CN103882025A - 双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列及其克隆方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕热休克蛋白70（HSP70）基因序列及其克隆方法。双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列为SEQ ID NO.1中核苷酸序列所示。本发明首次从双齿围沙蚕中克隆到一种热休克蛋白70基因，该序列cDNA全长2161bp，其中开放阅读框位于49-2019位核苷酸，编码656个氨基酸残基。双齿围沙蚕热休克蛋白70基因的成功克隆和测序，为进一步分析HSP70影响下生物抗逆能力，为HSP70其它功能的筛选及应用奠定了基础；也为利用HSP70基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕热休克蛋白70（HSP70）基因序列及其克隆方法。
背景技术
热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是指细胞在应激原特别是环境高温诱导下所产生的一组蛋白质。HSP首先是在果蝇体内发现的。1962年，发现将果蝇的培养湿度从25℃提高到30℃（热休克环境温度升高），30分钟后就可在多丝染色体上看到蓬松现象（或称膨突puff），提示这些区带基因的转录加强并可能有某些蛋白质的合成增加。1974年，人们从热休克果蝇幼虫的唾液腺等部位分离到了6种新的蛋白质，即热休克蛋白。除环境高温以外，其他应激原如缺氧、寒冷、感染、饥饿、创伤、中毒等也能诱导细胞生成热休克蛋白。因此，热休克蛋白（HSP）又称应激蛋白（stress protein,SP），但习惯上仍称为HSP。近年研究表明：热休克蛋白的生成，不仅见于果蝇，而且普遍存在于从细菌至人类的整个生物界（包括植物和动物）。绝大部分生物细胞生成的HSP分子量都在80～110kD、68～74kD和18～30kD之间。作为一个具有多成员的庞大糖蛋白超基因家族，根据其同源程度及相对分子质量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60和小HSP（HSP25、HSP27、HSP28）五大家族。此外，还有一部分HSP是以相关糖蛋白来分类的，如糖相关蛋白94和糖相关蛋白7。不同分子量的热休克蛋白，在细胞内的分布也有所不同，例如，在酵母菌中发现的分子量为89kD的HSP分布于细胞浆中，而分子量为68kD、70kD、110kD的HSP却主要分布于细胞核或核仁区域。
热休克蛋白70是最为保守和重要的一个热休克蛋白家族，具有多种生物学功能，包括分子伴侣功能、参与免疫反应、抗细胞凋亡功能、抗氧化功能、提高细胞的应激耐受性、促进细胞增殖、参与细胞骨架的形成和修复等，其广泛的生物学功能使之成为当今生命科学研究的热点，因此，研究这类进化上非常保守的蛋白基因表达调控机制和相关的信号转导是非常重要的。
双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）属环节动物门多毛纲沙蚕科，作为潮间带地区的常见物种，是各种鱼类、甲壳类和海鸟的重要食饵。由于沙蚕位于水陆生态食物链的底部，能摄食底泥中的沉积物、有机碎屑和微生物等，此外，对重金属和某些工业有机污染物具有一定积累和消化作用，因此被认为是多毛类中耐污染能力较强的底栖生物。多毛类沙蚕可以很好地利用底质中的有机污染物和一些重金属转化为自身的生产力，它们作为海洋食物链中的一个分室既是生产单元，又能够净化底质，使***内部的废弃物再利用和循环，增加环境生态效益，其体内必然存在某种解毒和防御机制，而在其中HSP家族基因是必不可少的研究对象。因此，研究沙蚕热休克蛋白基因为揭示和利用其解毒防御***功能具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双齿围沙蚕热休克蛋白70（HSP70）基因序列及其克隆方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列，双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列为SEQ ID NO.1中核苷酸序列所示。
双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列编码蛋白，双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列编码蛋白为SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。
双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列的克隆方法，首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA；而后采用下游外侧特异性引物HSP70-Outer-R（5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’）和下游内侧特异性引物HSP70-Inner-R（5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’）进行5’-RACE反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’-GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’；通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID NO.1。
本发明具有如下优点：
1.采用本发明对双齿围沙蚕热休克蛋白70基因的成功克隆和测序，首次确定其全部编码序列和部分非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
2.双齿围沙蚕热休克蛋白70基因的成功克隆和测序，为进一步分析HSP70影响下生物抗逆能力，为HSP70其它功能的筛选及应用奠定了基础；
3.利用本发明所得HSP70基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
附图说明
图1为本发明实施例提供的双齿围沙蚕热休克蛋白70在不同浓度Cu胁迫下的表达效果图。
具体实施方式
本发明通过对双齿围沙蚕差减文库中所获得的表达序列标签（EST）与NCBI上的HSP70的EST序列进行比对分析，利用DNAstar中的SeqMan软件分析所有HSP70的同源性区域设计简并引物；其克隆方法包括：（1）通过分析近源物种热休克蛋白70的EST序列及CDS序列的保守区设计简并引物HSP70-Outer-R、HSP70-Inner-R和反向引物HSP70-F；（2）从鲜活健康的双齿围沙蚕成体组织中提取总RNA；（3）利用TaKaRa 5’-Full Race试剂盒及下游外侧特异性引物HSP70-Outer-R和下游内侧特异性引物HSP70-Inner-R进行5’-RACE反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；（4）利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列；另外，该反向引物还可以为序列表中SEQ ID NO.1核苷酸序列片段；（5）通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID NO.1。
本发明首次从双齿围沙蚕中克隆到一种热休克蛋白70基因，该序列cDNA全长2161bp，其中开放阅读框位于49-2019位核苷酸，编码656个氨基酸残基。
实施例1
双齿围沙蚕HSP70基因如SEQ ID NO.1所示：
aaacaaagaa gctccagaaa tccaacgcta cacacgagaa aacacaagat ggcagcacct
gcagtaggta ttgatctcgg caccacatac tcctgcgttg gggttttcca gcacgggaaa
gtggaaatca ttgcaaacga ccagggtaac aggaccacgc ccagttatgt ggcattcaca
gactccgagc gtctcattgg agatgccgca aagaaccaag tggccatgaa ccccgagaac
acagtcttcg acgccaaacg tttgatcgga cgcaagtttg acgactcagc cgttcagtca
gacaaaaagc attggccatt cgatgtggtc agtgagggtg gcaaaccaaa gatctctgtt
gattacaagg gggagaagaa atcattttac ccagaagaga tctcctccat ggtattggtt
aagatgaagg aaacagccga ggcttacatc ggcaagactg ttctaaatgc cgtcgtaaca
gtgcctgcct acttcaacga ttctcagcgc caagcaacca aagatgccgg aactatctct
ggcttgaatg tattacgtat catcaatgaa ccaacggccg ccgccatcgc ttacggtctt
gataagaagg tgggaggaga gagaaatgtc ctgatttttg atctcggtgg tggaaccttc
gatgtgtcca tcttgaccat tgaggatggt atctttgaag tgaagtcaac agccggagac
acccatttgg gaggagagga tttcgacaac agaatggtca accacttcat tcaggaattc
aagcgcaagt tcaagaaaga catctctgac aacaagaggg ctgtaagacg tctccgaaca
gcctgtgagc gtgcgaagag gaccctgtcc tccagcaccc aagccagtat tgaaattgat
tccttgtatg aaggtgtcga cttctacaca accatcacca gggctcgttt tgaggagctg
tgtgccgatc tcttccgagg cactctcgag ccagtagaga agtccatccg tgatgccaag
atgggaaaag atgccatcca cgacatcgtg ttggtcggtg gttccacccg tatccccaag
atccagaaac tccttcagga tttcttcaac ggcaaagaat tgaacaaatc tatcaaccct
gatgaggctg tcgcatacgg agctgccgtt caggctgcca tcttgcacgg tgacaagtca
gaagaggtcc aagacttgct tttgcttgat gtgaccccct tgtcccttgg tatcgagacc
gcgggtggcg tcatgacctc cttgatcaag aggaacacaa ctatccccac caagcagaca
cagaccttca caacctattc cgacaaccag ccaggtgtgt tgatccaagt ttacgagggt
gagcgtgcca tgaccaagga caacaacctc ttgggtaaat tcgagctgtc cggcattccc
cctgctcctc gtggcgttcc ccagatcgag gttaccttcg atattgatgc caacggtatc
ctgaatgtca ctgctgcgga caagagcacc ggcaaggaga acaagattac catcaccaac
gacaaaggcc gtctcagtaa ggaagatatt gaccgcatgg ttaacgaagc cgagcgtctc
aaggctgaag atgatgcgca gagagaacgt atcacagcca agaaccagct ggagagctat
gcgttcaaca tgaaatcaac tgtcgaggac gagaaactga aggacaagat ttccgacgag
gacaagacca agatcactga gaaatgcaac gaggtcatca ggtggttgga ctccaaccag
accgcagaga aggacgagtt tgaacaccaa cagaaggaat tggaaggcat ctgcatgcct
atcatcacca agttgtacca ggcaggtggc gcccctgctg gtggaatgcc cggtggaatg
cccggtggaa tgcccggagg cttcccaggt ggcgctgctc ccggtggaga ctccggtgct
gccccaggtg gtggccccac aatcgaagag gtcgactaat ccatacgtcc tgaaaacacc
gtcgtaactt atttcagaaa cggaacgtgt tcatttatca agtgttctat cgaaatgaat
aacagtgcat ttctatgaaa ctaattggag cttcaaaaaa ggtaaaaaaa aaaaaaaaaa
a
（a）序列特征：
●长度：1971bp 49-2019位核苷酸
●类型：核苷酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：双链DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：双齿围沙蚕
实施例2双齿围沙蚕HSP70基因的克隆方法
从双齿围沙蚕中克隆上述HSP70基因的方法为：
（1）从鲜活健康的双齿围沙蚕成体组织中提取总RNA；
（2）利用TaKaRa 5’-Full Race试剂盒及下游外侧特异性引物HSP70-Outer-R和下游内侧特异性引物HSP70-Inner-R进行5’-RACE反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；
（3）利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列；
（4）通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列。
其中所述引物包括：
下游外侧特异性引物HSP70-Outer-R:5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’
下游内侧特异性引物HSP70-Inner-R:5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’
反向引物HSP70-F:5’-GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’。
具体操作条件如下：
1．RNA提取步骤，
（1）总RNA提取：称取组织1.5g放入用液氮预冷过的碾钵中,在液氮中研磨至粉末状，转至匀浆管，加入1ml的Trizol，充分匀浆；室温放置5min,使其充***解；加入200μl氯仿,用力震荡1分钟，冰浴20分钟；4℃，12000rpm，20分钟离心；从管中吸取上清至另一1.5ml离心管；加入与吸取的上清液等体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀后-80℃沉淀过夜，使RNA沉淀；4℃，13000rpm离心20分钟后，去上清；加入4℃预冷的75%乙醇10ml，洗涤沉淀及离心管壁；4℃，13000rpm离心5分钟，弃上清；加入适量去RNA酶去离子水（RNase Free dH2O），至完全溶解，进行紫外分析测定。
2）5’-RACE反应：操作按照TaKaRa公司的5’-Full Race试剂盒使用说明进行，其中所述的特异性引物包括：
下游外侧特异性引物HSP70-Outer-R:5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’
下游内侧特异性引物HSP70-Inner-R:5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’
具体操作如下：
2．去磷酸化处理
使用碱性磷酸酶（CIAP）对总RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。
（1）按下列组份配制去磷酸反应液：
（2）50℃反应1小时。
（3）向上述反应液中加入20μl的3M醋酸钠（pH5.2），130μl的去RNA酶去离子水后，充分混匀。
（4）再加入200μl的苯酚、氯仿和异戊醇的混合液（苯酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1），充分混匀后13,000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中。
（5）转移的上清液中加入200μl的氯仿，充分混匀后13,000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中。
（6）转移的上层水相中加入2μl的NA载体（NA Carrier）后均匀混合，在加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟，以13,000rpm，4℃离心20分钟，弃上清。
（7）沉淀中加入500μl的4℃预冷的70%乙醇（乙醇由无水乙醇与去RNA酶去离子水配制体积比70%的乙醇）漂洗，13,000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后干燥。
（8）沉淀干燥后加入7μl的去RNA酶去离子水溶解沉淀，得到碱性磷酸酶处理RNA液（CIAP-treated RNA）。
3.“去帽子”反应
使用烟草酸性焦磷酸酶（TAP）去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。
（1）按下列组份配制“去帽子”反应液：
（2）37℃反应1小时；所得反应液为碱性磷酸酶处理RNA液。取5μl碱性磷酸酶处理RNA液用于5′RACE接头连接反应，剩余的5μl保存于-80℃。
4.5′-RACE Adaptor的连接。
（1）首先配制下列溶液：
碱性磷酸酶处理RNA液 5μl
5′RACE接头（15μM） 1μl
去RNA酶去离子水 4μl
（2）65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂：
（3）16℃反应1小时；在加入20μl的3M醋酸钠（pH5.2），140μl的去RNA酶去离子水后，充分混匀。
（4）再加入200μl的苯酚、氯仿和异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇体积比25:24:1），充分混匀后13,000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中。
（5）在转移的上层水相中加入200μl的氯仿，充分混匀后13,000rpm室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中。再加入2μl的NA载体后均匀混合，混匀后加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟，以13,000rpm，4℃离心20分钟，弃上清。沉淀中加入500μl的70%冷乙醇漂洗，13,000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后干燥。
（6）沉淀干燥后加入6μl的去RNA酶去离子水溶解沉淀，得到带接头RNA。
5.反转录反应。
（1）按下列组份配制反转录反应液：
对于立体结构复杂的基因，应该先将带接头RNA变性后再进行反转录反应。具体操作为：首先将带接头RNA和Random 9mers的混合物于70℃变性10分钟后，冰上放置2分钟，再加入反转录反应的其余试剂进行反转录反应。
（2）反转录反应条件：1个循环，30℃ 10min；42℃ 1hr；70℃ 15min。反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于-20℃。
6.Outer PCR反应
PCR反应推荐使用TaKaRa LA Taq酶。
（1）按下列组份配制Outer PCR反应液：
（2）PCR反应条件：1个循环，94℃变性3min；20个循环，94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min。
7.Inner PCR反应
（1）按下列组份配制Inner PCR反应液：
（2）PCR反应条件：1个循环，94℃变性3min；25个循环，94℃变性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min。
PCR产物的克隆：所得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化PCR产物；将回收片段与T-easy载体连接；将全部连接产物转化到大肠杆菌DH-5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素（100μg/ml）和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal0.2μg/ml）的平板过夜，挑取白斑，在LB液体培养基（5ml，含100μg/ml氨苄青霉素）过夜培养。
质粒纯化及测序：取过夜培养菌液1-2ml，10000rpm离心1分钟，收集细胞，用微量DNA纯化试剂盒纯化质粒，步骤按说明书操作。将质粒送与测序公司测序。
8.3’端RT-PCR反应：根据5’-RACE反应的测序结果设计反向引物，反向引物HSP70-F:5’-GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’
9.按下列组份配置RT反应液：
RT反应液42℃反应1h。
10.按下列组份配制PCR反应体系：
PCR反应条件：1个循环，94℃变性2min；40个循环，94℃变性30sec；50℃退火30sec；72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸5min，4℃保温。
按照上述PCR产物克隆、质粒纯化及测序步骤得到3’端序列。拼接矫正5’端和3’端序列结果获得HSP70的cDNA序列，长度为2161bp，其中开放阅读框位于49-2019位核苷酸，这一阅读框编码656个氨基酸残基，该氨基酸具有SEQ ID NO.2所示的序列。
SEQ ID NO.2
MAAPAVGIDL GTTYSCVGVF QHGKVEIIAN DQGNRTTPSY VAFTDSERLI GDAAKNQVAM
NPENTVFDAK RLIGRKFDDS AVQSDKKHWP FDVVSEGGKP KISVDYKGEK KSFYPEEISS
MVLVKMKETA EAYIGKTVLN AVVTVPAYFN DSQRQATKDA GTISGLNVLR IINEPTAAAI
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ANGILNVTAA DKSTGKENKI TITNDKGRLS KEDIDRMVNE AERLKAEDDA QRERITAKNQ
LESYAFNMKS TVEDEKLKDK ISDEDKTKIT EKCNEVIRWL DSNQTAEKDE FEHQQKELEG
ICMPIITKLY QAGGAPAGGM PGGMPGGMPG GFPGGAAPGG DSGAAPGGGP TIEEVD
（a）序列特征：
●长度：656aa
●类型：氨基酸序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：蛋白质
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：双齿围沙蚕
实施例2HSP70的cDNA同源性序列比较
用本发明得到的双齿围沙蚕（Perinereis aibuhitensis）热休克蛋白70的cDNA序列及其编码的蛋白质序列，在GenBank数据库中用BLAST软件（http://www.ncbi.nim.nih.gov/）进行核苷酸和蛋白同源性比对，比对结果为：
根据两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0.005，则两个序列之间具有绝对同源性，即证明序列为同一种基因序列。从比对结果看双齿围沙蚕的基因序列与其他物种的HSP70基因的E值均为0.0，同源性大于90%，所以证明所克隆目的基因是HSP70基因的同源序列。其中HSP70蛋白质结构特征包括：
分子量为71430.5道尔顿（Da），等电点（pI）为5.15，结构包括α螺旋占35.06%，随机卷曲占44.05%，延伸链占20.88%。因此，该氨基酸序列是双齿围沙蚕热休克蛋白70。
实施例3双齿围沙蚕热休克蛋白70在不同浓度Cu胁迫下的表达
分别用含有1mg/L或5mg/L CuSO4人造海水溶液（盐度为16‰）处理上述序列表SEQ ID NO.1中所示双齿围沙蚕24小时，同时提取经含有1mg/L或5mg/L CuSO4人造海水溶液不同处理组的沙蚕和对照组（无CuSO4处理）沙蚕的RNA，总RNA提取方法参见上述实施例，利用荧光定量PCR仪做表达差异分析，定量PCR引物为S1和S2
S1：5'TTTGGTTTGCCACCCTCAC 3'；S2：5'AGGACCACGCCCAGTTATG 3'结果表明，Cu胁迫处理后HSP70的表达量明显增加，分别是对照的38和526倍（参见图1）。
Claims (3)
1.一种双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列，其特征在于：双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列为SEQ ID NO.1中核苷酸序列所示。
2.一种权利要求1所述的双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列编码蛋白，其特征在于：双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列编码蛋白为SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。
3.一种权利要求1所述的双齿围沙蚕热休克蛋白70基因序列的克隆方法，其特征在于：首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA；而后采用下游外侧特异性引物HSP70-Outer-R（5’-AGTCTTGCCGATGTAAGCCT-3’）和下游内侧特异性引物HSP70-Inner-R（5’-TTGGCGTCGAAGACTGTGTT-3’）进行5’RACE反应，克隆得到热休克蛋白70基因5’端序列；再利用反向引物HSP70-F进行RT-PCR反应，克隆得到热休克蛋白70基因3’端序列，反向引物HSP70-F:5’-GGTCAACCACTTCATTCAGG-3’；通过序列片段拼接矫正，最终获得热休克蛋白70基因核苷酸序列SEQ ID NO.1。
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-
2012
- 2012-12-21 CN CN201210563321.3A patent/CN103882025A/zh active Pending
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