CN103874925B - 根据乳胶凝集法检测基质金属蛋白酶-3的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明以提供在低值区域反应性高、且确认不到与MMP‑10等其他MMP家族的交叉反应性的、使用针对MMP‑3的单克隆抗体可迅速进行测定、待测样品处理能力高的基于LTIA法的MMP‑3的检测方法作为问题，发现通过使负载单克隆抗体14B1的乳胶粒子和负载单克隆抗体3D3的乳胶粒子与血液待测样品接触的因为抗原抗体反应而产生的凝集作为信号，通过提供检测所述血液待测样品中的人基质金属蛋白酶‑3的乳胶凝集法这样的检测方法、和用于进行所述检测方法的检测试剂和检测试剂盒解决了上述的问题。

Description

根据乳胶凝集法检测基质金属蛋白酶-3的方法
技术领域
本发明是涉及特定的活体物质的检测方法的发明，更具体而言是涉及根据乳胶凝集法检测基质金属蛋白酶-3的方法的发明。
背景技术
基质金属蛋白酶（MMP）-3是软骨细胞或滑膜细胞中产生的蛋白质分解酶，在关节滑膜增殖时增加，有蛋白聚糖、纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白等的细胞外基质的分解作用。从而，血中的MMP-3浓度反映类风湿性关节炎中确认的关节破坏，从而可作为关节炎活动性的指标而有用。在现在市售的MMP-3测定用试剂中，有使用酶联免疫测定法（ELISA法）的试剂、和使用乳胶凝集法（LTIA法）的试剂。
另外，作为关于MMP-3的检测法的现有专利关联文献，可举出国际公开单行本（WO2010/090079）（专利文献1）、特开平4-237499号公报（专利文献2）、特开平11-318449号公报（专利文献3）。另外，作为非专利文献，可举出PRESKY,DH.,et al.,Biochemical andBiophysical Research Communications,1993,vol.193,No.1,pp.364-370（非专利文献1）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开WO2010/090079单行本
专利文献2:特开平4-237499号公报
专利文献3:特开平11-318449号公报
专利文献4:特开昭63-65369号公报
专利文献5:特开昭53-24015号公报
非专利文献
非专利文献1：PRESKY,DH.,et al.,Biochemical and BiophysicalResearch Communications,1993,vol.193,No.1,pp.364-370
非专利文献2：“单克隆抗体实验操作入门”（讲谈社Scientific、安藤民卫、千叶丈著）、1993年8月20日发行
发明内容
发明要解决的技术问题
已经这样进行着血中MMP-3的检测，但在上述的已有的测定试剂中还存在着实用上的问题。即，使用ELISA法的试剂在待测样品处理能力（迅速性）方面有问题，使用乳胶凝集法（LTIA法）的试剂虽确认了迅速性，但已知存在在低值区域与ELISA法的测定值不符的现象。
本发明在基于乳胶凝集法测定血中MMP-3时，发现了不发生低值区域的测定值不对应的单克隆抗体，以提供由使用该抗体的乳胶凝集法的血中MMP-3的检测手段作为课题。
可解决上述的课题的单克隆抗体，一般认为在低值区域反应性高，并且，是从确认不到与MMP-10等其他MMP家族的交叉反应性的针对MMP-3的单克隆抗体中确认得到，但建立具体性的预测是困难的。
解决问题的技术方案
本发明人为解决上述的问题，通过将负载单克隆抗体14B1的乳胶粒子、和负载单克隆抗体3D3的乳胶粒子与血液待测样品接触，将因与血液待测样品中的基质金属蛋白酶-3的抗原抗体反应而产生的凝集作为信号，发现了定量检测所述血液待测样品中的人基质金属蛋白酶-3的、根据乳胶凝集法的检测方法（以下，也称为本发明的检测方法）可解决上述的问题。
上述的2种单克隆抗体基于常规方法、例如，非专利文献2的“单克隆抗体实验操作入门”制造。
另外，在本发明的检测方法中使用的乳胶凝集法（LTIA法），典型地可基于上述的专利文献4、5的公开进行。
即，通过使分别地包被上述的2种单克隆抗体的乳胶粒子与血液待测样品共存，进行所述待测样品中的由人MMP-3和这些的乳胶粒子上的单克隆抗体的结合的，检测所述乳胶粒子的凝集的LTIA法，可定量所述待测样品中的人MMP-3。
第2，本发明提供用于进行上述的检测方法的检测试剂和检测试剂盒。在所述检测试剂及检测试剂盒中含有至少“负载单克隆抗体14B1的乳胶粒子、和负载单克隆抗体3D3的乳胶粒子”。另外，根据需要也可能含有稀释液、清洗液等。
如后面所述的，产生这2种单克隆抗体的杂交瘤各自保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，单克隆抗体3D3保藏为“小鼠-小鼠杂交瘤3D3（保藏号：FERMP-22223）”，单克隆抗体14B1保藏为“小鼠-小鼠杂交瘤14B1（保藏号：FERMP-22225）”。
本发明中，“血液待测样品”是指血清、血浆、全血等的待测样品，特别适宜是血清待测样品或血浆待测样品，再适宜是血清待测样品。
再有，在本说明书中，“基质金属蛋白酶”或“MMP”，只要不特别说明，是指“人基质金属蛋白酶”或“人MMP”。
发明效果
由本发明提供了：使用了下述抗体的基于可进行迅速的测定而待测样品处理能力高的LTIA法的MMP-3的检测方法、及用于进行所述检测方法的检测试剂和检测试剂盒。所述抗体是在低值区域维持反应性且确认不到与MMP-10等的其他MMP家族或与之类似的蛋白质的交叉反应性的、针对MMP-3的2种单克隆抗体－“单克隆抗体14B1”和“单克隆抗体3D3”。
附图说明
图1：显示本发明的检测方法的同时再现性和日差再现性的图。
图2：显示本发明的检测方法中的检测限界和稀释直线性的测定范围的图。
图3：显示本发明的检测方法中的前带的图。
图4：显示本发明的检测方法中的共存物质的影响的图。
图5：显示与使用本发明的检测方法和ELISA法的市售检测试剂的相关性的图。
图6：显示对使用LTIA法的市售检测试剂中得到负值的血液待测样品，用本发明的检测方法进行探讨的结果的图。
图7：显示对使用LTIA法的市售检测试剂中得到正值的血液待测样品，用与本发明的检测方法的相关性进行探讨的结果的图。
实施方式
1.单克隆抗体
单克隆抗体通过根据上述的非专利文献2中记载的方法，通过使用重组蛋白质的免疫制备杂交瘤制造得到。
（1）产生单克隆抗体的克隆的第一次挑选
由上述得到的杂交瘤经下述（i）～（iv）的过程进行第一次选择。结果，锁定了32个克隆。
（i）由ELISA的筛选
从含各自的小鼠来源的杂交瘤的96孔板的孔，选择与rMMP3固相ELISA强反应的上位的孔。即，将在实施各免疫方法的小鼠之中上位的孔，另外在培养放大后也维持阳性的孔等的，合计56孔克隆。
（ii）由有限稀释法的克隆化
对于上述中选择的56孔中的细胞进行由有限稀释法的克隆化时，可建立34个克隆。
（iii）抗体的亚类分型
得到的单克隆抗体亚类使用小鼠单克隆抗体同种型测定用试剂盒（ISO-STRIP小鼠IgG分型试剂盒，1-493-027,Boehringermannheim)，依照试剂盒中附带的操作顺序进行测定。
由上述的有限稀释法克隆化的34个克隆的抗体亚类是，IgG1k是17种克隆、IgG2ak是5种克隆、IgG2bk是10种克隆、IgMk是2种克隆。
（iv）选择
抗体亚类IgM由于抗体纯化方法等烦琐，所以自往后的探讨中排除IgM类的上述2种克隆。
（2）单克隆抗体克隆的第二次挑选
将如上述一样选择的32个克隆各自注射到施用姥鲛烷的BALBc小鼠（雄·8周龄）的腹腔，1周前后及其往后取出腹水，使用硫酸铵沉淀法、及蛋白A Sepharose进行纯化，得到对应于各自的克隆的单克隆抗体。对于各自的单克隆抗体，使用结合各蛋白质的板的EIA法探讨对人MMP-3及MMP-10的反应性。
接下来，将这里锁定的19个单克隆抗体接触固定于市售的体外诊断药用乳胶粒子，探讨作为乳胶制品时的性能，进行进一步的单克隆抗体的锁定。即，进行将确认不到非特异性的乳胶凝集反应（用单一的单克隆抗体不与抗原反应）作为条件的筛选的结果，12个单克隆抗体满足所述条件。接下来，探讨对于这12个克隆组合2个单克隆抗体的66种的组，将对MMP-3得到特异性的乳胶凝集反应的19种的组作为候选。对于这19种单克隆抗体的组，筛选是作为适宜于作为乳胶凝集制品制剂化时的抗体的亚类的IgG1类型，并且不显示测定作为盲检的生理盐水时得知的非特异性凝集反应，测定MMP-3时显示充分的特异性凝集反应的组合。最后，在精查与慢性类风湿性关节炎患者的血清的特异性反应性的结果，最终选择单克隆抗体名“14B1”、“3D3”、和“8A6”的组合。
（3）单克隆抗体的表征
进行如上述确定的单克隆抗体的表征。
（i）亚类
14B1抗体：IgG1/κ
3D3抗体：IgG1/κ
8A6抗体：IgG1/κ
（ii）解离常数（M）
14B1抗体：5.34×10-10
3D3抗体：1.91×10-9
8A6抗体：2.20×10-9
（iii）结合常数（1/Ms）
14B1抗体：2.45×105
3D3抗体：2.09×105
8A6抗体：3.20×105
（iv）特异反应性
由上述的EIA法的探讨的结果确认，3种单克隆抗体均对MMP-3反应的，但基本上确认不到对MMP-10的交叉反应性。
（4）杂交瘤的保藏
产生这3种单克隆抗体的杂交瘤各自保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，单克隆抗体3D3保藏为“小鼠-小鼠杂交瘤3D3（保藏号：FERMP-22223）”，单克隆抗体14B1保藏为“小鼠-小鼠杂交瘤14B1（保藏号：FERMP-22225）”，单克隆抗体8A6保藏为“小鼠-小鼠杂交瘤8A6（保藏号：FERMP-22224）”。
2.本发明的检测方法
进行使用上述的单克隆抗体“14B1”包被的乳胶粒子、及单克隆抗体“3D3”包被的乳胶粒子的，MMP-3检测***（也称为本品）的评价。再者进行联合使用上述的单克隆抗体“8A6”的试验，验证了涉及单克隆抗体“14B1”和“3D3”的本发明的检测方法的独立的优异性。
作为进一步的比较用的试剂，使用由酶联免疫测定法（ELISA法）的市售的MMP-3检测试剂（パナクリアMMP-3“板”第一精细化学制：也称为被认可产品A）、及由LTIA法的市售的MMP-3检测试剂（パナクリアMMP-3“乳胶”第一精细化学制：也称为被认可产品B）。待测样品使用血清待测样品。
使用下述机器。
7170S型自动分析装置（日立公司制）（LTIA试剂的测定中使用的装置）
JCA-BM8060自动分析装置（日本电子公司制）（LTIA试剂的测定中使用的装置）
AccuFLEXEL4000（アロカ公司制）（ELISA试剂的测定中使用的装置）
（1）再现性试验
使用本发明的检测***，进行对同时再现性和日差再现性的试验。结果示于图1。在图1中左表示同时再现性的结果，右坐标图示日差再现性。具体而言，使用2种浓度的样品，测定同时再现性各10次、经5天测定日差再现性各5次。
如图1所示，无论是在同时再现性试验中，还是在日差再现性试验中，变动系数CV（%）均在3%以内，本发明的检测***的再现性良好。
（2）测定范围的探讨
图2是显示由本发明的检测***中的检测限界（左坐标图）和稀释直线性（右坐标图）的测定范围的图。
具体而言，关于检测限界，将样品用生理盐水进行10阶段稀释，各测定10次。然后算出平均值和标准偏差（SD），由±2SD法求出检测限界。关于稀释直线性，将约1300ng/ml的高值样品用生理盐水进行10阶段稀释而制备测定样品。
如图2所示，得知本发明的检测***的对MMP-3的检测限界是8.9ng/ml（左坐标图），上限是1200ng/ml。
（3）前带的确认
图3是显示进行本发明的检测***中的前带现象（由抗原或抗体的过量所致的反应抑制现象）的确认的结果的图。具体而言，对超高值样品进行5阶段稀释而制备测定样品。
如图3所示，至MMP-3浓度5000ng/ml，测定值不落入上述测定范围内，可确认在人来源血液待测样品的测定中，前带现象通常不影响测定结果。
（4）共存物质的影响的探讨
图4是显示本发明的检测***中的共存物质的探讨的结果的图。
具体而言，向2种浓度的样品添加干涉物质，算出添加浓度0浓度（10次测定）的测定值的平均值±10%。当各添加浓度的测定值在添加浓度0浓度的平均值±10%以内时，判断为对测定值无影响。
如图4所示，至下列浓度未发现共存的影响：游离型胆红素是20.0mg/dl、缀合型胆红素是20.0mg/dl、溶血血红蛋白是500.0mg/dl、乳糜（存在高浓度的脂质的溶液）是200℉TU、类风湿因子是500.0IU/ml。
（5）与使用ELISA法的被认可产品A的相关性
图5是探讨本发明的检测***和使用了ELISA法的被认可产品A的相关性的图。
将待测样品用生理盐水稀释，探讨其稀释直线性时，MMP-3至约1200ng/ml得到良好的直线性。本品与被认可产品A的相关性可通过回归式y=1.002x-1.2、相关系数r=0.995确认为良好（待测样品数60）。
（6）与使用LTIA法的被认可产品B的关系（1）
图6是显示对用LTIA法的被认可产品中得到负值的血液待测样品，用本发明的检测方法探讨的结果的图。
用被认可产品B多次确认MMP-3的测定值在低值范围成为负值的例。从而，将所述制品中显示负值的28个待测样品用其他MMP-3检测***进行测定，进行结果比较。
如从图6的左侧的坐标图可知，被认可产品B中是负值的待测样品的全部在本品和使用ELISA法的被认可产品A中成为正值。另外，右侧坐标图显示将所述负值的待测样品用生理盐水稀释而探讨被认可产品A和本品的相关性的结果。结果得知，在此范围的本品和被认可产品A的相关关系良好。被认可产品A由于以ELISA法作为测定原理，从而测定灵敏度优良，但在测定的迅速性和待测样品处理能力上确认有问题。结果得知，在本发明的检测***的测定灵敏度与ELISA法同等程度优良，并且确认由LTIA法的优良的测定的迅速性和待测样品处理能力。
（7）与使用LTIA法的被认可产品B的关系（2）
图7是将本发明的检测***（本品）和被认可产品B的相关关系，对于在使用被认可产品B的测定中确认不到负值的60个待测样品，在由生理用食盐水的稀释中求出的图。
如图所示，得知这60个待测样品中，在被认可产品B和本品中确认良好的相关关系。
使用LTIA法的本发明的检测方法的特征被确认为，测定范围在以MMP-3浓度计大致10～1200ng/ml的宽的范围。被认可产品A是10～800ng/ml左右。另外也得知，也可进行由生理盐水的待测样品稀释。从而，减少由测定逾界的再测定（再检查率）变得可能，可期待在检查现场的作业效率的升高。另外，本发明的检测***与使用测定灵敏度优良的ELISA法的被认可产品A的相关性良好，并且，如使用LTIA法的被认可产品B一样，在低值区域确认不到MMP-3成为负值的现象。从而得知，本发明的检测方法兼具简便性和正确性，有非常适宜于日常的检查中的适用的试剂性能。
（8）本发明的检测***的进一步的显著性的探讨
在上述的针对MMP-3的单克隆抗体的制造工序中，对于与本发明中涉及的单克隆抗体“3D3”和“14B1”一同，使用负载最终候选之中残留的“8A6”的乳胶粒子的情况进行探讨。
即，尽管在使用LTIA法的被认可产品B中是负值，在本发明中涉及的使用单克隆抗体“3D3”和“14B1”的上述的乳胶粒子***和由ELISA法的被认可产品A中，对于检测到MMP-3的3个待测样品，在向负载单克隆抗体“8A6”的乳胶粒子分别组合“3D3”的乳胶粒子和“14B1”的乳胶粒子的试验***中进行MMP-3的检测。并且，进行由本发明的“3D3”的乳胶粒子和“14B1”的乳胶粒子的组合，利用ELISA法的被认可产品A、使用LTIA法的被认可产品B的检测。
结果示于表1。再有，使用7170S型自动分析装置（日立公司制）测定时，负值以“0”表示，在被认可产品B中确认了负值。
表1
表1的结果可确认：与本发明的试验***相比，使用单克隆抗体“8A6”的试验***的检测值有不规则地变高的倾向。如上所述，单克隆抗体“8A6”是与本发明中涉及的单克隆抗体“3D3”和“14B1”一同筛选的最终候选。即，此试验的结果显示，使用本发明的乳胶粒子的检测方法不是通过由公开的筛选方法得到的杂交瘤来源的单克隆抗体整齐划一地实现的。

Claims (5)

1.保藏日为2012年3月2日、保藏地为日本国千叶县木更津市镰足2-5-8 120号房间、保藏号为FERM BP-22223的杂交瘤。
2.由权利要求1所述的杂交瘤所生产的单克隆抗体3D3。
3.保藏日为2012年3月2日、保藏地为日本国千叶县木更津市镰足2-5-8 120号房间、保藏号为FERM BP-22225的杂交瘤。
4.由权利要求3所述的杂交瘤所生产的单克隆抗体14B1。
5.权利要求2所述的单克隆抗体3D3和权利要求4所述的单克隆抗体14B1在制备检测人基质金属蛋白酶-3的检测试剂中的用途，所述检测试剂中含有至少负载单克隆抗体14B1的乳胶粒子和负载单克隆抗体3D3的乳胶粒子。
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