCl3, 125 MHz): d C 31.7 (t, C-1), 23.4 (t, C-2), 63.5 (d, C-3), 153.6 (s, C-4), 44.1 (d, C-5)，23.4 (t, C-6), 26.4 (t, C-7), 45.4 (d, C-8), 22.7 (s, C-9), 32.4 (s, C-10), 25.5 (t, C-11), 34.4 (t, C-12), 42.3 (s, C-13), 46.7 (s, C-14), 49.3 (t, C-15), 206.5 (s, C-16), 146.5 (d, C-17), 13.2 (q, 18-CH3), 29.3 (t, C-19), 130.2 (d, C-20), 20.8 (q, 21-CH3), 101.0 (t, C-30), 24.1 (q, 32-CH3), 34.5 (q, 3-NCH3); EI-MS m/z: 353 (M+)。
从云南丽江采集的高山黄杨(Buxus.rugulosa)地上部分75Kg，植物种名由昆明植物所李锡文研究员鉴定，生药标本存放于中国科学院昆明植物所植物化学和西部植物资源持续利用国家重点实验室。
高山黄杨地上部分 75 Kg，粉碎后用90%甲醇加热回流提取3次，每次8小时；合并提取液，减压浓缩至无甲醇蒸出，得到浸膏1800 g，加酸水稀释调PH=3，分别用乙酸乙酯萃取2-3次，得到非生物碱部分；酸水液碱化至PH=9，用氯仿萃取3次得到生物碱部分180 g，氯仿萃取部分 (180 g) 拌硅胶200 g 在常压硅胶柱 (硅胶600 g)上柱层析，氯仿-甲醇 (100:0, 50:1, 20:1, 10:1, 2:1) 梯度洗脱，用TLC 检测，得到5个部分(Fr.1-Fr.5)，氯仿-甲醇50:1的 Fr.2(45 g) 进行硅胶柱层析，用石油醚-丙酮(20:1 , 5:1)洗脱得到 Fr.2.1、Fr.2.2两个组分， Fr.2.1部分 (14 g) 继续上硅胶柱用石油醚-丙酮(40:1 , 20：1，10：1)梯度洗脱，得到石油醚-丙酮（20：1）洗脱液部分，浓缩后分离纯化，并用Sephadex LH-20进一步纯化得到cyclomicrobuxinine（KBA01）纯品（68 mg）；
氯仿-甲醇10:1的洗脱部分Fr.4 (12 g) 经氨基硅胶柱层析后，用Sephadex LH-20进一步纯化得到dihydrocyclomicrophylline（KBR18）纯品（35 mg）。
经鉴定Cyclomicrobuxinine: C24H37NO2, colorless needle;1H NMR (ppm, CDCl3, 500 MHz): δ H 4.56, 4.30 (s, H-30), 0.12, 0.31 (d, J = 5.0, H-19), 1.16 (s, 18-CH3), 0.86 (s, 32-CH3), 2.72 (s, 3-NCH3); 13C NMR (ppm, CDCl3, 125 MHz): δ C 30.4 (t, C-1), 31.6 (t, C-2), 62.4 (d, C-3), 147.9 (s, C-4), 47.8 (d, C-5), 23.8 (t, C-6), 25.6 (t, C-7), 44.6 (d, C-8), 23.7 (s, C-9), 32.0 (s, C-10), 27.2 (t, C-11), 31.2 (t, C-12), 48.3 (s, C-13), 48.4 (s, C-14), 46.2 (t, C-15), 71.7 (d, C-16), 70.4 (d, C-17), 20.7 (q, 18-CH3), 27.8 (t, C-19), 211.4 (s, C-20), 31.3 (q, 21-CH3), 103.9 (t, C-30) 20.9 (q, 32-CH3), 31.7 (q, 3-NCH3); ES1-MS: m/z 372 [M + H]+；
Dihydrocyclomicrophylline A (11): C28H50N2O2, colorless needle; 1H NMR (ppm, CDCl3, 500 MHz): δ H 2.41 (dd, J = 3.0, 12.5, H-3), 0.28, 0.54 (d, J = 4.0, H-19), 0.86 (s, 18-CH3), 1.02 (s, 32-CH3), 2.17 (s, 20-N(CH3)2), 0.98 (d, J = 6.4, 21-CH3); 13C NMR (ppm, CDCl3, 125 MHz): δ C 32.8 (t, C-1), 25.1 (t, C-2), 54.6 (d, C-3), 40.3 (s, C-4), 45.7 (d, C-5), 21.6 (t, C-6), 27.0 (t, C-7), 43.7 (d, C-8), 19.2 (s, C-9), 24.9 (s, C-10), 18.5 (t, C-11), 33.2 (t, C-12), 44.5 (s, C-13), 47.1 (s, C-14), 28.3 (t C-15), 72.4 (d, C-16), 52.3 (d, C-17), 11.1 (q, 18-CH3), 30.2 (t, C-19), 57.6 (d, C-20), 18.8 (q, 21-CH3), 71.2 (t, C-30), 9.6 (q, C-31), 20.9 (q, C-32), 39.2 (q, 20-N(CH3)2); EI-MS m/z 446 M+。
实施例2：本发明化合物的抗肿瘤活性实验
1、筛选细胞的构建：以野生型小鼠为载体，利用近源的、分子遗传背景清楚的p53基因缺失的小鼠胚胎成纤维细胞（p53-/- 细胞），构建携带人类肿瘤中常见的p53S（简写为S）和/或Ras基因突变的小鼠肿瘤细胞 （p53 -/-+S+Ras、p53 -/-+V+Ras），具体步骤如下：
（1）Ras突变基因的载体和表达p53S突变基因的载体的构建
载体的构建方法见专利ZL200910095184.3中方法，即采用常规的基因工程方法将p53S或Ras突变基因cDNA连入PQCXIP载体中，通过测序对构建入载体的中的p53S或Ras序列进行验证，构建好的载体用于在p53-/- 细胞中引入p53S或Ras突变基因。
（2）p53S或Ras突变基因载体的转染
（a） 准备phoenix细胞
在转染前一天将phoenix细胞（人胚肾细胞，用于包装带有转染基因的病毒颗粒）传代（DMEM高糖培养基，10%FBS血清，37℃二氧化碳培养箱中培养），备用；
（b） 提取转染质粒
用除内毒素的质粒提取试剂盒提取p53S-PQCXIP质粒，并测定质粒浓度（操作按试剂盒说明书内容进行）；
（c） 配置转染体系（10cm培养皿）
mix1：加入24μg质粒DNA于无血清的DMEM（dulbecco's modified eagle medium，Dulbecco改良的Eagle培养基）中，定容至1.5mL， 混匀；
mix2：加入60μL 转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen)到无血清的DMEM中，定容至1.5mL，室温孵育5min后，将mix1和mix2混合，轻轻混匀，室温孵育20min；吸除步骤（a）中传代的phoenix细胞液中的上清液，然后将mix1和mix2混合体系加入phoenix细胞中，并加入DMEM补足到8mL，37℃二氧化碳培养箱中培养5h后加入血清至浓度为10%，37℃培养；
（d） 分别在转染后24h，48h两个时段，采用0.45μm孔径滤膜过滤培养的phoenix细胞液，收集上清液（即含转染病毒的培养液），并在上清中加入polybrene(凝聚胺，用于提高病毒感染细胞的效率)，使polybrene终浓度为10μg/mL，将上清液加入到受体细胞p53-/-细胞中，37℃培养；
（e） 感染受体细胞48h后，加入puromycin(嘌呤霉素)（终浓度2μg/mL）进行筛选，持续筛选约一个月，建立稳定表达的细胞株；通过以上方法，将p53S和Ras基因共同转入p53-/-细胞中就得到了p53 -/-+S+Ras，将空载体（vector，V）和Ras基因共同转入p53-/-细胞中就得到了p53 -/-+V+Ras的稳定细胞株，将两细胞分别加入DMEM (10％FBS) 在37℃二氧化碳培养箱中培养，用于以下化合物的筛选。
2、细胞增殖实验：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，将p53-/-+V+Ras、p53-/-+S+Ras细胞接种到96孔板上，2500个/孔，小鼠胚胎成纤维细胞 (wt细胞)接种5000个/孔，人结肠癌细胞株HCT116（p53野生型）和HT29（p53突变型）细胞接种5000/孔，每孔溶液终体积200 μL（边缘孔用培养基填充），HCT116和HT29细胞培养在10% FBS+1640培养基中，5%CO2，37℃培养，12h后加入浓度梯度的本发明化合物，设置5个梯度，分别为0.1μM、1μM 、10μM 、30μM 、50μM，设3个平行孔；5%CO2，37℃培养72小时后，每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值，同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）。
表1 ：化合物KBA01-03和KBR18的抗肿瘤活性
由表1可知化合物KBA01，KBA02，KBA03和KBR18选择性的作用于p53-/-+V+Ras和p53-/-+S+Ras，KBA01-03和KBR18化合物的IC50均小于5μM而对MEF细胞的毒性较小，其IC50是表达靶基因5-10倍。
表2：化合物KBA01，KBA02，KBA03在人结肠癌的活性结果
表2显示KBA01，KBA02，KBA03选择性的作用于p53突变的人结肠癌细胞株HT29， 而对p53野生型的HCT116结肠癌细胞株活性相对较弱，进一步证实了此类化合物的作用靶点为突变型p53，KBR18在这两个细胞株没有抗肿瘤活性。
实施例4：免疫印迹实验
一、蛋白样品的预处理和浓度测定
（1）将对数生长期的p53-/-+V+Ras、p53-/-+S+Ras细胞用5μM 的KBR18、 KBA01、KBA02和对照DMSO处理8h，16h和24h后将细胞从平皿上轻轻刮下，连同培养基一起放入15mL离心管中，4℃，4000 rpm(3082′ g)离心5min，弃上清，将细胞沉淀用1mL 1×PBS轻轻悬浮，再将细胞悬液转入1.5mL离心管中，13000 rpm(12470′ g)离心1min，将上清吸净，此细胞沉淀在-80℃中保存，备用；
（2）将细胞沉淀用0.2mL的细胞裂解液裂解（裂解液体积视细胞沉淀多少而定，一般以细胞体积的3-5倍为佳，太多则细胞裂解液浓度过稀，上样体积增大；太少则在超声裂解的步骤中容易打出气泡，导致蛋白变性），裂解液配方为：10mLM-PER（Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo 哺乳动物蛋白提取试剂），50μL 200 mM Na3VO4，50μL 200 mM PMSF（苯甲基磺酰氟），一片 Protease inhibitor cocktail Tablets（蛋白酶抑制剂复合物，Roche）；将添加了裂解液的细胞悬液放在摇床上，4℃下最大速度摇1h；之后置于冰上，用超声波探头进行破碎，注意先用纯水清洗探头，超声10s，停顿5s，反复10次 （探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡），最后悬液重新固定在脱色摇床上，4℃，最大速度摇1 h，12000 rpm(10625′ g)离心，4℃，20 min，吸上清于另一1.5mL离心管中，此细胞裂解液保存在-80℃，备用；
（3）用考马斯亮蓝测定蛋白浓度（Protein Assay Kit，Bio-rad）：先用牛血清白蛋白（BSA）标准液配制1mg/mL的BSA溶液，再稀释成浓度梯度为100μg/mL, 200μg/mL, 400μg/mL, 600μg/mL, 800μg/mL的标准液。将配好的标准液各取20μL加入到2mL考马斯亮蓝试剂中，室温放置5 min以上，可见光波长595nm处测光吸收值，计算绘制标准曲线（R2需大于0.99）；
（4）取2μL量的蛋白样品裂解液加入到2mL考马斯亮蓝试剂中，室温放置5 min以上，595nm测光吸收值（OD值>0.8时，需要减少反应的蛋白裂解液体积），通过标准曲线求得未知蛋白的浓度，计算上样体积。
二、SDS-PAGE电泳，具体操作如下：
（1）装好胶板，检验是否漏水，吸干水分，先配制分离胶，以浓度为12%的胶（1.5mm厚的胶）为例，依次按顺序加入：1.87mL H2O，3.375mL 1M Tris-HCl(pH 8.8)，3.6mL Acr：Bis（29:1），90μL 10%SDS，60μL 10%APS，4.5μL TEMED（四甲基二乙胺），混匀，用刻度吸管将混匀的凝胶溶液加到胶板中（贴壁加，避免产生气泡），然后加1mL水或正丁醇封住液面，待胶凝固后，将上层封胶的液体从胶槽的一边倒去，用滤纸条吸干多余水分；
（2）等分离胶凝固后，按一定比例加入各试剂配制浓缩胶，以浓度为4.5%的胶（1.5mm厚的胶）为例，依次按顺序加入：2.17mL H2O，0.388mL 1M Tris-HCl(pH 6.8)，0.45mL Acr：Bis（29:1），27μL 10%SDS，15μL 10%APS，2μL TEMED，混匀后，缓慢加入胶板中，小心插上梳子；
（3）准备沸水浴，同时，取20μg蛋白，根据标准曲线和样品OD值算出样品浓度和上样体积（不宜超过50μL），用1× PBS补足到相同的上样体积； 5×loading buffer（使用前加5%β-巯基乙醇，加入的量是总体积的1/5），混匀，用小夹子夹住1.5mL离心管口，沸水浴中处理8min；
（4）取下胶板上的梳子，把胶板底部打开为半开，将电泳液倒入电泳槽中，没过胶板，将煮好的蛋白样本用注射器或细枪头上样至凝胶胶孔中，动作要慢，切忌溢入旁边的胶孔，上槽接正极，下槽接负极，30mA，约1-1.5h，当溴酚蓝前沿到达胶的底部时，停止电泳。
三、转膜
准备1L转膜缓冲液，使用前先置于4℃预冷，在容器中倒入适量转膜缓冲液浸泡滤纸4张，海绵2片，纤维素膜或PVDF膜1片，待电泳结束后，取下胶板，卸下胶框，撬开短玻璃板，在凝胶上切一小角作为加样标志；将胶块的浓缩胶切除丢弃，分离胶取出浸泡在转膜缓冲液中，制作转膜三明治：负极-一层海绵-两层滤纸-胶-纤维素膜-两层滤纸-一层海绵-正极。注意整个操作过程避免产生气泡；将“三明治”放入电泳槽中，倒满转膜缓冲液，注意电泳槽的正负极；电泳槽放入冰盆中，4℃层析柜中转膜3小时（180mA，将电压调到最大），也可转膜过夜。
四、免疫杂交与显色
（1）将膜取出，PBST洗膜1次，将膜放入封闭缓冲液中（10%脱脂奶），脱色摇床摇动1小时，室温；
（2）用PBST洗膜3次，每次5min；将膜封入袋中，加入一种按一定比例稀释了的一抗，一抗可选择：anti-p53Ab1(clonePAb240) (1:250, Neomarker,CA)，anti-PARP(1:500, Cell Signaling, MA)，anti-γ-tubulin (1:5000,Upstate, NY)，anti-HSP70， anti-HSP90（1:1000 Cell Signaling, MA)；赶走气泡，封口，4℃，摇过夜或室温下3h；
（3）将膜取出，一抗回收，膜用PBST洗3次，5min/次；将膜再次封入袋中，加二抗，二抗根据一抗的来源选择（如鼠来源，兔来源等），赶走气泡，封口，摇动1小时，室温；
（4）洗膜，10min/次，3次；取出ECL（enhanced chemiluminescence，增强化学发光）试剂，打开洗片机，将膜放在干净的一次性手套上，正面朝上，每毫升ECL试剂加入3μL 4%的过氧化氢，混匀后加在膜上（一张2 × 6cm的膜用1mL）反应1min；将膜沥掉ECL液体，移到暗盒中（正面朝上），覆上透明的薄膜，拿到暗室，在暗室中，取出X光胶片，压到膜上，反应1-2min（具体时间视荧光强度而定），送进洗片机洗片；
实验结果显示：5μM KBR18在36h降低了p53-/-+V+Ras、p53-/-+S+Ras细胞中HSP70的蛋白表达量（见图1），同时5μM KBA01和KBR18降低了p53-/-+V+Ras、p53-/-+S+Ras细胞中HSP90的蛋白表达量（见图2），5μM KBA02处理的p53-/-+V+Ras、p53-/-+S+Ras细胞，在24h发生了caspase-3的切割，显示细胞凋亡的发生（见图3），以上结果说明随着时间和剂量的增加，KBA01，KBR18化合物可以导致p53-/-+V+Ras和p53-/-+S+Ras细胞内的HSP70，HSP90蛋白表达量的降低，同时化合物KBA01，KBA02和KBA03化合物降低了人肿瘤细胞株HT29细胞中突变p53、HSP90和HSP70蛋白的表达量（图4）。
Claims (2)
1.结构式为式IV所示的黄杨生物碱化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，
式IV：9,19-环-5α,9β-孕甾烷-4α-羟甲基, 3β,20α-二(二甲氨基)-16α-羟基-4,14-二甲基-(7CI,8CI)。
2.根据权利要求1所述的黄杨生物碱化合物的应用，其特征在于：用于制备靶向治疗携带p53和/或Ras突变肿瘤的抗肿瘤药物中。
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