CN103884681B - 一种基于shws的相位显微镜成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，包括：（1）采集Hartmanngram；（2）计算质心分布；（3）计算波前斜率；（4）重建波前相位；（5）重建三维断层折射率。本发明有效利用SHWS改善了基于干涉法的相位显微镜存在的硬件搭建复杂，重建步骤繁琐，容易受到振动影响从而引入大量噪声的问题；与现有重建方法的实验比较表明，大大简化了其硬件，也简化了重建步骤，并避免受到振动影响。

Description

一种基于SHWS的相位显微镜成像方法

技术领域

本发明属于显微镜成像技术领域，具体涉及一种基于SHWS(Shack-HartmannWavefrontSensor，沙克哈特曼波前探测器)的相位显微镜成像方法。

背景技术

近年来，随着科技的进步，光学显微镜以更高的空间分辨率，更大的成像深度以及对活体细胞无损探测的可行性，成为生物学家和临床研究人员研究的热点。它已经成为生物学和医学研究中必不可少的工具，是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要基础。目前在细胞生物学中，除了普通光学显微镜以外、还有荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、相位显微镜等多种显微镜。

其中，相位显微技术包括相衬显微镜，微分干涉差显微镜和定量相位显微镜等，它们通过测量样本引起的相位延迟来得到可视化的生物结构。生物细胞内，不同的折射率分布将引起光波不同的相位延迟，这些显微技术将折射率的空间差异转换成为图像的对比度。而折射率是物体固有的对比源，同时也是一个重要的生化参数，与分子的浓度成正比。大多数生物细胞在可见光下的吸收可以忽略，但是其内部不同的细胞器之间存在着折射率的差异。因此，在生物学研究中，折射率已经成为一个比吸收率更好的内生对比源。但是，在通常情况下，活体细胞的折射率差异是非常微弱的，这就需要对光信号进行调制来提高成像对比度。

通常，相衬显微镜采用一个使零频衰减同时相移90°的位相板进行空间滤波，将物体的位相结构转换成像平面上的光强分布。微分干涉差显微镜采用两个渥拉斯顿棱镜使两束光在不同时间经过样品的相邻部位，由于样品的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差，从而将样品中的微小差别转化成图像的明暗区别。这两种显微技术利用干涉技术来提高图像对比度，将细胞内折射率差异引起的透射光的相位变化转换成强度分布。但是，这些技术提供的不是定量的相位变化图。定量相位显微镜通过对参考光束进行调制，使得样本光束和参考光束之间产生相移，再对两光束进行干涉来测量样本微小的折射率差异。而近年来发展的相位显微技术已经可以定量的记录由样本引起的相位延迟。但是相位延迟正比于折射率与路径长度的乘积，更一般的讲是折射率与光学***点扩散函数的卷积。因此，这些技术仅可以提供细胞的平均折射率参数或者细胞的厚度，而没有细胞的详细的三维结构。

最近几年，在定量相位显微技术的基础上，很多研究小组已经开发了能够测量生物细胞三维折射率分布的多种新型显微镜技术，如断层相位显微镜、STPM(syntheticaperturetomographicphasemicroscopy，合成孔径层析相位显微镜)、DHM(digitalholographicmicroscopy，数字全息显微镜)、OSH(opticalscanningholography，光学扫描全息显微镜)等。这些显微镜技术的共同策略是采用计算机断层扫描仪多角度采集吸收系数投影数据的方式，记录不同角度的相位投影数据，从而重建出生物细胞的三维折射率分布。这些新型的显微镜技术具有比传统光学显微镜更高的精度和空间分辨率，并且能够得到样品的三维定量结构信息。

然而，传统的三维定量相位显微镜***是以外差马赫-泽德干涉仪为基础搭建起来的，采用时间频率调制法使参考光相对于样本光波产生一个固定的频率差，然后从随时间变化的干涉场中得到样本的定量相位图像，从而计算出各个位置的折射率，再得到细胞内部的结构信息。这样的方法，使得计算过程十分复杂，另外，振动带来的干扰，对测量结果会引入巨大的噪声，从而使得测量结果不准确。

发明内容

针对现有技术所存在的上述技术问题，本发明提供了一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，解决了硬件构造复杂，重建过程繁琐，振动引入噪声等问题。

一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，包括如下步骤：

(1)针对不放样品和放样品两种情况，利用SHWS进行探测得到两种情况下各角度光线对应的Hartmanngram(沙克哈特曼图)；

(2)根据所述的Hartmanngram计算上述两种情况下SHWS前透镜方阵中每一透镜在各角度光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布；

(3)根据所述的质心分布计算出各角度光线通过每一透镜后的波前斜率；

(4)根据所述的波前斜率利用区域迭代法估计每一透镜对各角度光线成像所引入的波前相位，进而得到对应各角度光线的波前相位方阵；

(5)根据所述的波前相位方阵利用FBP法(FilteredBackProjection，滤波后反投影法)对样品进行三维断层折射率重建，得到样品各切片对应的折射率方阵。

所述的步骤(2)中，根据以下算式计算质心分布：

$\begin{array}{cc}{X}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{x}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)I_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{I}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}& Y_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{y}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)I_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{I}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}\end{array}$

其中：X_m,n,θ和Y_m,n,θ分别为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，x_m,n,θ(i,j)和y_m,n,θ(i,j)分别为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口内第i行第j列象元的横坐标和纵坐标，I_m,n,θ(i,j)为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口内第i行第j列象元的信号强度，i、j、m和n均为自然数且1≤i≤M，1≤j≤N，1≤m≤L，1≤n≤L，M和N分别为透镜方阵中第k透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的行数和列数，L为透镜方阵的维度，θ为角度。

所述的步骤(3)中，根据以下算式计算波前斜率：

$\begin{array}{cc}{\mathrm{\βx}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{f}(X_{m,n,\mathrm{\θ}}^c-X_{m,n,\mathrm{\θ}}^r)& {\mathrm{\βy}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{f}(Y_{m,n,\mathrm{\θ}}^c-Y_{m,n,\mathrm{\θ}}^r)\end{array}$

其中：βx_m,n,θ和βy_m,n,θ分别为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n列透镜后的波前斜率的横向分量和纵向分量，和分别为不放样品情况下透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，和分别为放样品情况下透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，f为SHWS与透镜方阵的焦距，m和n均为自然数且1≤m≤L，1≤n≤L，L为透镜方阵的维度，θ为角度。

所述的步骤(4)中，利用区域迭代法基于以下公式估计波前相位：

$\begin{array}{c}{\mathrm{\ω}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{g_{m,n,\mathrm{\θ}}}\[{\mathrm{\ω}}_{m+1,n,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m-1,n,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m,n-1,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m,n+1,\mathrm{\θ}}^{*}\\ +\frac{1}{2h}({\mathrm{\βy}}_{m,n+1,\mathrm{\θ}}-{\mathrm{\βy}}_{m,n-1,\mathrm{\θ}}+{\mathrm{\βx}}_{m+1,n,\mathrm{\θ}}-{\mathrm{\βx}}_{m-1,n,\mathrm{\θ}})\]\end{array}$

其中：ω_m,n,θ为当前迭代透镜方阵中第m行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m+1行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m-1行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m行第n-1列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m行第n+1列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，βy_m,n+1,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n+1列透镜后的波前斜率的纵向分量，βy_m,n-1,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n-1列透镜后的波前斜率的纵向分量，βx_m+1,n,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m+1行第n列透镜后的波前斜率的横向分量，βx_m-1,n,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m-1行第n列透镜后的波前斜率的横向分量，h为透镜的直径，m和n均为自然数且1≤m≤L，1≤n≤L，L为透镜方阵的维度，θ为角度。

本发明有效利用SHWS改善了基于干涉法的相位显微镜存在的硬件搭建复杂，重建步骤繁琐，容易受到振动影响从而引入大量噪声的问题；与现有重建方法的实验比较表明，大大简化了其硬件，也简化了重建步骤，并避免受到振动影响。

附图说明

图1为本发明方法的步骤流程示意图。

图2为基于SHWS相位显微镜成像的光学***示意图。

图3(a)为采用传统相位显微镜的重建结果。

图3(b)为采用本发明基于SHWS相位显微镜的重建结果。

具体实施方式

为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。

如图1所示，一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，包括如下步骤：

(1)针对不放样品和放样品两种情况，利用SHWS进行探测得到两种情况下各角度光线对应的Hartmanngram；

如图2所示，氦氖激光束He-Ne(λ＝633nm)首先入射到扫描振镜GM上。然后，依次穿过透镜L1(f＝200mm)，油浸聚光透镜CL(Nikon,NA＝1.4)后，照射到样品上。GM和样品之间形成4f光学***。样品浸没在一定折射率的溶液中，并放置于两个盖玻片之间，两盖玻片之间用塑料垫片相隔并密封。光束透过样本之后进入一个高数值孔径的油浸物镜OL(Nikon,100×,NA＝1.4)中，然后经由镜筒透镜L2(f＝200mm)成像于SHWS。

(2)根据Hartmanngram基于以下公式计算上述两种情况下SHWS前透镜方阵中每一透镜在各角度光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布：

$\begin{array}{cc}{X}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{x}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)I_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{I}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}& Y_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{y}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)I_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{I}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}\end{array}$

其中：X_m,n,θ和Y_m,n,θ分别为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，x_m,n,θ(i,j)和y_m,n,θ(i,j)分别为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口内第i行第j列象元的横坐标和纵坐标，I_m,n,θ(i,j)为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口内第i行第j列象元的信号强度，i、j、m和n均为自然数且1≤i≤M，1≤j≤N，1≤m≤L，1≤n≤L，M和N分别为透镜方阵中第k透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的行数和列数，L为透镜方阵的维度，θ为角度。

(3)根据质心分布基于以下公式计算出各角度光线通过每一透镜后的波前斜率：

所述的步骤(3)中，根据以下算式计算波前斜率：

$\begin{array}{cc}{\mathrm{\βx}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{f}(X_{m,n,\mathrm{\θ}}^c-X_{m,n,\mathrm{\θ}}^r)& {\mathrm{\βy}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{f}(Y_{m,n,\mathrm{\θ}}^c-Y_{m,n,\mathrm{\θ}}^r)\end{array}$

其中：βx_m,n,θ和βy_m,n,θ分别为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n列透镜后的波前斜率的横向分量和纵向分量，和分别为不放样品情况下透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，和分别为放样品情况下透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，f为SHWS与透镜方阵的焦距。

(4)根据波前斜率利用区域迭代法基于以下公式估计每一透镜对各角度光线成像所引入的波前相位，进而得到对应各角度光线的波前相位方阵：

$\begin{array}{c}{\mathrm{\ω}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{g_{m,n,\mathrm{\θ}}}\[{\mathrm{\ω}}_{m+1,n,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m-1,n,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m,n-1,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m,n+1,\mathrm{\θ}}^{*}\\ +\frac{1}{2h}({\mathrm{\βy}}_{m,n+1,\mathrm{\θ}}-{\mathrm{\βy}}_{m,n-1,\mathrm{\θ}}+{\mathrm{\βx}}_{m+1,n,\mathrm{\θ}}-{\mathrm{\βx}}_{m-1,n,\mathrm{\θ}})\]\end{array}$

其中：ω_m,n,θ为当前迭代透镜方阵中第m行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m+1行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m-1行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m行第n-1列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m行第n+1列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，βy_m,n+1,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n+1列透镜后的波前斜率的纵向分量，βy_m,n-1,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n-1列透镜后的波前斜率的纵向分量，βx_m+1,n,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m+1行第n列透镜后的波前斜率的横向分量，βx_m-1,n,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m-1行第n列透镜后的波前斜率的横向分量，h为透镜的直径。

(5)根据波前相位方阵利用FBP法对样品进行三维断层折射率重建，得到样品各切片对应的折射率方阵；三维折射率重建基于如下方程组：

$f(x,y)={\∫}_0^{\mathrm{\π}}q(s,\mathrm{\θ}){|}_{s=x\cos \mathrm{\θ}+ysin\mathrm{\θ}}d\mathrm{\θ}$

其中：q(s,θ)为投影点在该极坐标位置的值，f(x,y)为重建后的折射率分布。

为了评价层析相位显微镜的成像质量，以下我们采用真实的聚苯乙烯微珠作为样本进行实验。将直径为4.5m，折射率为1.588的聚苯乙烯微珠浸没在折射率为1.518的浸镜油中。微珠中心被放置于显微物镜的焦平面上。入射光束在67到67之间扫描，每隔0.67采集一幅图像，共采集到200幅干涉图像。挑选其中成像质量较好的180幅相位图像用于后续图像的重建，其入射角变化大致在60到60之间。

图3(a)为传统相位显微镜重建结果，图3(b)为本实施方式基于沙克哈特曼波前传感器的相位显微镜重建结果，对沙克哈特曼波前传感器的相位显微镜我们利用了计算可视化技术进行显示。可以看出改进后的显微镜不仅去除了背景伪影而且去除了细胞边缘噪声，分辨率由原来的0.5um左右上升为0.01um左右。非常好的改善了成像质量。

Claims (4)

1.一种基于SHWS的相位显微镜成像方法，包括如下步骤：

(1)针对不放样品和放样品两种情况，利用SHWS进行探测得到两种情况下各角度光线对应的Hartmanngram图；

(2)根据所述的Hartmanngram图计算上述两种情况下SHWS前透镜方阵中每一透镜在各角度光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口的质心分布；

(3)根据所述的质心分布计算出各角度光线通过每一透镜后的波前斜率；

(4)根据所述的波前斜率利用区域迭代法估计每一透镜对各角度光线成像所引入的波前相位，进而得到对应各角度光线的波前相位方阵；

(5)根据所述的波前相位方阵利用FBP法对样品进行三维断层折射率重建，得到样品各切片对应的折射率方阵。

2.根据权利要求1所述的相位显微镜成像方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，根据以下算式计算质心分布：

$\begin{array}{cc}{X}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{x}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)I_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{I}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}& Y_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{y}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)I_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}{\underset{i,j}{\overset{M,N}{\Σ}}{I}_{m,n,\mathrm{\θ}}(i,j)}\end{array}$

其中：X_m,n,θ和Y_m,n,θ分别为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，x_m,n,θ(i,j)和y_m,n,θ(i,j)分别为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口内第i行第j列象元的横坐标和纵坐标，I_m,n,θ(i,j)为透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口内第i行第j列象元的信号强度，i、j、m和n均为自然数且1≤i≤M，1≤j≤N，1≤m≤L，1≤n≤L，M和N分别为透镜方阵中第k透镜在θ°光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口的行数和列数，L为透镜方阵的维度，θ为角度。

3.根据权利要求1所述的相位显微镜成像方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，根据以下算式计算波前斜率：

$\begin{array}{cc}{\mathrm{\βx}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{f}(X_{m,n,\mathrm{\θ}}^c-X_{m,n,\mathrm{\θ}}^r)& {\mathrm{\βy}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{f}(Y_{m,n,\mathrm{\θ}}^c-Y_{m,n,\mathrm{\θ}}^r)\end{array}$

其中：βx_m,n,θ和βy_m,n,θ分别为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n列透镜后的波前斜率的横向分量和纵向分量，和分别为不放样品情况下透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，和分别为放样品情况下透镜方阵中第m行第n列透镜在θ°光线对应的Hartmanngram图中对应探测窗口的质心分布横向分量和质心分布纵向分量，f为SHWS与透镜方阵的焦距，m和n均为自然数且1≤m≤L，1≤n≤L，L为透镜方阵的维度，θ为角度。

4.根据权利要求1所述的相位显微镜成像方法，其特征在于：所述的步骤(4)中，利用区域迭代法基于以下公式估计波前相位：

$\begin{array}{c}{\mathrm{\ω}}_{m,n,\mathrm{\θ}}=\frac{1}{g_{m,n,\mathrm{\θ}}}\[{\mathrm{\ω}}_{m+1,n,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m-1,n,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m,n-1,\mathrm{\θ}}^{*}+{\mathrm{\ω}}_{m,n+1,\mathrm{\θ}}^{*}\\ +\frac{1}{2h}\left({\mathrm{\βy}}_{m,n+1,\mathrm{\θ}}-{\mathrm{\βy}}_{m,n-1,\mathrm{\θ}}+{\mathrm{\βx}}_{m+1,n,\mathrm{\θ}}-{\mathrm{\βx}}_{m-1,n,\mathrm{\θ}}\right)\]\end{array}$

其中：ω_m,n,θ为当前迭代透镜方阵中第m行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m+1行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m-1行第n列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m行第n-1列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，为前一次迭代透镜方阵中第m行第n+1列透镜对θ°光线成像所引入的波前相位，βy_m,n+1,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n+1列透镜后的波前斜率的纵向分量，βy_m,n-1,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m行第n-1列透镜后的波前斜率的纵向分量，βx_m+1,n,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m+1行第n列透镜后的波前斜率的横向分量，βx_m-1,n,θ为θ°光线通过透镜方阵中第m-1行第n列透镜后的波前斜率的横向分量，h为透镜的直径，m和n均为自然数且1≤m≤L，1≤n≤L，L为透镜方阵的维度，θ为角度。