CN103881973A - 一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法。本发明提供的用于诱导分化间充质干细胞的培养基为在基础培养基中添加了以下成分：10~30ng/mL脑脊液。本发明还提供了采用该培养基将间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞的方法。本发明提供的培养基及其培养方法，从时间上可以大大缩短神经干细胞、神经元的生长周期，细胞长势良好，分化的细胞以神经元细胞为主，且寿命长，提供了一种无异种动物成分的高效临床级神经前体细胞移植技术平台，并且方法简单、花费少。

Description

一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基及其方法。 

背景技术

干细胞作为形成机体各种组织器官的始祖细胞，在特定条件下具有自我复制和多向分化能力，因此干细胞研究具有为大量严重疾患和损伤带来新型治疗方法的无限潜力。 

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是干细胞研究的一个重要分支，最先在骨髓中被发现，因此被统称为骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs），后来相继在脐带、脂肪组织和皮肤等多种***和器官间质中被发现。 

间充质干细胞具有多向分化能力，在一定诱导条件下具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌腱细胞、脂肪细胞及基质细胞等中胚层细胞分化的能力；同时还可以向外胚层的神经元细胞和内胚层的肝卵圆细胞分化。已有多项研究表明，把MSCs植入体内，可向多种造血以外的组织如心、脑、肺、骨、软骨和皮肤等处定位并分化为相应的组织细胞。可见，MSCs在移植中有着极其重要的应用价值，一方面可以替代坏死细胞发挥生理功能，另一方面分泌特定的细胞因子和介质，能够动员体内干细胞，进行组织修复。因此，MSCs及其衍生物成为当今临床移植治疗难治性疾病主要选择的细胞种类。 

对于MSCs定向分化机制的研究仍处于探索阶段，筛选并总结近年来的相关文献发现，应用于间充质干细胞分化为神经样细胞的方法主要有: (1)细胞生长因子法：NGF、EGF、bFGF、低浓度TNF-α等；(2)化学诱导剂法：β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚、3-叔丁基-4-羟基茴香醚、维甲酸、等；(3)生长因子与化学诱导剂联合；(4)其他：创伤性脑组织匀浆、脑组织上清液、脱细胞神经移植物、与神经细胞、神经干细胞或视网膜色 素上皮细胞共培养或用接近生理状态的条件培养基、基因转染、传统中药黄芩苷、红景天苷、川芎嗪、丹参、天麻、人参等。 

理想的移植细胞应具有创伤小，易于获得，易于体外扩增，移植体内可成活并具有相应的功能，不涉及免疫排斥致瘤性及伦理学问题等。上述常用的化学诱导剂虽可以快速诱导生成神经样细胞，但存在细胞活力差，平均4天出现死亡或凋亡，而细胞生长因子诱导法存在诱导效率低下，诱导周期长，且存活时间短等缺陷，甚至有些文献认为神经因子诱导法生成的神经样细胞，仅仅形态上像神经细胞，并不具备神经细胞的功能。多种方式的联合诱导法也不能避免上述缺陷。与各种细胞和脑组织液共培养诱导法存在细胞采集复杂或异体异种蛋白产生免疫排斥及传播疾病的缺点。 

因此，针对现有技术存在的缺陷，需要进行改进，从而建立临床级间充质细胞和由其衍生的神经前体细胞移植技术平台。 

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基。 

本发明的另一个目的是提供一种诱导分化间充质干细胞的方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供一种诱导分化间充质干细胞的培养基，所述培养基为在基础培养基中添加了以下成分：10~30ng/mL脑脊液。 

优选地，所述基础培养基中包括以下成分：氨基酸、维生素、无机盐和其他成分。

优选地，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸及其盐、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种。 

优选地，所述维生素选自维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺和肌醇中的一种或多种。 

优选地，所述无机盐选自氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和硫酸锌中的一种或多种。 

优选地，所述其他成分选自葡萄糖、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、四 甲烯二胺、丙酮酸钠、植物血球凝集素中的一种或多种。 

优选地，所述脑脊液与待诱导分化的间充质干细胞来源于同种哺乳动物，例如人。

优选地，所述脑脊液与待诱导分化的间充质干细胞来源于同一哺乳动物个体，例如同一人体。优选地，所述脑脊液在干细胞移植进行腰穿鞘内治疗时获得，属自体的。 

本发明还提供了上述培养基在将间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞中的应用。

另一方面，本发明提供一种将间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞的方法，所述方法采用上述培养基诱导分化间充质干细胞。 

优选地，所述方法包括以下步骤：将间充质干细胞接种于上述培养基中，于37℃、100%饱和湿度下的5%CO₂培养箱中进行诱导培养。 

优选地，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。 

优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞或脐带间充质干细胞。 

此外，本发明还提供了上述方法诱导的神经前体细胞。 

本发明还提供了上述神经前体细胞在制备用于治疗难治性神经***疾病的药物中的应用，包括脑损伤、脊髓损伤、运动神经元病、脑性瘫痪、缺血缺氧性脑损伤、帕金森病、阿尔兹海默症等神经***疾病。 

在本发明的一个优选实施方案中，本发明采用自体来源的脑脊液在体外将自体间充质干细胞诱导分化为临床用神经前体细胞，其诱导方法简单、花费少。特别地，脑脊液来源于自体，可以在鞘内干细胞移植治疗同时获得（也就是说，在第一次鞘内注射间充质干细胞进行治疗时，同时取得脑脊液2～5mL，作为诱导脑神经干细胞的渗异因子，培养3天后采用诱导得到的神经干细胞进行第二次鞘内注射），也无免疫排斥和疾病传染的潜在风险。且以同种哺乳动物来源，特别是同一哺乳动物个体来源的脑脊液诱导自体BMSCs，其提供的微环境更利于MSCs化为神经样细胞，更符合临床干细胞移植的需要，诱导早期细胞表达成熟神经元标记物(如β-Tubulin)，星形胶质细胞标志物(如GFAP)，随着诱导时间的延长，诱导分化的方向以成熟的神经元为主，细胞仅表现成熟神经元标记物（NSE、NF）。与其他诱导方式比较，从时间上可以大大缩短神经干细胞、神经元的生长周期，细胞长势良好，分化的细胞以神经元细胞为主，且寿命远大于目前 文献报道。可见，本发明建立了无异种动物成分的高效临床级神经前体细胞移植技术平台，并且方法简单、花费少。 

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中： 

图1为神经前体细胞的形态学鉴定结果图，其中A、B、C、D分别为脑脊液诱导1d、4d、19d、31d形态图。 

图2为神经前体细胞的免疫组化鉴定结果图，其中A为诱导后48h细胞GFAP免疫组化（阳性细胞胞核呈棕黄色，胞浆着色浅）(×200)；B为诱导后72h细胞β-Tubulin III免疫组化（阳性细胞胞核呈棕黄色，胞浆着色浅）(×200)；C为诱导后72h，β-Tubulin III免疫荧光染色（FITC标记二抗，绿色荧光）；GFAP免疫荧光染色（TRITC标记二抗，红色荧光）；D为诱导荧光双标阳性。 

图3为BMSCs脑脊液诱导前后NSE、NF、GFAP mRNA表达量的变化。从左起，1~3道是诱导前的，NSE、NF、GFAP mRNA都没有表达，第4道为NSE（276），第5道为NF（486），第6道为100到600的MAKER，第7道为GFAP。 

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。 

本发明所使用的干细胞，可以采用以下半骨髓法体外培养骨髓间充质干细胞的方法制备，所述方法包括以下步骤： 

(1)人体自体骨髓血浆的制备 

通过无菌采集病人骨髓20~30mL，15IU/mL肝素抗凝，常温下进行1025~1450g水平离心15~20min后，去除细胞层备用，制得人体骨髓血浆。 

(2)自体BMSCs培养基的制备 

将步骤(1)制得的人体自体骨髓血浆以2-5%的体积百分比加入至基础培养基中[该基础培养基的具体配方与实施例1中列出的配方相同（除不含维生素H，含25mg/L(60mM)植物血球凝集素PHA-I之外），pH6.8±0.3，渗透压299±5%]混合。 

(3) BMSCs的提取和培养 

将步骤(1)中获得的细胞层接种于25cm²的培养瓶（含步骤（2）制备的培养基）中，置37℃、100%饱和湿度下的5%CO₂培养箱，48h半量换液，72h后全量更换新鲜培养基，以后每隔3～5天换液1次。 

倒置显微镜下观察，细胞生长达95%融合时，用0.25%胰酶消化传代，一瓶扩增三瓶，每7天扩增传代一次，对间充质干细胞进行纯化。 

实施例1

本实施例提供将间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞的方法，包括步骤： 

（1）诱导培养液的制备 

在无菌条件下取病人脑脊液2-5mL，并加入至基础培养基（基础培养基的成分如下，pH6.8±0.3，渗透压299±5%）中，使得脑脊液在培养液中的含量为10~30ng/mL。 

（2）神经前体细胞的诱导 

在干细胞***最旺盛的时期，即纯化后融合80～90%的间质干细胞（扩增后第2、3代），弃去培养液，以步骤（1）制备的诱导培养液覆盖细胞，三天后获得所需神经前体细胞。 

（3）神经前体细胞的形态学鉴定 

在倒置显微镜下观察，以脑脊液诱导24h细胞形态明显改变，细胞胞质向核收缩，细胞胞体变圆（见图1A）；3d胞体回缩成球，光性增强，回缩球下形成许多突起；4d渐渐形成锥形、三角形，不规则，突起变细增多（见图1B）；7d细胞球完全贴壁生长出更多类似于树突、轴突样结构。继 续维持，相互连接交积成网，19d后渐呈瘤状突起（见图1C），31d可见较多树突、轴突样结构（见图1D），56d开始出现凋亡。 

（4）神经前体细胞的免疫组化鉴定 

β-Tubulin III是一种神经细胞特异性的微管蛋白，是早期神经元的标志，GFAP是神经胶质纤维酸性蛋白，属于中间丝第III类，是星形胶质细胞的标志物。 

各组分别经β-Tubulin III和GFAP免疫组化和荧光免疫组化染色，诱导前均为阴性；诱导后6h各组β-Tubulin III普通免疫组化和免疫荧光染色阳性率都很低，随着诱导时间的延长，阳性细胞率越来越高，诱导后72h的普通免疫组化阳性率和免疫荧光染色最高，对照组（第2、3代间充质干细胞，未加任何诱导剂）无阳性细胞。 

诱导后6h各组细胞GFAP普通免疫组化和免疫荧光染色阳性率都很高，诱导后48h阳性率最高，随着诱导时间的延长，阳性细胞率越来越低，对照组无阳性细胞，诱导72h荧光双标阳性。具体参见图2。 

（5）RT-PCR检测神经前体细胞的NSE、NF、GFAP的表达 

各组诱导前的细胞分别用三种引物通过RT-PCR技术检测NSE、NF、GFAP结果都为阴性，诱导后7d 的细胞 NSE、NF为阳性表达，GFAP仍为阴性，参见图3。 

（6）各代细胞诱导后7天细胞计数，参见表1 

表1各代细胞诱导后7天每瓶（T225培养瓶）细胞计数 

（Mean±SD，×10⁷） （n=7） 

实施例2

本实施例提供实验表明，应用本实施例1所制备的神经前体细胞移植治疗大脑中动脉缺血大鼠模型，研究显示效果明显优于采用细胞因子诱导的干细胞移植组（采用EGF、bFGT各10mL在neurooasal无血清培养基培养3天）。 

（1）行为学实验评分结果 

右侧大脑中动脉梗死大鼠出现了不同程度神经功能缺损的体征，表现为左肢屈曲、向瘫痪侧的转圈运动及跌倒等。移植前两组大鼠改良NSS 评分无差异，在移植术后4天、32天各组神经功能缺损评分明显进行性下降（p<0.05）。脑脊液诱导的BMSC-Ns移植组改良NSS评分比同时间点的细胞因子诱导移植组明显下降 (p<0.01) (见表2)。 

表2 各组改良NSS 评分（Mean±SD， n =8） 

与脑脊液诱导组同期比， * p<0.05 为显著差异；于同组造模后7天比，# p<0.05 为显著差异 

（2）HE染色法观察脑损伤程度及脑组织细胞形态 

梗死面积：移植前各组无显著性差异；移植后2组均比移植前梗塞面积缩小（P＜0.05），脑脊液诱导组为（0.37%±0.019%），细胞因子诱导组为（0.49%±0.051%）。脑脊液诱导组与细胞因子诱导组相比梗死体积缩小（P＜0.01）。 

实施例3

本实施例提供采用实施例1制备的神经前体细胞治疗难治性神经***疾病。 

治疗分别在两个医院进行，医院伦理委员会讨论通过该项治疗，所有患者签订了治疗同意书接受治疗，共治疗脑瘫患者6例，脑梗塞后遗症患者4例，帕金森病3例，脑出血后遗症2例，脑白质病1例，进行性肌营养不良2例，上升型脊髓炎1例，19例患者移植后3 d内，低热1例，给予***5mg后约2小时后体温正常，未再发热，未发现过敏性休克等严重不良反应。自随访至今未观察到任何与干细胞治疗有关的其他不良反应，以下给出其中3例治疗和随访情况报告： 

病例1：李某，男，12岁。因出生12天低血糖、低体温，在上海第二医科大学附属上海儿童医学中心诊断为脑瘫（痉挛型）。患者治疗前身体屈曲，不能平卧，使用双拐仅可以行走5米。于2009年10月28日行骨髓穿刺抽取骨髓28mL，给予体外培养及自体脑脊液诱导后，分别于2009年11月5日、11月12日、11月20日、2010年2月25日共4次蛛网膜下腔移植，每次输注细胞数为（2~4×10⁷）个，无输注相关不良反应，第二次输注前即可以平卧，第三次可以单拐行走50米，第四次治疗后1月， 可以不用拐杖行走300米，现随访1年，可以自行行走500米，无不良反应。所有治疗过程均保存录像资料。 

病例2：刘某，男，42岁，已婚。因脑梗塞后遗症1年，就诊于解放军115医院。患者治疗前需要借助双拐的支撑勉强行走。于2010年1月4日行骨髓穿刺抽取骨髓30mL，给予体外培养及自体脑脊液诱导后，分别于2010年1月12日、1月17日、1月21日、1月24日共4次蛛网膜下腔移植，每次输注细胞数为（3~4×10⁷）个，无输注相关不良反应，第四次治疗后2月，可以独立行走3公里。现随访1年，无不良反应。 

病例3：党某，女，6岁，来自开封市福利院，确诊为脑瘫（痉挛型）。患者治疗前四肢僵硬呈剪刀步。于2010年1月15日行骨髓穿刺抽取骨髓25mL，给予体外培养及自体脑脊液诱导后，分别于2010年1月21日、1月29日、3月10日共3次蛛网膜下腔移植，每次输注细胞数为（2~4×10⁷）个，无输注相关不良反应，现随访1年，患儿剪刀步消失，手可以用筷子，玩玩具，可以独立坐立。 

研究表明，应用本发明的技术方案所得到的神经前体细胞移植治疗部分难治性神经***疾病，有明显疗效。 

Claims (10)

1.一种用于诱导分化间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基为在基础培养基中添加了以下成分：10~30ng/mL脑脊液。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基中包括以下成分：氨基酸、维生素、无机盐和其他成分；

优选地，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸及其盐、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；

优选地，所述维生素选自维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺和肌醇中的一种或多种；

优选地，所述无机盐选自氯化钙、硫酸铜、硝酸铁、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和硫酸锌中的一种或多种；

优选地，所述其他成分选自葡萄糖、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、四甲烯二胺、丙酮酸钠、植物血球凝集素中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述脑脊液与待诱导分化的间充质干细胞来源于同种哺乳动物，例如人；

优选地，所述脑脊液与待诱导分化的间充质干细胞来源于同一哺乳动物个体，例如同一人体。

4.权利要求1至3中任一项所述培养基在将间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞中的应用。

5.一种将间充质干细胞诱导分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1至3中任一项所述培养基诱导分化间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将间充质干细胞接种于权利要求1至3中任一项所述培养基中，于37℃、100%饱和湿度下的5%CO₂培养箱中进行诱导培养。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞为人间充质干细胞。 

8.权利要求5至8中任一项所述方法诱导的神经前体细胞。

9.权利要求9所述的神经前体细胞在制备用于治疗难治性神经***疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述神经***疾病选自：脑损伤、脊髓损伤、运动神经元病、脑性瘫痪、缺血缺氧性脑损伤、帕金森病、阿尔兹海默症。 

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