CN103884796B - 一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，1）制作用气相色谱法测得的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线；或者丙酸相对于内标物的校正因子；2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再用无水乙醇提取丙酸，得到混合液；3）取第2）步所得混合液的上清液并过一次性有机滤膜，通过气相色谱法测得滤液中丙酸的峰面积；4）根据第1）步制作的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线，再结合第3）步得到的滤液中丙酸的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。本方法前处理简单，所用试剂安全无毒，检测人员安全性高，结果准确稳定，并可减少对仪器的损坏。
Description
技术领域
本发明涉及饲料添加剂成分的检测，具体指一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，属于饲料添加剂或分析检测技术领域。
背景技术
丙酸是一种挥发性脂肪酸，为无色透明液体，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂。它是动物正常代谢的中间产物，具有很广的抗菌谱，通常用于配制饲料防霉剂和酸化剂。由于丙酸的挥发性较强，单独添加丙酸其作用时间短，因此饲料防霉剂中往往同时添加丙酸盐，饲料防霉剂中常见的丙酸盐为丙酸铵、丙酸钙、丙酸钠和丙酸钾。丙酸盐在酸性条件下会持续游离出丙酸以发挥防霉作用。将一定量的丙酸及其盐，以及其他有效成分加入到二氧化硅和/或蛭石等载体中混合均匀即可制成一种饲料防霉剂或酸化剂。
饲料防霉剂中丙酸和丙酸盐（以丙酸计）含量的检测目前没有统一的国家标准。饲料添加剂企业和饲料厂常用的方法有滴定法、络合滴定法、液相色谱法和气相色谱法等。前两种方法都容易受到防霉剂中其他有机酸类影响，因此准确度和精密度均较低，只能用于丙酸含量的粗测。GB/T 17815-1999规定了填充柱气相色谱法测定饲料中丙酸、丙酸盐含量的方法，但此方法仅适用于饲料中丙酸含量在0.3％以下丙酸、丙酸盐(以丙酸计) 的测定，然而，饲料防霉剂中总丙酸含量较高，一般大于25％，并且目前填充柱已广泛被毛细管柱所取代，因此此方法不适用于饲料防霉剂中总丙酸含量的检测。目前，关于使用毛细管气相色谱法检测饲料防霉剂中总丙酸含量的文献报道较少。这些方法都使用过量的无机酸（硫酸/磷酸）来酸化样品，无机酸进入气相色谱会造成进样口污染，严重的会对毛细管柱造成不可逆的损坏。采用顶空进样虽能够避免上述问题，但是需要特殊设备，适用范围有限。并且，上述文献中前处理步骤较多，检测人员工作量较大，所用有机溶剂（如乙酸乙酯、丙酮、***等）通常具有一定的毒性，对检测人员的健康造成一定的威胁。
发明内容
针对现有饲料添加剂中总丙酸测定时样品前处理繁琐，溶剂有毒害，对设备有损害等技术问题，本发明的目的在于提供一种前处理操作简单，对检测人员安全无毒，并可减少仪器损坏的混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：
一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，该混合型饲料添加剂中含有丙酸和丙酸盐，检测步骤如下，
1）制作用毛细管气相色谱法测得的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线；步骤1）制作标准曲线时需要配置5-8个浓度梯度在0.1~20 mg/mL之间的丙酸标准工作液进样分析，根据各浓度所测丙酸峰面积的大小与浓度的对应关系做标准曲线，要求相关系数大于0.99。
2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再向待检测样品中加入足量的无水乙醇使待检测样品中的丙酸以及丙酸盐转化成的游离丙酸完全溶解于无水乙醇中，以将丙酸从待检测样品中提取出来，得到混合液；加入无水乙醇提取时应充分振摇或者低温超声，然后离心或者放置6小时以上；
3）取第2）步所得混合液的上清液并过一次性有机滤膜，通过毛细管气相色谱法测得滤液中丙酸的峰面积；
4）根据第1）步制作的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线，再结合第3）步得到的滤液中丙酸的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。
一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，该混合型饲料添加剂中含有丙酸和丙酸盐，检测步骤如下，
1）配制确定浓度的丙酸标准储备液，取一定体积该标准储备液于容量瓶中，再加入一定体积的预先配置好的内标物标准溶液，用无水乙醇定容，得到丙酸标准溶液；丙酸标准溶液过一次性有机滤膜，滤液用毛细管气相色谱法测定丙酸和内标物的峰面积，再结合丙酸标准储备液和内标物的浓度计算本方法下丙酸相对于内标物的校正因子；
2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再向待检测样品中加入足量的无水乙醇使待检测样品中的丙酸以及丙酸盐转化成的游离丙酸完全溶解于无水乙醇中，以将丙酸从待检测样品中提取出来，得到混合液；加入无水乙醇提取时应充分振摇或者低温超声，然后离心或者放置6小时以上；
3）取第2）步所得混合液的上清液，将此上清液视为步骤1）中的丙酸标准储备液，按步骤1）操作测定丙酸和内标物的峰面积；
4）根据第1）步得到的丙酸相对于内标物的校正因子，再结合第3）步得到的滤液中丙酸和内标物的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。
所述内标物为巴豆酸标准品，步骤1）中应重复配置6～8次丙酸标准溶液上机测定，计算本方法下丙酸相对于巴豆酸的平均校正因子。
所述步骤2）中提取丙酸的无水乙醇的量同时应满足上清液中丙酸浓度接近丙酸标准储备液浓度。
本发明用于对以二氧化硅和/或蛭石为载体的混合型饲料添加剂，特别是防霉剂和/或酸化剂中总丙酸含量的气相色谱定量分析方法，先利用强有机酸将丙酸盐转化成游离丙酸，再用无水乙醇提取，直接取上清液过有机滤膜，最后取滤液进样检测。
本方法前处理简单，所用试剂安全无毒，检测人员安全性高，结果准确稳定，并可减少对仪器的损坏。
附图说明
图1-防霉剂中丙酸色谱图。
图2-丙酸标准曲线。
具体实施方式
本发明混合型饲料添加剂中含有丙酸和丙酸盐，常见的丙酸盐为丙酸铵、丙酸钙、丙酸钠和丙酸钾。本发明有两种方法可以实现混合型饲料添加剂中总丙酸含量的检测，分别为外标法和内标法。下面分别进行说明。
一、外标法
1）制作用毛细管气相色谱法测得的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线；在制作标准曲线时需要配置5-8个浓度梯度在0.1~20 mg/mL之间的丙酸标准工作液进样分析，根据各浓度所测丙酸峰面积的大小与浓度的对应关系做标准曲线，要求相关系数大于0.99；
2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再向待检测样品中加入足量的无水乙醇使待检测样品中的丙酸以及丙酸盐转化成的游离丙酸完全溶解于无水乙醇中，以将丙酸从待检测样品中提取出来，得到混合液；加入无水乙醇提取时应充分振摇或者低温超声，然后离心或者放置6小时以上；
3）取第2）步所得混合液的上清液并过一次性有机滤膜（0.22μm），通过毛细管气相色谱法测得滤液中丙酸的峰面积；
4）根据第1）步制作的丙酸峰面积与浓度的对应关系标准曲线，再结合第3）步得到的滤液中丙酸的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。
为了提高检测准确性，本发明可以采用平均法，将待检测样品分为相等的几份，按相同的操作进行检测，第2）步加入的无水乙醇量也相等，最后求平均值即可。
二、内标法
1）配制确定浓度的丙酸标准储备液，取一定体积该标准储备液于容量瓶中，再加入一定体积的预先配置好的内标物标准溶液，用无水乙醇定容，得到丙酸标准溶液。丙酸标准溶液过一次性有机滤膜（0.22μm），滤液用毛细管气相色谱法测定丙酸和内标物的峰面积，再结合丙酸标准储备液和内标物的浓度计算本方法下丙酸相对于内标物的校正因子；
2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再向待检测样品中加入足量的无水乙醇使待检测样品中的丙酸以及丙酸盐转化成的游离丙酸完全溶解于无水乙醇中，以将丙酸从待检测样品中提取出来，得到混合液；加入无水乙醇提取时应充分振摇或者低温超声，然后离心或者放置6小时以上；
3）取第2）步所得混合液的上清液，将此上清液视为步骤1）中的丙酸标准储备液，按步骤1）操作测定丙酸和内标物的峰面积；
4）根据第1）步得到的丙酸相对于内标物的校正因子，再结合第3）步得到的滤液中丙酸和内标物的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。
内标物应与被测组分的相对分子质量和沸点相近、结构相似，且保留时间相近，但又能分开。本发明使用巴豆酸，步骤1）中应重复配置6～8次丙酸标准溶液上机测定，计算本方法下丙酸相对于巴豆酸的平均校正因子。
前面两种方法步骤2）中将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸按如下方法进行，如果饲料添加剂中丙酸盐唯一且为丙酸铵，则无需进行酸化处理。由于丙酸和丙酸铵都能溶解于无水乙醇中，实际处理时，样品先用无水乙醇提取，丙酸铵在气相色谱仪进样口受热分解为丙酸和氨。如果饲料添加剂中含有其他丙酸盐（如丙酸钙、丙酸钠或者丙酸钾），则加入甲酸酸化待检测样品，所加入甲酸为分析纯，添加量应保证能够全部置换出丙酸盐中的丙酸，甲酸加入后充分摇匀，并放置一段时间。
上述步骤2）加入无水乙醇后应充分振摇，所述无水乙醇的量应满足上清液中丙酸浓度接近丙酸标准储备液浓度。虽然样品中丙酸的含量不能确定，但对于饲料防霉剂和酸化剂来说，其含量通常有一个大致范围，所以可以预先大概估计，基于估计含量来加入无水乙醇。所述充分振摇应避免有利于体系中物质挥发的操作。
气相色谱法检测条件应满足丙酸峰峰形良好，保留时间适宜。使用内标物时，丙酸峰与内标物峰分离彻底。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明主要需要的设备有分析天平、气相色谱仪及其配套设备，以及丙酸标准品、分析纯的无水乙醇和甲酸等，分析步骤、方法叙述如下：
实施例一、丙酸和丙酸铵型防霉剂中总丙酸含量测定（外标法）
1 试剂和溶液
1.1 无水乙醇 分析纯
1.2 丙酸标准品
1.3 丙酸标准储备液：50mg/mL无水乙醇溶液。（密封后4℃保存，保质期3个月。）
1.4 丙酸标准工作液：分别吸取40、20、10、4、2mL丙酸标准储备液于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容（用时现配），配制成20、10、5、2和1mg/mL丙酸标准工作液。
2 丙酸含量测定
2.1 原理
丙酸和丙酸铵都能溶解于无水乙醇中。样品用无水乙醇提取。丙酸铵在进样口受热分解为丙酸和氨。使用FID检测丙酸峰面积，再通过标准曲线计算丙酸浓度，从而计算出防霉剂中总丙酸含量。
2.2样品提取
快速准确称取1g左右（精确到0.0001g）样品于50mL具塞三角瓶中，加入25mL无水乙醇，手动剧烈振摇5min后离心或者放置过夜（至少6h）。小心吸取上清液过0.22μm一次性有机滤膜，滤液收集于样品瓶中上机待测。
2.3 仪器和条件
2.3.1仪器
气相色谱仪：配备FID检测器；
色谱柱：HP-FFAP毛细管色谱柱，30m×250μm×0.25μm；
2.3.2 主要仪器条件
调整仪器参数，使保留组分与试剂及杂峰分离。具体参数需根据不同气相色谱仪作出调整。推荐的仪器条件如下（适用于安捷伦7890B）：
进样口温度：230℃。
检测器温度：230℃。
载气：氮气；恒流模式，柱流量1.0mL/min。
柱箱温度：起始温度100℃，恒温5min。再以100℃/min速率升温到200℃。
进样量：1μL；分流比50:1；
空气流量：400mL/min；氢气流量：40mL/min；尾吹气流量：30 mL/min；
2.4 结果的计算
2.4.1 丙酸标准曲线的制定：
将配制成的20、10、5、2和1mg/mL丙酸标准工作液按上面条件进行测定。以丙酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。图2为实施例一得到的丙酸标准曲线。图1为防霉剂中丙酸色谱图。
2.4.2 计算
样品中有效组分丙酸含量按下式计算：
式中：——样品中总丙酸的百分含量
——由标准曲线计算的检测溶液的丙酸浓度，单位mg/mL；
25——样品提取液体积，单位mL；
——样品的质量，单位g。
测定结果保留小数点后两位。
2.4.3 重复性
要求两次平行测定结果相对偏差小于等于10%。
实施例二、复合丙酸型防霉剂中总丙酸含量测定（内标法）
1 试剂和溶液
1.1 无水乙醇 分析纯
1.2 丙酸标准品
1.3 巴豆酸标准品
1.4 丙酸标准储备液：50 mg/mL无水乙醇溶液。（密封后4℃保存，保质期3个月。）
1.5 巴豆酸内标溶液：50 mg/mL无水乙醇溶液。
1.6 丙酸标准工作液：吸取1mL丙酸标准储备液于10mL容量瓶中，加入200μL巴豆酸内标溶液，用无水乙醇定容（用时现配）。
2 丙酸含量测定
2.1 原理
用过量甲酸酸化防霉剂，使丙酸盐完全游离出丙酸，再用无水乙醇提取丙酸，加入内标物，定容摇匀，使用气相色谱仪分离测定，通过内标物计算防霉剂中丙酸含量。
2.2 样品提取
快速准确称取1g（精确到0.0001g）样品于50mL具塞三角瓶中，准确加入10mL甲酸和无水乙醇混合溶液（甲酸：无水乙醇体积比为1:4），手动剧烈振摇5min后离心或者放置过夜（至少6h），吸取上清液1mL于10mL容量瓶中，准确加入200μL巴豆酸内标溶液，用无水乙醇定容。定容后过0.22μm一次性有机滤膜，滤液收集于样品瓶中上机待测。
2.3 仪器和条件
同实施例一；
2.4 结果的计算
2.4.1 丙酸含量计算
本方法样品中丙酸相对内标物巴豆酸的校正因子按下式（1）计算：
…………………………（1）
式中：
——样品中丙酸相对内标物的校正因子；
——丙酸标准工作液中内标物巴豆酸的峰面积；
——丙酸标准工作液中丙酸的质量浓度，单位为mg/mL；
——丙酸标准工作液中丙酸的峰面积；
——丙酸标准工作液中内标物巴豆酸的质量浓度，单位为mg/mL。
样品中总丙酸含量按下式（2）计算：
…………………………（2）
式中：
——待测样品中总丙酸的百分含量；
——待测样品中丙酸相对内标物巴豆酸的校正因子；
——待测样品溶液中丙酸的峰面积；
——待测样品溶液中内标物巴豆酸的浓度；
——定容体积，单位为mL；
10——样品提取液体积，单位mL；
——待测样品溶液中内标物巴豆酸的峰面积；
——试样的质量，单位为g。
测定结果保留小数点后两位。
2.4.2 重复性
两次平行测定结果结果相对偏差小于等于10%。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，本方法的混合型饲料添加剂为防霉剂或酸化剂，防霉剂或酸化剂以二氧化硅和/或蛭石为载体，防霉剂或酸化剂中含有丙酸和丙酸盐，其特征在于：检测步骤如下，
1）制作用毛细管气相色谱法测得的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线；
2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再向待检测样品中加入足量的无水乙醇使待检测样品中的丙酸以及丙酸盐转化成的游离丙酸完全溶解于无水乙醇中，以将丙酸从待检测样品中提取出来，得到混合液；加入无水乙醇提取时应充分振摇或者低温超声，然后离心或者放置6小时以上；
将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸按如下方法进行，如果丙酸盐唯一且为丙酸铵，则无需进行酸化处理，其可在进样口高温环境下分解为丙酸和氨；否则，则需加入甲酸酸化待检测样品，所加入甲酸为分析纯，添加量应保证能够全部置换出丙酸盐中的丙酸，甲酸加入后充分摇匀，并放置一段时间；
3）取第2）步所得混合液的上清液并过一次性有机滤膜，通过毛细管气相色谱法测得滤液中丙酸的峰面积；
4）根据第1）步制作的丙酸浓度与峰面积的对应关系标准曲线，再结合第3）步得到的滤液中丙酸的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。
2.根据权利要求1所述的混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，其特征在于：所述步骤1）制作标准曲线时需要配置5-8个浓度梯度在0.1~20 mg/mL之间的丙酸标准工作液进样分析，根据各浓度所测丙酸峰面积的大小与浓度的对应关系做标准曲线，要求相关系数大于0.99。
3.一种混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，本方法的混合型饲料添加剂为防霉剂或酸化剂，防霉剂或酸化剂以二氧化硅和/或蛭石为载体，防霉剂或酸化剂中含有丙酸和丙酸盐，其特征在于：检测步骤如下，
1）配制确定浓度的丙酸标准储备液，取一定体积该标准储备液于容量瓶中，再加入一定体积的预先配置好的内标物标准溶液，用无水乙醇定容，得到丙酸标准溶液；丙酸标准溶液过一次性有机滤膜，滤液用毛细管气相色谱法测定丙酸和内标物的峰面积，再结合丙酸标准储备液和内标物的浓度计算本方法下丙酸相对于内标物的校正因子；
2）将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸，再向待检测样品中加入足量的无水乙醇使待检测样品中的丙酸以及丙酸盐转化成的游离丙酸完全溶解于无水乙醇中，以将丙酸从待检测样品中提取出来，得到混合液；加入无水乙醇提取时应充分振摇或者低温超声，然后离心或者放置6小时以上；
将待检测样品中的丙酸盐转化成游离丙酸按如下方法进行，如果饲料添加剂中丙酸盐唯一且为丙酸铵，则无需进行酸化处理，其可在进样口高温环境下分解为丙酸和氨；否则，则需加入甲酸酸化待检测样品，所加入甲酸为分析纯，添加量应保证能够全部置换出丙酸盐中的丙酸，甲酸加入后充分摇匀，并放置一段时间；
3）取第2）步所得混合液的上清液，将此上清液视为步骤1）中的丙酸标准储备液，按步骤1）操作测定丙酸和内标物的峰面积；
4）根据第1）步得到的丙酸相对于内标物的校正因子，再结合第3）步得到的滤液中丙酸和内标物的峰面积，计算滤液中丙酸的浓度，由此计算出待检测样品中总丙酸含量。
4.根据权利要求3所述的混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，其特征在于：所述内标物为巴豆酸标准品，步骤1）中应重复配置6～8次丙酸标准溶液上机测定，计算本方法下丙酸相对于巴豆酸的平均校正因子。
5.根据权利要求3所述的混合型饲料添加剂中总丙酸含量检测方法，其特征在于：所述步骤2）中提取丙酸的无水乙醇的量同时应满足上清液中丙酸浓度接近丙酸标准储备液浓度。
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Denomination of invention: A method for detecting the total propionic acid content in a mixed feed additive Granted publication date: 20150624 Pledgee: Chongqing Branch of China Everbright Bank Co.,Ltd. Pledgor: CHONGQING MINTAI NEW AGROTECH DEVELOPMENT GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2024500000032 |
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