CN103874762A - 胎儿支持组织的灭菌方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备无菌羊膜组织的方法。本发明进一步公开了使用所述无菌羊膜组织的方法。

Description

胎儿支持组织的灭菌方法

相关申请的交叉引用

本发明要求提交于2011年8月26日的美国临时申请No.61/528,059的权益和优先权，该申请通过引用整体并入本文。

发明背景

胎盘是妊娠期间围绕胎儿的临时器官。胎盘允许气体和营养物的运输，并且还提供其他代谢和内分泌功能。羊膜(AM)是填充有羊水的无血管的膜囊。AM是羊膜腔内围绕胎儿的最内层膜。AM还形成了将胎盘连接至胎儿并将氧运输至胎儿的脐带的外层。脐带胶质，一种专门的凝胶状***材料，围绕脐带以在胎动和发育期间保护其免受损害。AM的组织由上皮层和下方无血管基质层组成。绒毛膜包围着羊膜。绒毛膜由两层组成：由滋养层形成的外层和由体壁中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层是由立方体或棱形细胞的内层——细胞滋养层或朗格汉斯层和不含细胞界限的富含成核原生质的外层——合胞体滋养层组成的。

发明内容

在某些实施方案中，本文描述了无菌胎儿支持组织产品，其中，该胎儿支持组织产品的生物学活性得到保持。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射一段足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射约1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80°C下将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃的温度下将胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品具有10^-6的对于无菌胎儿支持组织产品的无菌保证水平(SAL)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品进一步包含辐射防护组合物。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品进一步包含含有甘油或丙二醇或其组合的辐射防护组合物。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品抑制或降低炎症，抑制或减少瘢痕形成，抑制或减少血管发生，抑制或减少粘连，或促进创伤愈合。

在某些实施方案中，本文描述了通过以下方法产生的无菌胎儿支持组织产品，该方法包括：将辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于能有效地将胎儿支持组织产品进行灭菌的剂量的γ-辐射，其中胎儿支持组织产品用含有甘油、丙二醇或其组合的辐射防护组合物进行辐射防护。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射一段足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间。在一些实施方案中，这段时间为约1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，灭菌导致无菌胎儿支持组织产品的无菌保证水平(SAL)为10^-6。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物活性得到保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品进一步包含辐射防护组合物。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品进一步包含含有甘油或丙二醇或其组合的辐射防护组合物。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品抑制或减少炎症，抑制或减少瘢痕形成，抑制或减少血管发生，抑制或减少粘连，或促进创伤愈合。

在某些实施方案中，本文描述了一种对胎儿支持组织产品进行灭菌的方法，该方法包括：将辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于能有效地将胎儿支持组织产品进行灭菌的剂量的γ-辐射，其中胎儿支持组织产品用含有甘油、丙二醇或其组合的辐射防护组合物进行辐射防护。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射一段足以将胎儿支持组织产品灭菌的时间。在一些实施方案中，这段时间为约1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时。在一些实施方案中，该方法进一步包括使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触一段预定的时间的步骤。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。在一些实施方案中，该方法进一步包括在暴露于γ-辐射之前冷冻辐射防护的胎儿支持组织产品的步骤。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷冻。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，灭菌导致无菌胎儿支持组织产品的无菌保证水平(SAL)为10^-6。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的生物活性得到保持。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年。在一些实施方案中，辐射防护组合物为冷冻防护组合物。

在某些实施方案中，本文公开了一种辐射防护组合物。在本文提供的方法的一些实施方案中，辐射防护组合物为溶液。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含约30%至约70%的甘油。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含约50%的甘油。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含约1%至约30%的丙二醇。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含约10%的丙二醇。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触一段足以保持暴露于γ-辐射的胎儿支持组织产品的生物活性的时间。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触一段足以保持暴露于γ-辐射的胎儿支持组织产品的结构完整性的时间。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在4℃下与辐射防护组合物接触。在一些实施方案中，辐射防护组合物进一步包含海藻糖、DMSO或其组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与作为储存介质的辐射防护组合物接触。

在本文提供的方法的一些实施方案中，胎儿支持组织产品在被分配至容器中之后暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在被分配至适合于保持胎儿支持组织产品的无菌性的容器中之后暴露于γ-辐射。

在本文提供的方法的一些实施方案中，γ-辐射的剂量范围为10kGy-60kGy。在一些实施方案中，γ-辐射的剂量范围为17kGy-30kGy。在一些实施方案中，γ-辐射的剂量范围为17kGy-20kGy。在一些实施方案中，γ-辐射的剂量范围为20kGy-24kGy。在一些实施方案中，γ-辐射的剂量范围为25kGy-30kGy。在一些实施方案中，通过暴露于辐射防护剂对胎儿支持组织产品进行辐射防护。

在本文提供的方法的一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前，将辐射防护的胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，通过冻干去除辐射防护的胎儿支持组织产品的约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的含水量。在一些实施方案中，在0℃或低于0℃下将辐射防护的胎儿支持组织产品冻干。在本文提供的方法的一些实施方案中，胎儿支持组织产品在暴露于γ-辐射之前不冻干。

在本文提供的方法的一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于胎盘羊膜、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘、脐带或其任意组合。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品为组织移植物。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品为粉末形式。

在本文提供的方法的一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下储存。在本文提供的方法的一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下运输。

在本文提供的方法的一些实施方案中，胎儿支持组织产品通过以下方法制备，该方法包括：首先，获得包含羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、脐带、胎盘或其任意组合的胎盘组织；其次，洗涤胎盘组织以从胎盘组织中去除血液。在一些实施方案中，该方法进一步包括从胎盘组织中分离羊膜。在一些实施方案中，该方法进一步包括从胎盘组织中分离脐带。在一些实施方案中，该方法进一步包括从胎盘组织中分离绒毛膜。在一些实施方案中，该方法进一步包括从胎盘组织中分离羊膜-绒毛膜。

在本文提供的方法的一些实施方案中，该方法进一步包括使胎儿支持组织产品与基质接触。在一些实施方案中，该基质选自膜、绷带或创伤敷料。

在本文提供的方法的一些实施方案中，该方法进一步包括使胎儿支持组织产品与聚醚砜(PES)膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜接触。

在某些实施方案中，本文描述了一种通过本文提供的任何方法制备的无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品抑制或减少炎症，抑制或减少瘢痕形成，抑制或减少血管发生，抑制或减少粘连，或促进创伤愈合。

在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的个体中的创伤的方法，该方法包括对创伤施用本文提供的无菌胎儿支持组织产品，持续一段足以治疗该创伤的时间。在一些实施方案中，该创伤为烧伤或溃疡。在一些实施方案中，溃疡为足溃疡、糖尿病性溃疡或静脉性溃疡。

在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品为创伤覆盖物。

在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的个体中的脊柱状况的方法，该方法包括向个体施用本文提供的无菌胎儿支持组织产品，持续一段足以治疗该脊柱状况的时间。在一些实施方案中，该脊柱状况选自椎间盘脱出、脊柱粘连、椎间盘炎、退行性/疼痛性椎间盘、刺激性/炎性神经/坐骨神经通路、面/骶髂疼痛、椎骨骨折、骨缺损上暴露的神经结构、笼或侧沟添加剂(additive to cage or lateral gutter)及其组合。

在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的个体中的关节炎状况的方法，该方法包括对个体施用本文提供的无菌胎儿支持组织产品，持续一段足以治疗该关节炎状况的时间。在一些实施方案中，该关节炎状况选自骨关节炎、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、强直性脊柱炎和椎关节强硬。

在某些实施方案中，本文描述了一种在有需要的个体中再生或修复神经、骨骼、肌腱、组织或软骨的方法，该方法包括对个体施用本文提供的无菌胎儿支持组织产品，持续一段足以再生或修复该神经、骨骼、肌腱、组织或软骨的时间。在一些实施方案中，该个体患有选自以下的病症：骨软骨缺陷、关节炎、扳机指、腕管综合征、腕肌腱炎、网球肘、高尔夫球肘、撞击综合征、肩滑囊炎、弹响髋综合征、髋滑囊炎、应力性骨折、外胫炎、软骨软化(Chonromalacia)、跟腱炎、跗管综合征、胫后肌腱炎或它们的组合。

在某些实施方案中，本文描述了一种补充组织的方法，该方法包括向需要补充的组织中注射本文提供的无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品为真皮填充物。

在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的个体中的眼部病症的方法，该方法包括向个体施用本文提供的无菌胎儿支持组织产品，持续一段足以治疗该眼部病症的时间。在一些实施方案中，该眼部病症为眼部创伤或干眼。

在某些实施方案中，本文描述了本文提供的无菌胎儿支持组织产品作为创伤覆盖物、粘连屏障或真皮填充物的用途。

在某些实施方案中，本文描述了本文提供的无菌胎儿支持组织产品作为腱包裹物或神经包裹物的用途。

在某些实施方案中，本文描述了本文提供的无菌胎儿支持组织产品用于抑制或逆转瘢痕形成、炎症、粘连或不期望的血管生成的用途。

在某些实施方案中，本文描述了一种无菌胎儿支持组织产品，其通过γ-辐射进行灭菌，并且与未辐照的胎儿支持组织产品相比具有完整的胎儿支持组织的至少49%的上皮、基质和基底膜层。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品包含辐射防护组合物。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含甘油或丙二醇。

在某些实施方案中，本文描述了一种无菌胎儿支持组织产品，其通过γ-辐射进行灭菌，并且与未辐照的胎儿支持组织产品相比具有至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的活性。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品包含辐射防护组合物。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含甘油或丙二醇。

在某些实施方案中，本文描述了一种无菌胎儿支持组织产品，其通过γ-辐射进行灭菌，并且在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品包含辐射防护组合物。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含甘油或丙二醇。

在某些实施方案中，本文描述了一种对胎儿支持组织产品进行灭菌的改进方法，该方法包括使胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射，所述改进包括：用包含甘油、丙二醇或其组合的辐射防护组合物对胎儿支持组织产品进行辐射防护。在一些实施方案中，所述改进进一步包括在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻。在一些实施方案中，所述改进进一步包括在冷冻温度下对胎儿支持组织产品进行辐照。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

附图说明

本发明的新特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的示例说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1例证了与未γ-辐照的对照相比，γ-辐照的AM样品(在室温下辐射)每单位重量提取的总蛋白质。

图2例证了与未γ-辐照的对照相比，γ-辐照的AM样品(在室温下辐射)每单位重量提取的总HA。

图3例证了与未γ-辐照的对照相比，γ-辐照的AM样品(在室温下辐射)中提取的总HA/提取的总蛋白质。

图4例证了在AM样品的存在下，在有或无RANKL刺激的情况下，鼠RAW264.7巨噬细胞的形态学。

图5例证了AM样品对破骨细胞生成的影响。通过TRAP比色分析来测定AM对破骨细胞的抑制。

图6例证了与冷冻保存的样品相比，AM样品在室温下老化3个月后每单位重量提取的总蛋白质。

图7例证了与冷冻保存的样品相比，AM样品在室温下老化3个月后每单位重量提取的总HA。

图8例证了与冷冻保存的样品相比，AM样品在室温下老化3个月后提取的总HA/提取的总蛋白质。

图9例证了与冷冻保存的样品相比，AM样品在室温下老化3个月后，AM对破骨细胞生成的影响。破骨细胞的抑制作用上午由TRAP比色法测定。通过TRAP比色分析来测定AM对破骨细胞的抑制。

具体实施方式

特定术语

如本文使用的“胎儿支持组织产品”是指来自用于支持胎儿发育的组织的任何分离的产品。胎儿支持组织产品的实例包括但不限于(i)胎盘羊膜(PAM)或基本分离的PAM，(ii)脐带羊膜(UCAM)或基本分离的UCAM，(iii)绒毛膜或基本分离的绒毛膜，(iv)羊膜-绒毛膜或基本分离的羊膜-绒毛膜，(v)胎盘或基本分离的胎盘，(vi)脐带或基本分离的脐带，或(vii)其任意组合。胎儿支持组织产品包括任何形式的胎儿支持组织，包括冻干的胎儿支持组织或由研磨胎儿支持组织得到的粉末。

如本文使用的“辐射防护的胎儿支持组织产品”是指接触了辐射防护组合物的胎儿支持组织产品。

如本文使用的，关于本文所述的无菌胎儿支持组织产品的短语“保持结构完整性”是指与未辐照的胎儿支持组织产品相比，在暴露于γ-辐射后，胎儿支持组织的上皮、基质和基底膜保持完整。通常，如果与未辐照的胎儿支持组织产品相比，胎儿支持组织的大于49%的上皮、基质和基底膜层保持完整，则称该无菌胎儿支持组织产品保持结构完整性。

在胎儿支持组织产品包含羊膜时，在一些实施方案中，如通过苏木精和伊红染色所评估的，AM上皮存在于无菌胎儿支持组织产品中。在胎儿支持组织产品包含羊膜时，在一些实施方案中，如通过阿辛蓝染色所评估的，AM基底膜存在于无菌胎儿支持组织产品中。在胎儿支持组织产品包含羊膜时，在一些实施方案中，如通过高碘酸-希夫反应(PAS)染色所评估的，AM基质存在于无菌胎儿支持组织产品中。

如本文使用的，关于本文公开的无菌胎儿支持组织产品的短语“保持生物活性”是指与未辐照的胎儿支持组织产品相比，在暴露于γ-辐射后，无菌胎儿支持组织产品保持了该胎儿支持组织产品的至少一种生物活性。通常，如果与未辐照的胎儿支持组织产品相比，无菌胎儿支持组织保持了至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的生物活性，则称该无菌胎儿支持组织产品保持至少一种生物活性。在一些实施方案中，与未辐照的胎儿支持组织产品相比，本文公开的无菌胎儿支持组织产品保持基本全部的生物活性。胎儿支持组织产品的示例性活性包括但不限于抑制或减少炎症，抑制或减少瘢痕形成，抑制或减少血管生成，抑制或减少粘连，以及促进创伤愈合。

如本文使用的辐射剂量是指递送的辐射的量。辐射剂量计算为辐射率乘以产品暴露于γ-辐射的时长。

如本文使用的“胎盘羊膜”(PAM)是指来自胎盘的羊膜。在一些实施方案中，PAM是基本分离的。

如本文使用的“脐带羊膜”(UCAM)是指来自脐带的羊膜。UCAM为半透明的膜。UCAM具有多个层：上皮层；基底膜；致密层；成纤维细胞层；和海绵层。其缺乏血管或直接的血供。在一些实施方案中，UCAM是基本分离的。在一些实施方案中，UCAM包含脐带胶质。在一些实施方案中，UCAM包含血管和/或动脉。在一些实施方案中，UCAM包含脐带胶质和血管和/或动脉。

如本文使用的“脐带”是指将正发育的胎儿连接至胎盘的器官。脐带由主要由粘多糖制成的胶状物质——脐带胶质——组成。其包含将含氧的、富含营养物的血液携带至胎儿的一个静脉和携带去氧的、营养物消耗的血液离开的两个动脉。

如本文使用的“胎盘”是指将发育中的胎儿连接至母体子宫壁以允许营养物吸收、废物去除以及经由母体血供的气体交换的器官。胎盘由三层组成。围绕胎儿的最内部的胎盘层被称作羊膜。尿囊是胎盘的中间层(来源于胚胎后肠)；来自于脐的血管穿过该膜。胎盘的最外层——绒毛膜与子宫内膜接触。绒毛膜和尿囊融合形成绒毛***。

如本文使用的“绒毛膜”是指由胚外中胚层和两层滋养层形成的膜。绒毛膜绒毛从绒毛膜出现，侵入子宫内膜，并允许将营养物质从母体血液运输至胎儿血液。绒毛膜由两层组成：由滋养层形成的外层，以及由体壁中胚层形成的内层；羊膜与后者接触。滋养层由立方体或棱形细胞的内层——细胞滋养层或朗格汉斯层和不含细胞界限的富含成核原生质的外层——合胞体滋养层组成。无血管羊膜附着于绒毛膜的内层。

如本文使用的“羊膜-绒毛膜”是指包含羊膜和绒毛膜的产品。在一些实施方案中，羊膜和绒毛膜不分离(即，羊膜天然地粘附于绒毛膜的内层)。在一些实施方案中，羊膜最初与绒毛膜分离，后来在处理过程中与绒毛膜组合。

“基本分离的”或“分离的”是指胎儿支持组织产品已与来源于原始来源生物体的不期望的材料(例如，红细胞、血管和动脉)分离。纯度，或“分离”，可以通过标准方法来测定，并且将通常为至少约10%纯，更通常地至少约20%纯，一般至少约30%纯，并且更普遍地至少约40%纯；在进一步的实施方案中，至少约50%纯，或更常见的是至少约60%纯；在其它实施方案中，至少约95%纯。

如本文使用的“生物活性”是指多肽和多糖的活性。在一些实施方案中，在脐带(和基本分离的脐带)、UCAM(和基本分离的UCAM)、胎盘(和基本分离的胎盘)、PAM(和基本分离的PAM)、绒毛膜(和基本分离的绒毛膜)或羊膜-绒毛膜(和基本分离的羊膜-绒毛膜)中发现了多肽和多糖的活性。

如本文使用的，生物活性或结构完整性的基本保持是指当与未处理的组织的生物活性和结构完整性相比时，胎儿组织支持产品的生物活性和结构完整性只降低了约5%、约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约50%或约60%。

如本文使用的“冷冻”是指将胎儿支持组织产品暴露于低于大约或处于0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃或-100℃约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时或更长的一段时间。

如本文使用的“粉末”是指处于细干颗粒或基质的形式的物质。在一些实施方案中，颗粒的大小是不均一的。在一些实施方案中，颗粒的大小基本上是均一的。

如本文使用的“研磨”是指使胎儿支持组织减小至小颗粒或粉末的任何方法。术语研磨包括微粉化、磨碎、均质化、锉削、碾磨、摩擦、捣碎和破碎。

术语“新鲜的”是指出生后不到24小时并且与其出生后处于基本相同的形式的组织。

术语“受试者”和“个体”可互换使用。如本文使用的这两个术语是指任何动物，优选哺乳动物，包括人或非人。术语患者、受试者和个体可互换使用。这些术语均不应理解为需要医学专业人员(例如，医生、护士、医生助理、护理员、临终关怀工作者)的监护。

如本文使用的术语“治疗”("treat"、"treating"或"treatment")包括缓解、减轻或改善疾病或状况的症状，预防额外的症状，改善或预防症状的潜在代谢原因，抑制疾病或状况，例如，阻止疾病或状况的发展，减轻疾病或状况，导致疾病或状况消退，减轻由疾病或状况引起的状况，或预防性和/或治疗性地终止疾病或状况的症状。

灭菌概述

羊膜(AM)调节成人的创伤愈合并促进组织再生。在某些情况中，AM促进上皮形成，同时抑制间质炎症、血管生成和瘢痕形成。AM已成功用作外科移植物或临时生物贴片，用于治疗需要角膜和结膜表面重建的眼部状况，包括但不限于，持续性上皮缺损、深层角膜溃疡、传染性角膜炎、有症状的大疱性角膜病变、急性斯-约综合征/中毒性表皮坏死松解症(SJS/TEN)、角膜缘干细胞缺陷症、翼状胬肉、睑裂黄斑、结膜松弛症、睑球粘连、formix重建和结膜肿瘤。

在胎儿支持组织产品的制备中使用的不同的保存方法，如冷冻保存、冻干和暴露于γ-辐射，导致AM性质的变化，其转而影响AM移植的临床结果。如本文所述，评估AM性质如生物、生物物理、生物化学、组织学性质的方法用于确定不同的保存方法的效果。

当前适用于眼科手术中的移植的胎儿支持组织产品分为两种形式：“湿式”和“干式”。导致“湿”AM的AM处理方法包括在等渗溶液中处理和冷冻保存。“干”形式的AM是由多种保存方法产生的，该保存方法包括在不同的非等渗溶液中处理、风干、冻干(冷冻干燥)、在培养箱或烘箱中脱水和硅胶干燥。不同的保存方法Cryo-AM、CryoDMSO-AM、Lyo-AM、AD-AM和SG-AM的比较在表1中示出。

表1：羊膜(AM)保存方法

缩写：DMEM–Dulbecco改良的Eagle培养基，DMSO-二甲基亚砜，EDTA-乙二胺四乙酸，PAA-过氧乙酸，PES-过氧乙酸-乙醇灭菌，N/A–不可用)

与其他方法相比，冷冻保存似乎在保留AM的生物学、生物化学和组织学功能方面是较好的保存方法(表1)。冻干是解决储存和运输以及冷冻保存的灭菌挑战的备选方法。然而，仍然担心Lyo-AM相比于Cryo-AM具有相对较低的蛋白质量和生长因子。注意到，在胎盘的供体之间存在生长因子和其它蛋白质的大范围的变化，重要的是，这些成分仍然保存，因为进一步的处理和通过暴露于γ-辐射的灭菌降低蛋白质含量。

如本文所述，胎儿支持组织产品的蛋白质含量和活性成分的保存通过添加防护剂如甘油、丙二醇和DMSO而得到改善。如在提供的实施例中所示，胎儿支持组织产品在高浓度的甘油(例如，约30%-70%)或低浓度的丙二醇(例如，约10%-30%)中的预孵育最好地保护了AM免受辐射的损伤，正如根据从组织中提取的总蛋白质、HA和其他活性成分以及组织学和生物活性所评估的。

本文提供的用于胎儿支持组织产品的最终灭菌的方法允许室温储存胎儿支持组织产品。本文提供的用于胎儿支持组织产品的最终灭菌的方法还允许在室温下运输胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品为在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年或更长时间的无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定至少1年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定至少2年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定至少3年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定至少4年。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定至少4年。

本文提供了用于制备和灭菌胎儿支持组织产品的改进的方法，该方法包括或不包括冻干，包括添加作为冷冻防护剂和/或辐射防护剂的试剂。本文提供了用于制备和灭菌胎儿支持组织产品的改进的方法，该方法包括或不包括冻干，包括添加作为冷冻防护剂和/或辐射防护剂的试剂，和在暴露于γ-辐射之前和/或期间对辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻。本文提供的灭菌方法在保护AM的活性成分和减少冻干过程和使用γ-辐射的最终灭菌过程中对蛋白质和生长因子的破坏方面是有效的。本文提供的灭菌方法在保持胎儿支持组织产品在γ-辐射期间和之后的生物活性和结构完整性方面是有效的。

胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法

本文提供了胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法。本文提供的方法降低了所制备的胎儿支持组织产品中的一种或多种活性生物污染物或病原体例如病毒、细菌、酵母、霉菌、真菌、孢子或朊病毒的水平。本文提供的方法为无菌胎儿支持组织产品提供了至少10-6的无菌保证水平(SAL)。

本文提供的方法包括在通过暴露于γ-辐射对产品进行灭菌之前使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物(RPC)接触(即，在辐射期间溶液保持胎儿支持组织产品的生物活性并且还可保持胎儿支持组织的结构完整性)。在一些实施方案中，辐射防护剂也是冷冻防护组合物(CPC)(即，在冷冻过程中保持胎儿支持组织产品的结构完整性和生物活性)。在一些实施方案中，该方法包括使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物(RPA)和冷冻防护组合物(CPC)接触。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品，和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品，和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。

在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，根据ISO11137、ISO11737或AAMI TIR33标准，辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射，其暴露时间足以将胎儿支持组织产品灭菌，并且辐射剂量能有效地将胎儿支持组织产品灭菌。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触一段预定的时间；并使胎儿支持组织产品暴露于能有效地将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触一段预定的时间；并使胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射，其暴露时间足以将胎儿支持组织产品灭菌，并且辐射剂量能有效地将胎儿支持组织产品灭菌。在一些实施方案中，采用剂量测定法来确定施用的辐射的确切量。

在一些实施方案中，以有效的速率施用辐射。在一些实施方案中，暴露于γ-辐射的有效速率不超过约0.3kGy/hr、1.0kGy/hr、2.0kGy/hr、3.0kGy/hr、6.0kGy/hr、18.0kGy/hr、30.0kGy/hr或45.0kGy/hr。在一些实施方案中，γ-辐射的剂量范围为约10kGy至约60kGy，如约17kGy至约20kGy、约20kGy至约24kGy或约25kGy至约30kGy。在一些实施方案中，施用辐射为或约1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时或更长时间。

在一些实施方案中，通过电子束辐射将胎儿支持组织产品灭菌。生物组织的电子束辐射的方法是本领域已知的，并且包括，例如，美国专利No.6,203,755中所述的方法。

在一些实施方案中，辐射防护组合物包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其任意组合。在特定的实施方案中，辐射防护组合物包含甘油。在特定的实施方案中，辐射防护组合物包含丙二醇。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合。在一些实施方案中，辐射防护组合物包含甘油和丙二醇。在一些实施方案中，辐射防护组合物进一步包含DMSO或海藻糖。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含甘油的溶液。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含丙二醇的溶液。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的有效剂量的辐射，其中该辐射防护的胎儿支持组织产品包含胎儿支持组织产品和包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的有效剂量的γ-辐射，其中辐射防护的胎儿支持组织产品包含胎儿支持组织产品和包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品为冷冻的辐射防护的胎儿支持组织产品。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在辐照辐射防护的胎儿支持组织产品之前对辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻的步骤。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织防护也是冷冻防护的。在一些实施方案中，将辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射(即，辐照)。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括使冷冻辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的有效剂量的辐射，其中辐射防护的胎儿支持组织产品包含胎儿支持组织产品和包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括：(a)对辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻；和(b)使冷冻的辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的有效剂量的辐射，其中辐射防护的胎儿支持组织产品包含胎儿支持组织产品和包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以衣对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油、丙二醇、

DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。

在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品为冷冻的辐射防护的胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，该方法进一步包括在辐照胎儿支持组织产品之前对辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻的步骤。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)对辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油、丙二醇、DMSO、海藻糖或其组合的辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)对辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0°C或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油和丙二醇或其组合的辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油和丙二醇或其组合的辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。

在一些实施方案中，辐射防护组合物为一种溶液，其包含约20%的甘油至约80%的甘油，如约20%的甘油至约70%的甘油，如约30%的甘油至约70%的甘油，如约30%的甘油至约60%的甘油，如约30%的甘油至约50%的甘油。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的甘油的溶液。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含约30%-70%的甘油的溶液。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含约50%的甘油的溶液。

在一些实施方案中，辐射防护组合物为一种溶液，其包含约1%的丙二醇至约40%的丙二醇，如约1%至约30%的丙二醇，如约5%的丙二醇至约30%的丙二醇，如约10%的丙二醇至约30%的丙二醇，如约10%的丙二醇至约25%的丙二醇，如约10%的丙二醇至约30%的丙二醇。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%的丙二醇的溶液。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含约1%-30%的丙二醇的溶液。在一些实施方案中，辐射防护组合物为包含约10%的丙二醇的溶液。

在一些实施方案中，辐射防护组合物是通过在缓冲液或其他等渗溶液中混合辐射防护剂(例如，甘油或丙二醇)来制备的。在一些实施方案中，对该混合物进行匀浆。在一些实施方案中，该缓冲液为磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，该缓冲液为DMEM。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约30%-70%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约30%-70%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为50%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为50%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约10%-30%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约10%-30%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为10%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为10%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；和(b)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一种示例性方法中，将辐射防护组合物加入胎儿支持组织产品中并孵育一段时间。在一些实施方案中，将辐射防护组合物加入胎儿支持组织产品中并孵育1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时或更长。在一些实施方案中，将辐射防护组合物和胎儿支持组织产品在大约室温下孵育。在一些实施方案中，将辐射防护组合物和胎儿支持组织产品在约4℃下孵育。在一些实施方案中，辐射防护组合物为冷冻防护剂。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与辐射防护组合物和冷冻防护剂一起孵育。

在一些实施方案中，在胎儿支持组织产品与辐射防护组合物一起孵育之后并在暴露于辐射之前将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护组合物为冷冻防护剂。在一些实施方案中，在胎儿支持组织产品与辐射防护组合物和冷冻防护剂一起孵育之后并在暴露于辐射之前将胎儿支持组织产品冷冻。

在一些实施方案中，在将胎儿支持组织产品暴露于辐射之前将胎儿支持组织产品冻干。本文提供了用于冻干的示例性方法。在一些实施方案中，在胎儿支持组织产品冻干之前将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，将冷冻的胎儿支持组织产品解冻，然后在暴露于γ-辐射之前将其冻干。在一些实施方案中，通过冻干去除胎儿支持组织产品中约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的含水量。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冻干至完全干燥。在一些实施方案中，不将胎儿支持组织产品冻干至完全干燥。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物(RPC)接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约30%-70%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约30%-70%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为50%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为50%的甘油的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约10%-30%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，

胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含约10%-30%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为10%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于辐射以对胎儿支持组织产品进行灭菌。在一些实施方案中，该辐射为γ-辐射。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品的灭菌方法包括(a)使胎儿支持组织产品与包含为或约为10%的丙二醇的辐射防护组合物接触以产生辐射防护的胎儿支持组织产品；(b)冻干辐射防护的胎儿支持组织产品；和(c)使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于足以将胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃或低于约0℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

在一些实施方案中，在通过辐射灭菌之前从辐射防护的胎儿支持组织产品中去除过量的辐射防护组合物。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品用吸收性材料进行吸收(blotted)以去除过量的辐射防护组合物。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品用水或等渗缓冲液漂洗以去除过量的辐射防护组合物。在一些实施方案中，辐射防护的胎儿支持组织产品用吸收性材料进行吸收以去除过量的水或漂洗缓冲液。

在一些实施方案中，将辐射防护的胎儿支持组织产品置于支持膜上。在一些实施方案中，该膜为聚醚砜(PES)膜、尼龙膜或硝酸纤维素膜。

在一些实施方案中，将辐射防护的胎儿支持组织产品置于适用于胎儿支持组织产品的辐射的包装中。合适的包装包括，例如，在产品辐射期间和之后对外部环境保持密封、不与支持膜反应并且不产生任何与胎儿支持组织产品相互作用的化学品的包装。在一些实施方案中，在暴露于γ-辐射之前将辐射防护的胎儿支持组织产品放置在支持膜上，然后将支持膜和胎儿支持组织产品的组合置于合适的包装中。在一些实施方案中，该膜为聚醚砜(PES)膜、尼龙膜或硝酸纤维素膜。

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织产品并作为“湿式”冷冻防护的胎儿支持组织产品储存。在这类实施方案中，胎儿支持组织产品与作为液体储存介质的辐射防护组合物接触。然后将胎儿支持组织产品与辐射防护组合物的组合物暴露于γ-辐射。储存介质的体积可根据所用的胎儿支持组织产品的类型而变化。在一些实施方案中，该体积为约1ml至约10ml。产品在储存介质中保持为湿的，并且除了在产品过期前以外，对孵育持续时间没有限制。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品储存在-80℃、-40℃、-20℃、4℃或室温下。

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织产品并作为“干式”冻干的胎儿支持组织产品储存。例如，通过使胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触如本文所述的一段时间然后冻干来制备该产品。然后在暴露于γ-辐射之前将冻干的产品储存在-80℃、-40℃、-20℃、4℃或室温下。

冻干

在一些实施方案中，本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法包括在暴露于γ-辐射之前冻干胎儿支持组织产品。冻干的持续时间、进行冻干的温度以及进行冻干的压力可根据期望的结果而变化。对胎儿支持组织产品冻干的必要参数的确定在本领域技术人员的技术范围内。

在一些实施方案中，通过任何合适的方法(例如，暴露于液化气体、放置在冰箱中)将胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织产品放置在冻干装置的真空室中直至去除全部或几乎全部流体(例如，水)。在一些实施方案中，在冻干之前将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，在冻干之前将冷冻的胎儿支持组织产品解冻。在一些实施方案中，在冻干之前不将冷冻的胎儿支持组织产品解冻。

在一些实施方案中，通过冻干去除胎儿支持组织产品中约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的含水量。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冻干至完全干燥。在一些实施方案中，不将胎儿支持组织产品冻干至完全干燥。

主要干燥循环

在任何合适的温度下将胎儿支持组织产品冻干。在一些实施方案中，在处于或低于冷冻的温度下冻干胎儿支持组织产品导致胎儿支持组织产品与未在冷冻或低于冷冻的温度下冻干的胎儿支持组织产品相比具有较高的效能(例如，抗炎效能、抗瘢痕形成效能、抗血管生成效能、抗粘连效能或创伤愈合效能)。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在低于冷冻的温度下冻干。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在低于约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃的温度下冻干。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在-5℃下冻干。

在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约500毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约400毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约300毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约250毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约200毫托的压力下发生。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在100毫托的压力下冻干。在一些实施方案中，降低冻干压力缩短了冻干时间。在一些实施方案中，冻干在小于500毫托的压力下更有效。

在一些实施方案中，进行冻干直至从胎儿支持组织产品中去除基本上所有的水分。所需的冻干时间取决于所用的组织类型、组织的量和组织的厚度。在一些实施方案中，冻干进行多于约12小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约14小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约16小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约18小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约20小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约21小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约22小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约23小时。在一些实施方案中，冻干进行约24小时。

在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在-5℃、100毫托的压力下冻干。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品在-5℃、100毫托压力下冻干约21小时。

在一些实施方案中，本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法进一步包括在冻干后将冻干器的环境温度逐渐增加至室温(即，约25℃)。冻干器温度增加的速率取决于设备的能力。在一些实施方案中，将冻干器的温度增加至室温有助于防止从冻干器中取出组织时的凝结。次要干燥循环

在一些实施方案中，本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法进一步包括次要干燥循环。在一些实施方案中，次要干燥循环在室温(例如，约25℃)下发生。次要干燥循环的温度可以是高于为主要干燥设定的温度的任何温度。在一些实施方案中，如果次要干燥循环的温度在大约室温(例如，25℃)，则降低或防止凝结。

在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约500毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约400毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约300毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约250毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约200毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在约100毫托的压力下发生。在一些实施方案中，降低干燥压力缩短了冻干时间。

在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约24小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约20小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约18小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约16小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续约16小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约14小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约12小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约10小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约8小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约6小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约4小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约2小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约1小时。

无菌胎儿支持组织产品及其性质

本文提供了通过本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法产生的无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，本文提供的无菌胎儿支持组织产品保留了未通过本文提供的方法灭菌的胎儿支持组织产品的一种或多种活性或性质。在一些实施方案中，本文提供的无菌胎儿支持组织产品保留了新分离的胎儿支持组织产品的一种或多种活性或性质。在一些实施方案中，本文提供的无菌胎儿支持组织产品与冷冻保存的胎儿支持组织产品相比具有等价或相似的活性。在一些实施方案中，本文提供的无菌胎儿支持组织产品与冷冻保存的胎儿支持组织产品相比具有增强的活性。在一些实施方案中，本文提供的无菌胎儿支持组织产品与冷冻保存的胎儿支持组织产品相比具有降低的活性。示例性的性质或治疗活性包括但不限于抗炎、抗瘢痕形成、抗粘连、创伤愈合或组织再生。在一些实施方案中，本文提供的无菌胎儿支持组织产品与新分离的胎儿支持组织产品相比保留了约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高的活性。在一些实施方案中，活性是通过破骨细胞测定、巨噬细胞活力测定或TGF-β启动子活性测定进行评估的。活性的示例性测定在本文提供并且是本领域已知的。

在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。例如，在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品包含完整的AM层，包括上皮、基质和基底膜。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品中上皮、基质和基底膜的结构完整性没有受到损害。在一些实施方案中，如通过苏木精和伊红染色评估的，AM上皮存在于无菌胎儿支持组织产品中。在一些实施方案中，如通过阿辛蓝染色评估的，AM基底膜存在于无菌胎儿支持组织产品中。在一些实施方案中，如通过高碘酸-希夫反应(PAS)染色评估的，AM基质存在于无菌胎儿支持组织产品中。

在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品的结构完整性保持6个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月或更长。在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品的治疗活性保持6个月、12个月、18个月、24个月、30个月、36个月、42个月、48个月或更长。

在一些实施方案中，无菌胎儿支持组织产品作为冻干产品提供。在一些实施方案中，在用作治疗剂之前将胎儿支持组织产品再水化。在一些实施方案中，通过使胎儿支持组织产品与缓冲液或与水接触而将本文公开的胎儿支持组织产品再水化。在一些实施方案中，本文公开的胎儿支持组织产品与等渗缓冲液接触。在一些实施方案中，使本文公开的胎儿支持组织产品与盐水、PBS、林格溶液、TRIS缓冲盐水、Hank平衡盐溶液、Hartmann溶液接触。在一些实施方案中，使本文公开的胎儿支持组织产品与水(例如，蒸馏水)接触。

用于这些方法中的胎儿支持组织产品

本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法适用于任何包含胎儿支持组织的生物产品。胎儿支持组织产品从胎儿支持组织的任何合适的来源(例如，医院或组织库)获得。在一些实施方案中，胎儿支持组织从任何哺乳动物如人、非人类灵长动物、牛或猪获得。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于胎盘羊膜(PAM)或基本分离的PAM。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于脐带羊膜(UCAM)或基本分离的UCAM。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于绒毛膜或基本分离的绒毛膜。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于羊膜-绒毛膜或基本分离的羊膜-绒毛膜。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于胎盘或基本分离的胎盘。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于脐带或基本分离的脐带。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品来源于以下一种或多种的任意组合：胎盘羊膜(PAM)或基本分离的PAM，(ii)脐带羊膜(UCAM)或基本分离的UCAM，(iii)绒毛膜或基本分离的绒毛膜，(iv)羊膜-绒毛膜或基本分离的羊膜-绒毛膜，(v)胎盘或基本分离的胎盘，(vi)脐带或基本分离的脐带。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品为

或

在一些实施方案中，根据当前的良好组织实践(cGTP)进行对胎儿支持组织产品的所有处理以确保没有污染物被引入胎儿支持组织产品中。

在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冷冻(例如，在0℃或低于0℃)直至确定供体和样本的合格性。在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品进行冷冻基本上杀死了在胎儿支持组织产品中发现的所有细胞。在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品进行冷冻基本上杀死了在胎儿支持组织产品中发现的所有细胞，同时相对于新鲜的(即，未冷冻的)胎儿支持组织产品保持或增加了胎儿支持组织产品的生物活性。在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品的冷冻导致在胎儿支持组织产品中发现的基本上所有的细胞中代谢活性的丧失。在一些实施方案中，对胎儿支持组织产品的冷冻导致在胎儿支持组织产品中发现的基本上所有的细胞中代谢活性的丧失，同时相对于新鲜的(即，未冷冻的)胎儿支持组织产品保持或增加了胎儿支持组织产品的生物活性(例如，其抗炎、抗瘢痕形成、抗抗原和抗粘连性质)。在一些实施方案中，在应用本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法之前将胎儿支持组织产品冷冻。

在一些实施方案中，不将胎儿支持组织产品冷冻。如果不将胎儿支持组织产品冷冻，则根据本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法所述对其进行处理。

在一些实施方案中，从胎儿支持组织产品中去除基本上所有的血液。在一些实施方案中，在将胎儿支持组织产品冷冻之前从胎儿支持组织产品中去除基本上所有的血液。在一些实施方案中，在根据本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法所述对胎儿支持组织产品进行处理之前从胎儿支持组织产品中去除基本上所有的血液。

在一些实施方案中，不从胎儿支持组织产品中去除血液。在一些实施方案中，在将胎儿支持组织产品冷冻之前不从胎儿支持组织产品中去除血液。在一些实施方案中，在根据本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法所述对胎儿支持组织产品进行处理之前从解冻的胎儿支持组织产品中去除基本上所有的血液。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品与等渗缓冲液接触。在一些实施方案中，使胎儿支持组织产品与盐水、PBS、PBS1X、林格溶液、Hartmann溶液、TRIS缓冲盐水、HEPES缓冲盐水、EBSS、HBSS、Tyrode盐溶液、Grey平衡盐溶液、DMEM、EMEM、GMEM、RPMI或其任意组合接触。

在一些实施方案中，在搅拌下用缓冲液洗涤胎儿支持组织产品以去除过量的血液和组织。在一些实施方案中，在搅拌下洗涤胎儿支持组织产品。

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品为脐带或脐带羊膜。在一些实施方案中，不从脐带或脐带羊膜中去除脐带胶质。在一些实施方案中，从脐带或脐带羊膜中去除部分或全部脐带胶质。

脐带包含两个动脉(脐动脉)和一个静脉(脐静脉)。在某些情况下，该静脉和动脉环绕(或悬浮或包埋)在脐带胶质内。在一些实施方案中，不从脐带去除该静脉和动脉。在一些实施方案中，从脐带去除该静脉和动脉。在一些实施方案中，在脐带胶质的去除的同时将该静脉和动脉去除。

在一些实施方案中，使用FDA许可的筛选试验针对HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型肝炎和丙型肝炎、西尼罗河病毒(West Nile virus)、巨细胞病毒、查加斯病(chagas)、人类传染性海绵状脑病(例如，Creutzfeldt-Jakob病)和苍白密螺旋体(treponema pallidum)来检测胎儿支持组织产品。组织被HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型肝炎和丙型肝炎、西尼罗河病毒或巨细胞病毒污染的任何迹象导致组织标本的立即隔离和随后的破坏。

此外，针对乙型肝炎、丙型肝炎或HIV感染的危险因素和临床证据检查供体的医疗记录。供体具有被HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙型肝炎和丙型肝炎、西尼罗河病毒、巨细胞病毒、查加斯病、人类传染性海绵状脑病(例如，Creutzfeldt-Jakob病)和苍白密螺旋体感染的危险因素和/或临床证据的任何迹象导致组织标本的立即隔离和随后的破坏。

冷冻

在一些实施方案中，在应用本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法之前将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，在应用本文提供的胎儿支持组织产品的制备和灭菌方法之前通过暴露于低于约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃的温度将胎儿支持组织产品冷冻。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在冷冻之前与辐射防护组合物接触。在一些实施方案中，在冷冻之前使胎儿支持组织产品与冷冻防护剂接触。在一些实施方案中，辐射防护组合物为冷冻防护剂。在一些实施方案中，胎儿支持组织产品在冷冻之前与辐射防护组合物和冷冻防护剂接触。

在一些实施方案中，在约-40℃下将样品冷冻。在一些实施方案中，在冻干之前对胎儿支持组织产品进行冷冻导致胎儿支持组织产品与在冻干之前未进行冷冻的胎儿支持组织产品相比具有更高的效能(例如，抗炎效能、抗瘢痕形成效能、抗血管生成效能、抗粘连效能或创伤愈合效能)。

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织产品的方法包括(a)冷冻胎儿支持组织产品，和(b)干燥胎儿支持组织产品。

用于制备胎儿支持组织产品粉末的处理

在一些实施方案中，胎儿支持组织产品为粉末形式。在一些实施方案中，将胎儿支持组织产品冻干，然后磨成粉末。

冻干

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法包括在研磨胎儿支持组织之前冻干胎儿支持组织。冻干的持续时间、进行冻干的温度以及进行冻干的压力可根据期望的结果而变化。对必要参数的确定在本领域技术人员的技术范围内。

在一些实施方案中，通过任何合适的方法(例如，暴露于液化气体、放置在冰箱中)将分离的胎儿支持组织冻干。在一些实施方案中，将分离的胎儿支持组织放置在冻干装置的真空室中直至去除全部或基本上全部流体(例如，水)。

在一些实施方案中，在冻干之前将胎儿支持组织冷冻。

主要干燥循环

在任何合适的温度下将胎儿支持组织冻干。在一些实施方案中，在处于或低于冷冻的温度下冻干胎儿支持组织导致胎儿支持组织粉末产品与未在处于或低于冷冻的温度下冻干的胎儿支持组织粉末产品相比具有更高的效能(例如，抗炎效能、抗瘢痕形成效能、抗血管生成效能、抗粘连效能或创伤愈合效能)。在一些实施方案中，胎儿支持组织在低于冷冻的温度下冻干。在一些实施方案中，胎儿支持组织在低于约0℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-75℃、-80℃、-90℃、-100℃的温度下冻干。在一些实施方案中，胎儿支持组织在-5℃下冻干。

在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约500毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约400毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约300毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约250毫托的压力下发生。在一些实施方案中，主要干燥循环在低于约200毫托的压力下发生。在一些实施方案中，胎儿支持组织在100毫托的压力下冻干。在一些实施方案中，降低冻干压力缩短了冻干的时间。在一些实施方案中，冻干在低于500毫托的压力下更有效。

在一些实施方案中，进行冻干直至胎儿支持组织足够干燥以使胎儿支持组织能够有效地研磨。研磨的容易程度和效率随着胎儿支持组织的干燥度而增加。在一些实施方案中，进行冻干直至从胎儿支持组织中去除基本上所有的水分。所需的冻干时间取决于所用的组织类型、组织的量和组织的厚度。在一些实施方案中，冻干进行多于约12小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约14小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约16小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约18小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约20小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约21小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约22小时。在一些实施方案中，冻干进行多于约23小时。在一些实施方案中，冻干进行约24小时。

在一些实施方案中，胎儿支持组织在-5℃、100毫托压力下冻干。在一些实施方案中，胎儿支持组织在-5℃、100毫托压力下冻干约21小时。

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法进一步包括在冻干后将冻干器的环境温度逐渐增加至室温(即，约25℃)。冻干器温度增加的速率取决于设备的能力。在一些实施方案中，将冻干器的温度增加至室温有助于防止从冻干器中取出组织时的凝结。

次要干燥循环

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法进一步包括次要干燥循环。在一些实施方案中，次要干燥循环在室温(例如，约25℃)下发生。次要干燥循环的温度可以是高于为主要干燥设定的温度的任何温度。在一些实施方案中，如果次要干燥循环的温度为大约室温(例如，25℃)，则降低或防止凝结。

在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约500毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约400毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约300毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约250毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在低于约200毫托的压力下发生。在一些实施方案中，次要干燥循环在约100毫托的压力下发生。在一些实施方案中，降低干燥压力缩短了冻干时间。

在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约24小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约20小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约18小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约16小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续约16小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约14小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约12小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约10小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约8小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约6小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约4小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约2小时。在一些实施方案中，次要干燥循环持续少于约1小时。

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法进一步包括在25℃、100毫托压力下的次要干燥循环。在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法进一步包括在25℃、100毫托压力下持续少于约16小时的次要干燥循环。

在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法包括在约-5℃、约100毫托的压力下的主要干燥循环和在约25℃、约100毫托的压力下的次要干燥循环。在一些实施方案中，制备胎儿支持组织粉末产品的方法包括在约-5℃、约100毫托的压力下持续约21小时的主要干燥循环和在约25℃、约100毫托的压力下持续少于约16小时的次要干燥循环。

研磨

在一些实施方案中，通过任何合适的方法来研磨胎儿支持组织。研磨的持续时间和频率可根据所期望的结果而变化。对必要参数的确定在本领域技术人员的技术范围内。

在一些实施方案中，通过使用研磨容器对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，使用粉碎机(例如，Bessman组织粉碎机或Covaris CryoPrep)来对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，通过使用组织研磨机(例如，Potter-Elvehjem研磨机或WheatonOverhead搅拌机)来对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，通过使用超声波仪对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，通过使用珠磨器(bead beater)对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，通过使用冰箱/磨粉机(例如，SPEX SamplePrep冰箱/磨粉机)对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，使用研杵和研钵对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，通过手动使用研杵和研钵对冻干的胎儿支持组织进行研磨。

在一些实施方案中，通过使用研磨容器对冻干的胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，在约10Hz至约25Hz的频率下对胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，在约10Hz的频率下对胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，在约15Hz的频率下对胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，在约20Hz的频率下对胎儿支持组织进行研磨。在一些实施方案中，在约25Hz的频率下对胎儿支持组织进行研磨胎儿支持组织。在一些实施方案中，研磨持续任何合适的时间长度。研磨频率越低，研磨冻干的胎儿支持组织所需的时间长度越大。研磨持续时间随着所需粉末的形式而变化。在一些实施方案中，研磨持续约1至约6分钟，例如约1分钟、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟或约6分钟。

在一些实施方案中，研磨冻干的胎儿支持组织进一步包括连续冷冻冻干的胎儿支持组织。例如，在一些实施方案中，将冻干的胎儿支持组织放置在研磨容器中并且使研磨容器暴露于低于0℃的温度(例如，将研磨容器浸没于液氮中或包含自动液氮冷却特征的容器中)。

使用方法

本文提供了使用本文所公开的无菌胎儿支持组织产品的方法。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于抑制下列中的至少一个：瘢痕形成、炎症、粘连和血管生成。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于促进创伤愈合。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂之外的另一种物质。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖物(例如，创伤覆盖物)。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于促进创伤修复。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作粘连屏障。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在本文所公开的无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。

损伤组织修复和补充

在某些实施方案中，本文公开了本文所公开的无菌胎儿支持组织产品在修复、重建、替换或补充受体的受损的、损伤的或缺失的组织中的用途。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作创伤覆盖物或用于促进创伤修复。在一些实施方案中，所述应用是同源应用(例如，功能同源应用或结构同源应用)。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，组织由于损害(例如，烧伤；手术切口；由感染、创伤或毒素引起的坏死区域；撕裂)而受损、损伤或缺失。在一些实施方案中，组织由于烧伤而受损、损伤或缺失。在一些实施方案中，组织由于创伤而受损、损伤或缺失(例如，切口、撕裂、擦伤)。在一些实施方案中，组织由于坏死而受损、损伤或缺失。在一些实施方案中，组织由于溃疡而受损、损伤或缺失。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物聚糖(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在本文所公开的无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。烧伤

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于烧伤。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于一度烧伤。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于二度烧伤。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于三度烧伤。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于烧伤上之前应用于基质。

创伤

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于皮肤创伤(例如，切口、撕裂、擦伤、溃疡、刺伤、穿透)。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于创伤上之前应用于基质。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于器官(例如，皮肤、脑、胃、肾、肝、肠、肺、膀胱、气管、食道、***、输尿管和血管壁)中的切口。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于手术切口。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于结肠切除部位。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于胃切除部位。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于***手术(例如，***缩小手术、***增大手术和***切除)部位。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于创伤上之前应用于基质。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖皮肤切口(例如，表皮、真皮和/或皮下组织的切口)的覆盖物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于在痔疮手术后对皮肤进行修复或补充。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于创伤上之前应用于基质。

坏死

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作在坏死组织(例如，源于感染)区域上的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作在坏死皮肤区域上的防护性移植物。在一些实施方案中，将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于坏死组织区域之上。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于坏死组织上之前应用于基质。

溃疡

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖溃疡的防护性覆盖物。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于溃疡上之前应用于基质。

在一些实施方案中，溃疡是足溃疡(例如，糖尿病足溃疡或动脉供血不足溃疡)。在一些实施方案中，治疗足溃疡包括(a)准备创伤(例如，创伤清创)；和(b)将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于创伤之上。在一些实施方案中，治疗足溃疡包括(a)准备创伤(例如，创伤清创)；(b)将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于创伤之上；和(c)用防护性屏障(例如，silvercell敷料、metipel、纱布或绷带)覆盖无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于溃疡上之前应用于基质。

在一些实施方案中，溃疡是静脉淤滞(VS)溃疡。在一些实施方案中，治疗VS溃疡包括(a)准备创伤(例如，创伤清创)；和(b)将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于创伤之上。在一些实施方案中，治疗VS溃疡包括(a)准备创伤(例如，创伤清创)；(b)将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于创伤之上；和(c)用防护性屏障(例如，创伤纱罩、抗菌敷料、纱布或绷带)覆盖该无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于创伤上之前应用于基质。

在一些实施方案中，溃疡是角膜溃疡(即，溃疡性角膜炎)。在一些实施方案中，治疗角膜溃疡包括(a)准备创伤(例如，创伤清创)；和(b)将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于创伤之上。在一些实施方案中，治疗角膜溃疡包括(a)准备创伤(例如，创伤清创)；(b)将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品置于创伤之上；和(c)用防护性屏障(例如，接触镜或绷带)覆盖该无菌胎儿支持组织产品或无菌胎儿支持组织产品。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品在置于创伤上之前应用于基质。

软组织用途

在某些实施方案中，本文公开了本文所公开的无菌胎儿支持组织产品在修复、重建、替换或补充受体的受损的、损伤的或缺失的软组织(例如，肌腱)中的用途。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物聚糖(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在本文所公开的无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖软组织(例如，眼睑在软组织的不同层之间形成组织平面)中的切口的覆盖物。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品应用于基质，随后被用作覆盖软组织(例如，眼睑在软组织的不同层之间形成组织平面)中的切口的覆盖物。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作软组织的结构(构造)支承物。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品预防关节或肌腱修复中的粘连。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于肌腱或关节修复(诸如，回旋套修复、手部肌腱修复)。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于增强肌腱或关节。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于预防愈合的肌腱与周围组织、肌腱或关节的粘连。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于预防肌腱上瘢痕组织的形成。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于增大足部和踝部的较小肌腱和韧带，包括胫后肌腱、腓骨（personneal）肌腱、屈肌和伸肌肌腱，以及侧踝复合体（lateral ankle complex）的韧带。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于加强膝周围的四头肌腱和髌腱的主要修复。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作关节置换中的骨移植物的骨膜贴片。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于在全关节修正手术后增大有缺陷的髋和膝囊组织。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于撕裂性回旋套的修复。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作在回旋套肌肉或肌腱(例如，冈上肌腱)上的贴片。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于重建回旋套肌肉或肌腱(例如，冈上肌腱)。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于增大回旋套肌肉或肌腱(例如，冈上肌腱)。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于增强回旋套肌肉或肌腱(例如，冈上肌腱)。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于预防软组织与回旋套肌肉或肌腱(例如，冈上肌腱)的粘连。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于修复牙龈。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于修复牙龈退缩。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质并用作覆盖牙龈的贴片。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质并用作覆盖暴露的牙根表面的贴片。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于重建牙龈。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于增大牙龈。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于增强牙龈。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于预防软组织与牙龈的粘连。

在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖筋膜切口或撕裂的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作筋膜的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对筋膜的置换或补充。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复疝(例如，修复筋膜)。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复***。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复股疝。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复脐疝。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复切口疝。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复膈疝。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复腹膜后疝、上腹疝、憩室疝、腰疝、逆行性箝闭疝、闭孔疝、灯笼裤状疝(pantaloon hernia)、食管旁疝、脐旁疝、***疝、腹膜外疝、里克特疝、滑疝、坐骨疝、斯皮格耳氏疝、运动疝、韦尔波疝或Amyand疝。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于修复椎间盘疝(spinaldisc herniation)。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖椎间盘切口或撕裂的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖纤维化环切口或撕裂的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作椎间盘的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作纤维化环的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对椎间盘的置换或补充。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作椎间盘的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对纤维化环的置换或补充。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于覆盖脑中或脑脊膜(即，硬膜、软膜和/或蛛网膜)其中之一(或全部)的切口。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作脑脊膜(即，硬膜、软膜和/或蛛网膜)其中之一(或全部)的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对脑脊膜(即，硬膜、软膜和/或蛛网膜)其中之一(或全部)的置换。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于覆盖肺部或胸膜切口。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作胸膜的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对胸膜的置换。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于覆盖鼓膜切口。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作鼓膜的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对鼓膜的置换。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖心脏或心包切口的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作心包的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对心包的置换。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖腹膜切口的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作腹膜的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对腹膜的置换。

眼部用途

在某些实施方案中，本文公开了本文所公开的无菌胎儿支持组织产品在修复、重建、替换或补充受体的受损的、损伤的或缺失的眼组织的用途。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物聚糖(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在本文所公开的无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。青光眼的治疗

如本文使用的“青光眼”意指特征在于视神经中缺乏视网膜神经节细胞的疾病。在某些情况下，青光眼部分或全部是由前房(AC)的眼内压升高导致的。眼内压根据眼部睫状突产生液态房水以及通过小梁网引流房水而变化。

青光眼引流装置(GDD)是植入眼内的医疗器械，其通过提供房水引流替代途径来缓解眼内压。GDD管若无遮蔽将会腐蚀且使眼部易发生眼内感染。因此，需要遮蔽GDD管。目前，用于遮蔽GDD管的贴片由心包、巩膜和角质层制成。这些贴片为约400-550微米厚。这些贴片的厚度导致其在两年内熔解25%，可能使分流器管再次暴露。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于遮蔽GDD管。在一些实施方案中，该基质/无菌胎儿支持组织产品为300-600微米厚。在一些实施方案中，该基质/无菌胎儿支持组织产品在两年内不会溶解25%。

眼溃疡的治疗

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于遮蔽眼部持续性上皮缺缺陷和/或溃疡。

在一些实施方案中，用手术海绵对溃疡基部进行清创，并去除溃疡边缘附近(例如，上皮细胞变得附着性很强的眼部分附近)的附着性较差的上皮。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品转移到受体的眼部。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且随后用缝线(例如，中断的10-0尼龙缝线或连续的10-0尼龙缝线)将该基质/无菌胎儿支持组织产品固定在眼中，并将线结埋入。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且通过使用纤维蛋白胶将该基质/无菌胎儿支持组织产品固定到眼部。在一些实施方案中，应用防护层覆盖该无菌胎儿支持组织产品/基质或整个眼睛(例如，接触镜)。在一些实施方案中，该基质/无菌胎儿支持组织产品进一步包含抗生素(例如，新霉素、硫酸多粘菌素B和***)。

结膜、巩膜、眼睑和眼眶边缘表面重建

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品用于结膜、巩膜、眼睑和眼眶边缘表面重建。在一些实施方案中，结膜表面损伤由以下引起：睑球粘连溶解；手术去除肿瘤、病变和/或瘢痕组织；准分子激光光致折变角膜切除术和治疗性角膜切除术；或其组合。

冠状动脉用途

在某些实施方案中，本文公开了本文所公开的无菌胎儿支持组织产品在修复、重建、替换或补充受体的受损的、损伤的或缺失的冠状动脉组织中的用途。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，AM不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物聚糖(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在该无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。

冠状动脉旁路

本文公开了本文所述的无菌胎儿支持组织产品在冠状动脉旁路中的用途。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且将该基质/无菌胎儿支持组织产品移植到冠状动脉上以使特征在于动脉粥样硬化的动脉部分绕道。

心脏瓣膜

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品应用于覆盖心脏瓣膜。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作心脏瓣膜的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对心脏瓣膜的置换。静脉和动脉

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品应用于静脉或动脉。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作静脉或动脉的结构(构造)支承物。

神经用途

在某些实施方案中，本文公开了本文所公开的无菌胎儿支持组织产品在修复、重建、替换或补充受体的受损的、损伤的或缺失的神经中的用途。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物聚糖(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在本文所公开的无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖神经(例如，外周神经)的覆盖物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖神经移植物、神经转移物或修复的神经的覆盖物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖神经(例如，外周神经)切口的覆盖物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作神经(例如，外周神经)的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品预防神经修复中的粘连。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作受损神经的非收缩性包装。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品预防或最小化瘢痕形成、包囊、慢性压迫、神经栓系和神经卡压。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品预防或最小化神经瘤形成。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品预防或最小化神经修复期间出现的内源性生长因子(即神经生长因子)迁移。

脊柱用途

在某些实施方案中，本文公开了本文所述的无菌胎儿支持组织产品在脊柱手术期间的用途。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品在椎板切除术期间使用。在一些实施方案中，所述应用是同源应用。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品进行最低限度的操作。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不包含除水、类晶体或灭菌剂、防腐剂或储存剂以外的另一种物质。在一些实施方案中，该无菌胎儿支持组织产品不具有***效应，并且其主要功能不依赖于活细胞的代谢活动。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品包含蛋白质、聚糖、蛋白质-聚糖复合物聚糖(例如，透明质酸和IαI重链与PTX3的复合物)以及促进组织修复的酶。例如，AM间质包含生长因子、抗血管生成蛋白和抗炎蛋白，以及对各种蛋白酶的天然抑制剂。在一些实施方案中，在本文所公开的无菌胎儿支持组织产品中发现的蛋白质和酶从该无菌胎儿支持组织产品中扩散出来进入周围的组织。

在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后的硬膜外纤维化和/或瘢痕粘连。在一些实施方案中，在脊柱手术(例如，椎板切除术)之后将本文所述的无菌胎儿支持组织产品植入硬膜和覆盖组织之间。在一些实施方案中，在脊柱手术(例如，椎板切除术)之后在硬膜和覆盖组织之间植入本文所述的无菌胎儿支持组织产品减少或预防了成纤维细胞向硬膜的迁移，以及胶原蛋白在硬膜上的沉积。

在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后增生性瘢痕形成的发生。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防手术后(例如，椎板切除术后)硬膜上(epidural)/硬膜外(peridural)/神经周瘢痕的发生。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后增生性瘢痕形成的发生。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防椎板切除术后膜的出现。

在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后硬膜外压迫或硬膜栓系（duraltethering）的发生。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后栓系神经根的出现。在一些实施方案中，本文所述的无菌胎儿支持组织产品用于减少或预防脊柱手术(例如，椎板切除术)后蛛网膜炎的发生。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品进一步包含颗粒骨组织。在一些实施方案中，本文所公开的包含颗粒骨组织的无菌胎儿支持组织产品在脊柱融合过程中使用。在一些实施方案中，将本文所公开的包含颗粒骨组织的无菌胎儿支持组织产品植入相邻的椎骨之间。在一些实施方案中，将本文所公开的包含颗粒骨组织的无菌胎儿支持组织产品植入两个相邻的椎骨之间促进了椎骨融合。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作覆盖硬膜切口的防护性移植物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作硬膜的结构(构造)支承物。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于基质，并且该基质/无菌胎儿支持组织产品被用作对硬膜的置换。

无菌胎儿支持组织产品的其他用途

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品应用于贴片或创伤敷料。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作真皮填充物。在一些实施方案中，将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品注射到皮下面部组织。在一些实施方案中，将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品注射到面部皱纹或衰老线(例如，唇鼻沟褶、嘴角沟褶、"鱼尾纹"和前额皱纹)下面。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于唇部增大。在一些实施方案中，将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品注射到唇部。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于治疗关节炎(例如，骨关节炎,类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、强直性脊柱炎、椎关节强硬)。在一些实施方案中，将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品注射到关节炎关节(例如，膝盖)。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于治疗正畸或牙周状况。在一些实施方案中，该牙周状况选自牙龈炎、牙龈退缩或牙周炎。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品被用作抗炎物或用于促进骨整合或愈合。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品与牙植入物联合使用来促进植入骨整合、抗炎症和愈合。

在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于治疗声嘶或发声障碍。在一些实施方案中，本文所公开的无菌胎儿支持组织产品用于注射喉成形术来修复声带。

在一些实施方案中，将本文所公开的无菌胎儿支持组织产品涂覆于医用植入物上。在一些实施方案中，将本文所公开的医用植入物/无菌胎儿支持组织产品植入有需要的个体中，其中该无菌胎儿支持组织产品部分或全部释放到该个体体内。

实施例

实施例1

在本实施例中，确定了获得胎儿支持组织产品的无菌性所需的最佳辐射剂量。根据ISO11137-12006指南，对医疗器械的开发、确认和灭菌过程的常规控制的要求需要1)建立最大可接受剂量，和2)建立主要对生物负载设置的辐射灭菌剂量(即，描述灭菌之前的活跃病原体的初始污染)。

在本实施例中使用的AM样品是通过CryoTek^TM方法制备的

对AM组织的处理使用最低的组织操作在II级生物安全柜中无菌地进行。对制备的简单描述如下。在受控条件下对冷冻胎盘进行解冻，并从胎盘中分离羊膜(AM)。进一步从绒毛膜中分离AM。然后使AM经历一系列步骤：1)PBS1x+抗生素洗涤；2)从AM的基质侧轻轻地去除血液；3)PBS1x+抗生素洗涤(浸泡+可选的轻轻揉搓(如果血液仍然存在的话))；4)重复洗涤直至使整个组织得到清洁；5)PBS1x+抗生素洗涤，漩涡并静置–1min；6)PBS1x+抗生素洗涤，漩涡并静置–1min；7)PBS1x洗涤–静置；8)PBS1x+抗生素洗涤。然后将AM放置在无菌聚醚砜(PES)膜上，使基质侧朝下，并且根据大小将组织移植物切下。然后将组织移植物放置在充有保护介质(1:1DMEM/甘油)的贮袋中并密封。将产品保持在深度冷冻循环(-80℃)中待用。

1)最大剂量测试=30±3kGy

30kGy的最大剂量是基于先前对成品胎儿支持组织产品确定的平均总生物负载数据(每年平均生物负载=0CFU，200个批次中的3-5个<8CFU)而选定的。对于最大剂量测试，使几种胎儿支持组织产品经受30kGy的γ-辐射，以确定是否存在对产品包装或胎儿支持组织产品本身的任何显著损坏。本试验的目的是确定30kGy是否损坏包装和AM本身的生物物理方面。

产品的包装由内袋和外袋组成。内袋由48号聚酯/4.0mil聚乙烯(Technipaq INC；产品456)制成。外袋由高阻隔箔层压板(Technipaq INC；产品TL-460)制成。

为了确定包装是否被损坏(第一和第二贮袋)，在灭菌之前和之后检查包装的缝合线。拍摄照片并比较各袋的剥离强度。剥离强度分为优秀、良好或差，其中优秀是对当前AM产品剥离强度的完美比较。“良好”的剥离强度仍是可以接受的，但“差”的剥离强度是不可接受的，并要求对制袋***的进一步评估。内袋和外袋均已通过气溶胶挑战测试和物理挑战(突发)测试。所有测试的内部和外部样品在剥离强度测试中都得到优秀评级。AM的所有样品包装均未表现出生物物理损伤的任何迹象。该结果是预期的，因为内袋和外袋均已由其制造商验证为与γ-辐射相兼容。

为了确定AM的生物物理方面是否已改变，使用了AM的物理操作。简单地说，在辐射之前和之后将AM拉伸并用钳子折叠，以确定在γ-辐射过程中是否发生任何物理特性(例如脆性、变色、附着于背衬)的变化。物理操作分为优秀、良好或差，其中优秀为对当前商业AM产品的物理特性的完美比较。“好”的产品在生物物理学上仍是可以接受的，但“差”的产品是不可接受的。所有测试的AM样品在物理操作测试中得到了优秀的评级。对γ-辐照的AM进行的物理操作测试表明与未辐照的样品相比其物理形式和特性(颜色和透明度)没有明显的偏差。

2)VD_max ²⁵的证实

根据ISO11137-12006指南，产品的生物负载信息可用来证实所选定的辐射剂量，如25kGy(VD_max ²⁵)。VD_max方法的优势是其需要较少的产品样品。然而，VD_max的限制是无法降低剂量，即使生物负载极低。如果选择使用VD_max ²⁵证实方案，例如，即使生物负载为零，确认的剂量必须是25kGy。在实践中，在许多组织库中25kGy是常规使用的。

选择并证实25kGy或15kGy的灭菌剂量。VD_max ²⁵和VD_max ¹⁵方法与10^-6的无菌保证水平(SAL)相关(样本量，n=10)。SAL是指灭菌后的产品中存在活微生物(病原体)的概率。FDA将SAL为10^-6的产品认为是无菌产品。VD_max ²⁵验证方法适用于平均生物负载小于或等于1,000CFU(菌落形成单位)/单位的产品。VD_max ¹⁵验证方法适用于平均生物负载小于或等于1.5CFU(菌落形成单位)/单位的产品。VD_max ^11.9验证方法适用于平均生物负载小于或等于0.2CFU(菌落形成单位)/单位的产品。

当样本量小时通常采用VDmax验证方法。因为每个胎盘批次的生产运行仅产生～100个AM片块，所以VDmax验证方法是必要的。生物负载数据表明AM的平均生物负载数据为0cfu，其在VD_max ²⁵和VD_max ¹⁵的范围内。甚至在阳性微量样品的情况下，生物负载样品从未超过8CFU，其仍安全地落在VD_max ²⁵生物负载范围内。表2示出了从羊膜组织产品的VD_max ²⁵的证实中获得的结果。

表2：羊膜VD_max ²⁵的证实

实施例2

HC-HA/PTX3复合物(包含Petraxin3(PTX3)和共价结合至透明质酸(HA)的间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)的重链(HC))为部分负责临床观察到的AM的抗炎和抗瘢痕形成作用的AM中的活性组分。通过测试HC-HA/PTX3的稳定性和活性，可验证在灭菌之前和之后通过AM指示阐述的功能需求。在第一个实验中，评估冷冻保存的AM(50%DMEM+50%的甘油)和脐带AM(UCAM)产品中HC-HA/PTX3的浓度。

为了建立基线HC-HA/PTX3试验，采用以下使实验误差最小化的步骤来获得对胎儿支持组织产品中的HC-HA/PTX3含量的精确测定：1)将AM样品的表面积标准化(大小：2.0cm x2.0cm)；2)测量胎儿支持组织产品的重量；3)测定每个样品的蛋白质浓度；4)利用蛋白质浓度将HC-HA/PTX3数据标准化。

为了得到精确和可重现的重量测量，在称重之前将每个胎儿支持组织产品(具有尼龙膜背衬)通过将其正面朝上和正面朝下缓慢地放置在无菌棉垫(CVS,Cat#606061)上而“干燥”。2cm x2cm AM胎儿支持组织产品的平均重量为39.8±0.3mg。2cm x2cm UC胎儿支持组织产品的平均重量为840.6±0.6mg。

如果产品为无菌的，则可将保存在保存介质(50%DMEM+50%的甘油)中的AM和UCAM(P-182)储存在室温(RT)下。这将是有利的，因为在其天然环境中的AM在体温下保存并且将会消除对保持产品冷冻的需要。当前可用的胎儿支持组织产品不是最终灭菌的。因此，当前储存AM产品的方法是处于冷冻状态以抑制细菌在室温下生长的可能性的风险。为了表明冷冻保存的和灭菌的产品在功能上是相似的(例如，HC-HA/PTX3复合物在无菌样品中不降解)，比较这些样品中HC-HA/PTX3的浓度。比较40kGy的最大γ-辐射剂量和25kGy的辐射灭菌剂量以确定辐射剂量对HC-HA/PTX3浓度的影响。

鉴定潜在具有在经历γ-辐射的同时保护HC-HA/PTX3复合物的能力的几种辐射防护剂以用于测试。在电离辐射方法中使用辐射防护剂降低了由于水的辐解而由辐射直接产生的自由基的有害影响。这种保护效应还增加了病原体对辐射的抗性。因此，针对其保护能力选择辐射防护组合物与保持产品的有效灭菌是平衡的。表3总结了示例性辐射防护剂。鉴定的一些辐射防护剂还是帮助使水硬化(玻璃化)的冷冻防护剂。玻璃化防止了冷冻过程中可对细胞造成损害的冰晶的形成。表4总结了示例性冷冻防护剂及其效果。

表3：示例性辐射防护剂(RPA)

表4：示例性冷冻防护剂(CPA)

进行初步实验以确定在有或无冷冻防护剂(CPA)/辐射防护组合物(RPA)存在下γ-辐射对AM或UCAM及其活性成分的影响。对于第一个实验性试验，将辐射剂量设定为30kGy，以确定针对胎儿支持组织产品的最大剂量。从单一批次处理用于该试验的所有AM，以防止活性成分的供体变异性。在100000等级研发实验室中使用建立的AM制备方案(Cryotek方法(见上文))和UCAM制备方案制备AM。将AM组织切成均一大小(2.0cm x2.0cm)。

将三片胎儿支持组织产品(AM或UCAM)保持在50%DMEM+50%甘油中，而分配另外24片胎儿支持组织产品(AM或UCAM)用于与CPA/RPA进行处理后孵育，以确定其对AM的辐射防护作用。将CPA和RPA的浓度设定为在1X PBS中0.45M。因为这些组织在该处理阶段仍是未灭菌的，所以AM产品被保持在-80℃，而对CPA/RPA孵育的准备在4℃下进行。这使得潜在的微生物生长的风险最小化。表5列出了所测试的CPA/RPA条件。

表5：测试的CPA/RPA的列表

*表示对照AM

CPA/RPA溶液通过将所需量的CPA/RPA混合到50ml的1X PBS中来制备。使用微型涡旋器(Mini Vortexer)(VWR Scientific)以中等速度混合CPA/RPA溶液30秒。然后使用混合器在4℃下将该CPA/RPA溶液均质化2小时。将三片经处理的AM(2.0x3.0cm)浸泡在具有CPA/RPA溶液的100ml培养皿中。培养皿的边缘用石蜡膜包裹并放置于4℃下16小时过夜，同时使用maxi转子(Labline)轻轻搅拌。孵育后，将AM样品称重并用热封机单独装袋，在干净的内袋中无介质。然后将内袋密封在第二外层箔袋中。表6列出了在该试验中使用的AM样品和它们各自的重量。表7列出了在该试验中使用的UCAM样品和它们各自的重量。

表6：灭菌之前的AM样品

表7：灭菌之前的UCAM样品

制备第二组样品来测试灭菌前胎儿支持组织产品的冻干效果。如上所述在CPA/RPA溶液中制备AM和UCAM样品并称重。孵育后，将样品在-46℃、0.035mBar(26.3毫托)下冻干16小时(Labconco Freezone4.5)。冻干后，对冻干的样品称重并用热封机单独装袋，在干净的内袋中无介质。然后将内袋密封在第二外层箔袋中。表8列出了在该试验中使用的AM样品及其在冻干之前和之后各自的重量。表9列出了在该试验中使用的UCAM样品及其在冻干之前和之后各自的重量。表8：灭菌之前的AM样品

(冻干之前和之后的重量)

表9：灭菌之前的UCAM样品

(冻干之前和之后的重量)

然后将制备的袋装样品在30kGy下进行辐照。将冷冻保存的产品在干冰上保持辐照过程的持续时间。在C-cell辐射器中以30kGy对样品进行辐照。采用剂量计来计算递送的辐射剂量。向样品递送30kGy的平均剂量。

辐照后，对蛋白质浓度和HC-HA/PTX3含量进行了分析。因为不同AM样品之间的重量差异，首先在最小总体积100μl中对组织进行均质化，获得了蛋白质浓度数据。使用Bullet Blender24在4℃冰箱中以速率水平10进行均质化，持续5分钟和额外的5分钟。然后使均质化的样品在4℃和15000rcf的离心机中旋转。AM和冻干的AM样品均完全均质化，但UCAM和冻干的UCAM样品未完全均质化。目视检查发现，大部分的UCAM在使用BulletBlender进行完整均质化运行后保持完整。这是由于400-900μm的UCAM的厚度导致的，而与之相比，AM的厚度仅为100-300μm。因为样品的处理完全相同，对部分均质化的UCAM提取物的等价样品进行分离和测定。

然后将HC-HA/PTX3浓度标准化。使用40μl均质化的提取物和标准BCA蛋白质分析(Pierce(Rockford,IL)目录号23225)来测定蛋白质的浓度。通过(ELISA)在96-孔板中评估HC-HA/PTX3含量。AM均质化的提取物在1:5稀释(20μl体积)下一式两份地进行取样，并利用HC-HA/PTX3标准来运行以确定HC-HA/PTX3浓度。然后使用相同的96孔板进行HA浓度测定。用300μl1X PBS将板洗涤4次。然后向孔中加入100μl的HRP-偶联的HABP溶液。然后根据制造商的说明来确定HA的浓度。(HA定量检测试剂盒Corgenix(Westminster,CO)产品：029-001)。

ELISA按照以下程序进行：AM提取物或HC?HA用反应缓冲液(来自HA试剂盒)稀释。将稀释的样品溶液(100μl)一式两份地加至HA包被的96孔中，并在室温下孵育2小时。将溶液去除，并用PBS洗孔4次。用150μl在PBS中的2.5%脱脂奶在室温下将孔封闭1h，然后去除封闭溶液。向每个孔中加入100μl抗-IαI抗体(兔抗-IαI多克隆抗体(DAKO,A0301))并在室温下孵育60分钟。用PBS洗孔4次。然后向每个孔中加入100μl的HRP-偶联的第二抗体并在室温下孵育60分钟。然后用PBS洗孔4次，并且向每个孔中加入100μl单组分基质溶液(来自HA试剂盒)并孵育30分钟。向每个孔中加入100μl终止溶液(来自HA试剂盒)来停止酶反应。在450nm(650nm参考)下读取每个孔的O.D，并且基于HA(透明质酸钠盐，来自人脐带(Sigma,Cat#H1876)和

(51-0050-00,UD30256,Advanced Medical Optics-AMO,Santa Ana,CA)的标准样品来计算浓度。

表10、11和12分别显示了AM、冻干AM(AM lyo)和UCAMγ-辐照的样品的平均重量、平均蛋白质浓度、平均HA浓度和平均HC-HA/PTX3浓度。由于冻干的UCAM样品的量有限，未进行UCAM lyo数据的分析，因为没有可用于该类别的对照。

如期望的，与已经经历γ-辐射的样品相比，AM和冻干AM的未辐照的样品(对照)的蛋白质浓度较高(分别为353μg/ml和261μg/ml)。在HC-HA/PTX3浓度数据中也观察到了这种趋势，其中与已经经历γ-辐射的样品相比，AM、冻干AM和UCAM的未辐照的样品(对照)的结果较高(分别为336ng/ml、188ng/ml和216ng/ml)。该结果与先前得出γ-辐射损坏多种化学键和分子键的结论的研究相关。本研究证明，γ-辐射的确破坏AM的生物学性质，因为HC-HA/PTX3是有助于AM的治疗和生物功能的有效成分之一。

对于全部3个样品类别，未辐照的样品(对照)的HA平均浓度低于其γ-辐照的样品中的一些。这在AM的数据中得到了清晰的描绘，其中未辐照的样品具有179ng/ml的平均HA浓度，而与之相比，对于已在各种条件下进行辐照的所有AM样品，读数高于200ng/ml。

进行独立的单尾T检验来确定对于每种类别，保存在不同条件下的未辐照的样品(对照)与辐照的样品之间是否存在显著性差异。选择独立T-检验是因为存在相互独立的两组样品。选择单尾是因为预计未辐照的样品的值将会高于辐照的样品的数据。为统计学显著性选定的阈值为<0.05。

表10：AM的数据和每种冷冻/辐射防护剂的排名

在表10中记录的所有P-值均>0.05，表明没有一个辐照的样品与未辐照的样品在蛋白质浓度、HA浓度和HC-HA/PTX3浓度方面显著不同。然而，表10的逐个细胞分析在一些数据组中显示出偏差。一个这样的实例是0.45M甘油和0.45M甘露醇的总蛋白浓度数据，与未辐照的对照的354μg/ml相比，其分别记录为149μg/ml和95μg/ml。0.45M甘油和0.45M甘露醇的这种分别为58%和73%的蛋白质浓度降低表明这两种辐射防护剂在保护经历γ-辐射的AM蛋白质方面是最弱的。0.45M甘露醇在保护HC-HA/PTX3方面持续着这一趋势，其中与对照(未辐照的AM)的336.43ng/ml相比，HC-HA/PTX3的浓度记录为36ng/ml。但0.45M甘油对于HC-HA/PTX3浓度为216ng/ml的HC-HA/PTX3显示出显著的保护能力，并且在保护AM的活性成分方面有效性略小于0.45M丙二醇(302ng/ml的HC-HA/PTX3浓度读数)。由于HC-HA/PTX3作为AM中的活性成分之一，在该研究中基于HC-HA/PTX3浓度的数据占有更多的比重。

基于表10，在γ-辐射过程中最好地保护冷冻保存的AM的试剂按排名为：0.45M丙二醇>0.45M甘油>0.45M DMSO。0.45M甘露醇对经历γ-辐射的冷冻保存的AM提供了最少的保护。

表11：冻干的AM的数据和每种冷冻/辐射防护剂的排名

表11中针对50%DMEM/50%甘油、0.45M甘油和0.45M甘露醇的HA浓度计算的P-值(分别为0.014、0.040和0.010)表明，与未辐照的冻干AM对照相比，在保存在其各自条件下的冻干AM样品之间存在显著性差异。然而，对实际HA浓度的检查表明，50%DMEM/50%甘油的HA浓度(357ng/ml)高于冻干AM对照的HA浓度(202ng/ml)。得出的唯一的推论为，50%DMEM/50%甘油在γ-辐射过程中保护冻干AM蛋白质的效率没有降低。使用50%DMEM/50%甘油HC-HA/PTX3的数据进一步支持了该结果，其中与未辐照的冻干AM对照的188ng/ml相比，HC-HA/PTX3浓度记录为157ng/ml。浓度读数为163ng/ml的0.45MDMSO提供了最好的HC-HA/PTX3保护。

基于表11，在γ-辐射过程中最好地保护冷冻保存的AM的试剂按照排名为：0.45M DMSO>50%DMEM/50%甘油>0.45M丙二醇。0.45M甘露醇和0.45M海藻糖对经历γ-辐射的冷冻保存的AM提供了最少的保护。

表12：UCAM的数据和每种冷冻/辐射防护剂的排名

从表12，针对50%DMEM/50%甘油的蛋白质浓度(1088μg/ml)的p-值(0.013)表明，与未辐照的UCAM对照的316μg/ml的浓度相比有显著性差异。因为保存在50%DMEM/50%甘油中的γ-辐照的UCAM的蛋白质浓度高于对照(未辐照的UCAM)，所以结论为50%DMEM/50%甘油在γ-辐射过程中保护UCAM蛋白质的效率没有降低。对于γ-辐照的UCAM的HC-HA/PTX3浓度的所有p-值表明与其未辐照的UCAM对照相比有显著性差异(<0.05)。对于UCAM HA浓度，仅0.45M DMSO和0.45甘露醇的p-值(分别为0.045和0.015)表明与对照相比有显著性差异。

基于表12的结果，在γ-辐射过程中最好地保护UCAM的试剂按照排名为0.45M甘油和0.45M丙二醇。还得出了以下结论(按照排名)：0.45M DMSO、0.45M甘露醇和50%DMEM/50%甘油对经历γ-辐射的冷冻保存的UCAM提供了最少的保护。

表13提供了对经历γ-辐射的AM的强和弱防护剂的简明概述。丙二醇和甘油被鉴别为保护AM的较强试剂。相反，甘露醇提供了最少的保护。

表13：对于每种类别的最强和最弱冷冻/辐射防护剂的总结

实施例3

在先前的实施例中，丙二醇和甘油被鉴别为胎儿支持组织产品的冷冻/辐射防护组合物。在本实施例中，检查了丙二醇和甘油浓度对AM的冻干或AM蛋白质、HA和HC-HA/PTX3的可提取性的影响。AM样品如实施例2所述制备。对于CPA/RPA孵育，将样品在根据表14含有浓度递增的甘油或丙二醇的DMEM(含有+4.5g/L D-葡萄糖，含有L-谷氨酰胺，含有25mM HEPES，不含丙酮酸钠并且不含酚红(GIBCO，21063))中孵育。甘油(Gly)具有1.261g/cm³的密度，而丙二醇(PG)具有1.036g/cm³的密度。使用Maxi转子(Labline)将样品在4℃、轻微搅拌下孵育16小时。制备一组没有进行冻干的AM样品，并且制备一组进行了冻干的样品(参见实施例2)。如表2所述确定每个样品的重量、蛋白质浓度、HA浓度和HC-HA/PTX3浓度。

表14：甘油和丙二醇浓度

孵育后，目视观察制备的样品以记录大小或外观的差异。在Gly中保存而没有冻干的AM使AM样品随着Gly浓度的增加而逐渐收缩。在PG中保存而没有冻干的AM也使AM样品随着PG浓度的增加而逐渐收缩，虽然效果不太明显。保存在Gly(10%-50%)中的冻干的AM没有干透，因为样品在冻干6小时后仍为透明的。相反，对于以不同浓度保存的所有样品，保存在PG中的冻干的AM完全干透。对于该结果的一种可能的解释是Gly吸收(结合)水的能力，从而保持了AM的水化，即使使用外力(冻干)来去除水。

进行独立的单尾t检验，以确定在DMEM(0%Gly或0%PG aka对照)中的AM样品与保存在不同浓度的Gly和PG(进行或不进行冻干)下的样品之间是否存在显著性差异。选择独立的T-检验是因为存在两组相互独立的样品。选择双尾是因为无法预测哪组会较高。对于统计显著性选择的阈值为<0.05。由于冻干AM样品的量有限，没有针对0%AMPG进行测试。然而，由于对于所有0%样品(对于0%PG和0%Gly)的基本溶液是相同的(DMEM)，0%AM PG与0%AM Gly完全相同，后来的结果用于分析所得到的具有不同PG浓度(10%-50%)的冻干AM。

表15示出了保存在不同浓度的Gly或PG中(进行或不进行冻干)的AM的重量分布。基于表15，保存在Gly和PG中而没有冻干的AM的平均重量随其各自浓度的增加而增加。利用该分析和对AM的外观所作的观察，可以得出以下结论：随着浓度的增加，由于物理尺寸的缩小，AM组织的厚度增加，而平均重量继续增加。该结果对于PG是不显著的，提示PG不能像Gly一样有效地结合水。该模型假设了保持AM水化的结合水的量直接与其平均重量相关。

对于保存在Gly中并进行冻干的AM，平均重量随着浓度的增加而增加。重量的显著性差异与以下观察结果相关：即使使用外力(冻干)来试图并除去水，AM仍保持“湿的”(对于更高的浓度)。相反，保存在PG中并进行冻干的AM的平均重量没有大的波动，因为它介于12.0-13.3g之间，即便浓度逐渐增加。这一发现与以下观察结果一致：不论其PG浓度如何，AM在经历冻干后变得干燥。对这些数据与物理外观的交叉分析表明，甘油和PG如何与水结合及其随后掺入AM基质的机理彼此不同。

表15：AM和AM Lyo在不同浓度的Gly和PG中的重量

表16示出了保存在不同浓度的Gly或PG中进行冻干或不进行冻干的AM蛋白质的浓度。仅对于在50%Gly中保存而没有冻干的AM记录到蛋白质数据的显著偏差(p=0.014)，当与对照相比时产生高3x的蛋白质，表明50%甘油在将蛋白质从ECM中分离方面是独特的，并且冻干抑制了这种影响。对于保存在Gly中没有冻干和保存在Gly中进行冻干(除了在其各自的情况下，在10%Gly中没有冻干和在20%Gly中进行冻干)的AM的蛋白质浓度，观察到逐渐增加的趋势。已证明甘油能稳定球状蛋白质的天然结构。甘油诱导蛋白质压实，减少蛋白质的柔性，稳定特定的部分折叠的中间体，并影响天然和非天然蛋白质的聚集。

对于保存在PG中进行或不进行冻干的AM，蛋白质浓度随PG浓度的增加而增加，直到40%，之后在50%时降低。另外，在10%Gly中保存的冻干的AM得到可忽略的量(1.44μg/ml)的蛋白质，这一发现与以下观察结果相关：AM在冻干过程中干透，而与之相比，其他AM当冻干并保存在较高浓度的Gly中时仍为“湿的”。和Gly不同，PG的蛋白质提取效率(浓度)对于冻干或不冻干而言均整体落在相同的浓度范围内。

总之，在蛋白提取效率方面，保存在递增浓度的Gly中的AM产生递增量的蛋白质(在50%甘油中蛋白质浓度最高)。对保存在递增的Gly浓度中的冻干AM也观察到了相似的趋势，虽然总蛋白浓度范围(<100μg/ml)显著降低，提示由于冻干抑制了对提取效率的影响。保存在PG中进行和不进行冻干的AM的蛋白质提取效率处于保存在甘油中进行冻干的AM的蛋白质浓度范围(<100μg/ml)内。这不仅表明冻干抑制了蛋白质的提取效率，而且提供了以下观点：甘油可以在均质化过程中优先地从AM的基质中分离蛋白质同时防止它们聚集。

表16：AM和AM Lyo在不同浓度的Gly和PG中的蛋白质浓度

表17表明，在针对保存在Gly或PG中进行或不进行冻干的AM记录的HA浓度中没有显著性差异(所有p-值>0.05)，表明HA由于其水溶性的性质而很容易提取，并且这种性质不会受到冻干的影响。保存在Gly中而没有冻干的AM的HA浓度显示出随着Gly浓度的增加而增加的趋势，直到40%，之后降低，这表明甘油有助于分离含有HA的ECM，以便HA和蛋白质都更容易得到提取。对于其余条件未观察到趋势，但是在其各自的类别中产生最多HA的条件为：40%PG未经冻干，30%Gly进行冻干，和50%PG进行冻干。

表17：AM和AM Lyo在不同浓度的Gly和PG中的HA浓度

表18表明，在针对保存在Gly或PG中进行或不进行冻干的AM记录的HC-HA/PTX3浓度中没有显著性差异(所有p-值>0.05)。该表显示对于保存在Gly中未冻干的和保存在PG中未冻干(除了在10%Gly中未冻干)的AM，HC-HA/PTX3浓度随着每种保存基质的浓度增加而逐渐增加的趋势，直到50%。对于冻干的AM样品，HC-HA/PTX3提取的最佳Gly浓度为20%，而最佳PG浓度为50%。

表18：AM和AM Lyo在不同浓度的Gly和PG中的HC-HA/PTX3浓度

对来自实施例2和3的数据的总结呈现于表19-26中。

表19：保存在Gly和PG中经过或未经γ-辐射的冷冻保存的AM

表20：保存在Gly和PG中经过或未经γ-辐射的冻干的AM

表21：AM(Gly和PG)的提取效率

表22：AM在冻干之前和之后的提取效率(Gly)

表23：AM在冻干之前和之后的提取效率(PG)

表24：γ-辐照的冻干的AM对比γ-辐照的未冻干的AM

表25：基质总结

下表列出了当经历冻干和γ-辐射时用于AM保存的最佳介质。

表26：用于AM保存的辐射防护剂的研究结果

	冻干(-)	冻干(+)
			γ-辐射(-)	50%甘油	50%甘油
γ-辐射(+)	甘油或丙二醇	50%甘油

实施例4

在实施例2和3中，定量测得γ-辐射不导致在甘油和PG中冷冻保存的AM在蛋白质、HA和HC-HA/PTX3浓度方面的统计学显著变化。在本实施例中，对HC-HA/PTX3复合物的结构完整性进行了检查。对用HA酶消化的剩余AM提取物进行了蛋白质印迹分析，HA酶消化HA而不消化糖胺聚糖如软骨素和硫酸软骨素。该分析允许通过比较进行或不进行HA酶处理的条带的强度和锐度而对γ-辐照的样品与未经γ-辐照的样品之间的活性成分进行相对比较。表27列出了在该实验中使用的AM提取物样品(来自实施例2和3)。

表27：用于蛋白质印迹分析的AM提取物样品

分别制备每种条件的AM提取物(n=3)。对于每个单独的提取物预先确定蛋白质、HA和HC-HA/PTX3的浓度(参见实施例2和3以及表28)。对于每种条件，总共需要40μg蛋白质(20μg，分别进行或不进行HA酶消化)来进行蛋白质印迹分析。由于可用的AM提取物的量有限，所以使用了最小的蛋白质印迹分析装置(12个孔，每孔20μl，每孔20μg蛋白质)。

表28：所分析的样品的蛋白质数据

用含有磷酸盐和盐的1x PBS缓冲液来提取AM提取物。为了将在进行或不进行HA酶消化的情况下这些提取物向凝胶上的加载标准化，首先通过冻干将AM提取物浓缩。然后对含有浓盐和磷酸盐的浓缩提取物进行透析，以从提取物中去除过量的盐和磷酸盐。简单地说，用dH₂O补充AM提取物至最低500μl体积并注入至Slide A Lyser2K透析盒(Thermo Scientific,#66203)中。然后将该盒在2L滤过水中于4℃下透析4小时，其中在中点(2小时标记)滤过水发生变化。然后将透析的样品冻干4小时，并且重悬浮于蒸馏水中。

对于透明质酸酶处理，用20单位/ml的透明质酸酶(HA酶#100740,Seikagaku Biobusiness Corporation)在60℃下处理AM提取物2h(0.02M的醋酸钠-醋酸缓冲液，0.015M NaCl，pH6.0)，以特异性地消化HA而不消化其他糖胺聚糖如软骨素和硫酸软骨素。HA酶消化优于NaOH处理，后者不仅破坏酯键，还导致蛋白质水解。

然后将样品在SDS-PAGE上运行并使用抗IαI抗体通过蛋白质印迹法进行分析。向每个孔中加载的蛋白质的量和HA的相对量列于表29中。

表29：向每个孔中加载的蛋白质和HA的量

IαI的HC与HA共价连接，因为在两个HC之间形成的酯键和完整IαI分子中bikunin的硫酸软骨素链将HC连接至HA。当在聚丙烯酰胺凝胶上运行时，从细胞中纯化的IαI产生在～250kDa处的主带、在加载孔底部的HMW带以及在75和120kDa处的另外两个带。其中大小阻止复合物进入凝胶的HMW带为与HMW HA共价连接的IαI典型组分，其可被HA酶消化以在凝胶中运行。75kDa带对应于游离HC而120kDa带很可能为与bikunin或TSG-6共价偶联的HC。HA酶消化增加了250、120和75kDa带的强度和锐度，这表明这些物质中的一些可能从HA上释放。

在本实验中，蛋白质印迹分析证实了在来源于γ-辐照的和未辐照的AM的AM提取物中存在HC-HA/PTX3，这与最初的结论一致，即γ-辐射不会显著改变从样品中提取的蛋白质、HA和HC-HA/PTX3的量，表明γ-辐射不会显著损害AM中的活性成分。HA酶消化增加了75kDa带的强度和锐度。尽管蛋白质印迹数据表明来自γ-辐照的样品的HC-HA/PTX3的存在，但这些条带的强度和锐度与未辐照的样品相比较低。通过比较来自蛋白质印迹的数据与来自实施例2和3的浓度数据，观察到其中较高量的HA/孔与条带强度和锐度的增加相关的总趋势。

实施例5

在本实施例中，在γ-辐射之前和之后检查冷冻介质(DMEM、甘油、PBS和抗生素)的每种组分的黄化效应。目前的商业AM产品使用DMEM(4.5g/L D-葡萄糖，含有25mM HEPES、含有丙酮酸钠，不含L-谷氨酰胺并且不含Cellgro的酚红)作为基本介质。然而，DMEM必须保存于2-8℃下并且具有1年的保存期。因为在γ-辐射之后，新胎儿支持组织产品将可能被保持在室温(20-25℃)下，所以DMEM将用PBS1x代替，以补偿这种变化。PBS具有15-30℃的储存条件和3年的保存期。目前的冷冻介质混合物还包含抗生素0.2%的环丙沙星和0.5%的两性霉素B，并且生产商的MSDS警告对抗生素的γ辐射。在γ-辐射之后，DMEM和抗生素使介质变为黄色。表30总结了在辐射之前和之后用不同基本介质制备的不同胎儿支持组织产品的观察结果。

表30：γ-辐射之前和之后基本介质着色观察结果的总结

1x PBS1x在γ-辐射之后不变黄，但当与抗生素(0.2%的环丙沙星和0.5%的两性霉素B)组合时变黄，这表明在γ-辐射之后只有抗生素变黄。1:1PBS/甘油的组合在γ-辐射后不变为黄色，但1:1PBS/甘油+抗生素的组合变为黄色，再次确认了抗生素在γ-辐射之后变为黄色。DMEM介质本身在γ-辐射后变为黄色，并且DMEM+抗生素也变为黄色。1:1DMEM/甘油的组合也变为黄色，这是由DMEM导致的，而不是由甘油导致的，因为1:1PBS/甘油不变为黄色。

实施例6

在本实施例中，使用组织学评估来确定γ-辐射之前和之后冷冻保存的胎儿支持组织产品的结构完整性。具体地评估了辐射对上皮、基底膜和基质的影响。冷冻保存的人羊膜产品包含已通过冷冻而杀死的细胞，从而确保该组织在宿主体内不引起免疫应答。通常对新鲜组织进行的组织学通常评估活的健康细胞。相反，羊膜产品的组织学用于确定上皮、基底膜和基质结构的存在，无论是连续的还是不连续的。另外，当观察作为冷冻保存的羊膜组织的一部分而含有的细胞时，血影细胞、固缩细胞或退化细胞的存在被看作是表明这些细胞不再存活的期望的属性。

将冷冻保存的产品在干冰上保持辐射程序所持续的时间。在C-cell辐射器中对样品进行辐射，采用剂量计来计算递送的辐射剂量。向样品递送30kGy的平均剂量。

高碘酸-希夫反应(PAS)染色用于证明羊膜组织的基底膜的存在。阿辛蓝染色用于证明羊膜组织的基质层的存在。苏木精和伊红(H&E)染色用于证明羊膜组织的上皮层的存在。基于表31中所述的标准，形态学验收标准被确定为“通过”或“失败”。

表31：组织分级标准

“通过”表明上皮、基质和基底膜以及可能的固缩细胞、退化细胞、血影细胞的存在，并且是组织完整性的指征。“失败”表明组织已遭受了完整性损失，信号随着时间恶化，上皮、基质和基底膜具有显著损失。对比γ-辐照的AM测试样品与作为对照的未经γ-辐照的AM(在-80℃下冷冻1周)的形态学；在分析过程中标记对照和测试样品之间的任何统计学显著性差异。如果在三个不同的样品中记录到这样的变化，则这种情况被认为是不可接受的，除非利用足够的样本量来重复得出统计学差异。

如果使用三个或更多个样品在对照(未经γ-辐照的AM)与测试条件(γ-辐照的AM)之间未发现统计学显著性，则该评估被认为对经历γ-辐射之后的组织学完整性是有效的。使用Stuedent t-检验来确定在未经γ-辐照的(对照)与γ-辐照的羊膜(AM)在组织学质量属性方面是否存在显著结构差异。在分析数据时作出三个假设：1)数据从两个独立的样品获得；2)样品被假设为正态分布；和3)显著性水平被设定为1%(α=0.01)。

对于每种条件((γ-辐照的和未经γ-辐照的AM))，对来自3个不同批次(3个样品/批次)的9个样品(n=3)进行评估。在γ-辐射之前(对照)和之后评估的所有样品都满足“通过”的验收标准，因为所有样品读数都显示总平均值>50%存在的连续或不连续的组织学。所评估的样品均不满足“失败”的标准。组织学质量数据支持了γ-辐射不损害冷冻保存的羊膜，因为在γ-辐照的与未经γ-辐照的羊膜之间在上皮、基底膜和基质层的组织学质量属性上没有统计学显著性差异。

实施例7

在本实施例中，基于生物化学(例如，蛋白质浓度)和功能分析(例如，破骨细胞测定)，对不同浓度的冷冻防护剂和辐射防护剂在γ-辐射过程中的冷冻防护剂和辐射防护剂效率进行分析。

因为由于不完全均质化(参见实施例2)在样品制备中具有局限性，所以在本实验中使用样品制备的优化方法。AM组织首先在液氮中冷冻并使用BioPulverizer粉碎成粉末形式。然后将粉末以1X PBS1:3w/v进行稀释并用Wheaton Douncer进行均质化。随后在4M胍/HCl中提取蛋白质并对PBS进行透析以进行生化分析和功能分析。

重新评估在实施例2中分析的冷冻/辐射防护剂(除了甘露醇，因为收集的数据并未显示出保护作用)，以及在先前使用新样品制备方案被鉴定为最佳防护剂的不同浓度的丙二醇和甘油。改变Gly和PG的浓度来获得剂量曲线以确定最佳浓度。样品的制备如实施例2所述进行。冷冻/辐射防护剂组的浓度对于甘油、PG、海藻糖和DMSO被设定为10%，而优化研究改变了甘油和PG的浓度，为0%、10%、30%、50%和70%。对照被设定为在1:1DMEM/甘油中冷冻保存的AM，未经γ-辐射。基于总蛋白质、总HA和生物/功能分析对这些样品进行分析。通过BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Rockford,IL)使用提取的上清液对蛋白质浓度进行测定。使用HA检测试剂盒(Corgenix#029-001,Broomfield,CO)对HA浓度进行定量。

在环境温度下γ-辐射之后组织的颜色变化

1X PBS具有15-30℃的储存条件和3年的保存期，并且是用于在室温下储存的合适的基本介质。当前的商业AM产品使用DMEM(4.5g/LD-葡萄糖，含有25mM HEPES，含有丙酮酸钠，不含L-谷氨酰胺且不含Cellgro的酚红)作为基本介质。然而，DMEM必须储存在2-8℃下并且具有1年的保存期。因为新胎儿支持组织产品在γ-辐射之后将保存在室温(20-25℃)下，所以用1X PBS代替DMEM来补偿这种变化。在γ-辐射之后DMEM和抗生素也使介质变黄，而1x PBS则不会(实施例5)。

以前，所有的AM组织都进行γ-辐射冷冻(即，利用干冰)，这显示出由于DMEM和抗生素(环丙沙星和两性霉素B)的存在使得介质和组织变为黄色(实施例5)。在本实施例中，在室温下进行γ-辐射并且注意到在γ-辐射之后仅有AM组织变色。在海藻糖和甘油中γ-辐照的AM组织变为黄色，而丙二醇中γ-辐照的AM组织变为粉色/红色。只有PBS中的对照AM和γ-辐照的AM保持澄清。颜色的变化可能是由于海藻糖(11个羟基)、甘油(3个羟基)和丙二醇(2个羟基)中存在的羟基(-OH)。研究已表明，由于包含羟基自由基(OH)、氢原子(H)和电子(e)的水的高反应性辐射分解物质，在水溶液中进行γ-辐射显著降低了药物的敏感性。在早期研究中，作者揭示了药物对辐射的敏感性取决于羟基在脂肪链中的位置并且还随着脂肪醇中羟基数目的增加而增加。关于药物对辐射的敏感性，有机溶剂的顺序为：1,3丙二醇>甘油>丙二醇>正丙醇。药物对辐射的敏感性可以使用在不同类型的表面活性剂如十二烷基硫酸钠、吐温-80和苯扎氯铵中发现的自由基清除剂来抵消。在暴露于微波辐射的HA(AM中大量存在)中也观察到棕色的颜色变化，从而导致抗氧化活性的增加。

生化分析

与未经γ-辐照的对照相比，在所有γ-辐照的样品中，每单位重量提取的总蛋白质较低(图1)。这表明在环境温度下的γ-辐射影响组织中存在的蛋白质。用于解释该结果的一种机制是，环境温度下γ-辐射的交联效应的增加导致组织被固定，因此提取到较少量的蛋白质。尽管如此，对不同辐射/冷冻防护剂观察到了总趋势。首先，提取的蛋白质随着Gly浓度的增加而线性增加。对于PG，蛋白质提取在30%PG处达到峰值并且随着浓度增加至50%和70%而降低。从γ-辐照的AM组织中提取的蛋白质的效率排名如下：30%PG>PBS>70%Gly=10%PG=10%海藻糖。

与未经γ-辐照的对照相比，在所有γ-辐照的样品中，每单位重量提取的总HA也较低(图2)。这表明在环境温度下的γ-辐射影响组织中存在的HA。用于解释该结果的一种机制是包含羟基自由基(OH)、氢原子(H)和电子(e)的水的高反应性辐射分解物质，其损害组织中存在的HA。尽管如此，对不同辐射/冷冻防护剂观察到了总趋势。尤其是，随着Gly浓度的增加，HA的存在呈线性趋势。对于PG，观察到了相反的趋势，因为AM组织中存在的HA随着PG浓度的增加而降低。γ-辐照的AM组织中存在的HA的量为以下顺序：10%PG>30%PG>50%PG>50%Gly。

通过分析HA:蛋白质的比值而观察到了与图2中相同的趋势(图3)。HA:蛋白质的比值存在随着Gly浓度的增加而逐渐增加的线性趋势。另外，观察到HA:蛋白质比值随着PG浓度增加的相反的趋势。与总HA浓度相反，未经γ-辐照的CTL样品的HA:蛋白质比值低于10%PG、70%Gly、30%PG和50%PG的HA:蛋白质比值。

这些结果再次确认了高浓度的Gly(70%)和低浓度的PG(10%)对于AM组织抵抗γ-辐射具有最好的防护效应。

使蛋白质印迹样品在4-15%(w/v)梯度的丙烯酰胺预备凝胶上在变性和还原条件下进行电泳。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。然后用TBST(50mM Tris-HCl,pH7.5、150mM NaCl、0.05%(v/v)的吐温20)中的5%(w/v)的脱脂乳将该膜封闭，然后与特异性抗IαI第一抗体和其第二抗体进行连续孵育。利用Western Lighting^TM化学发光试剂检测免疫反应性蛋白质。

通过琼脂糖凝胶分析AM提取物中HA的大小。简单地说，在0.5%(w/v)琼脂糖凝胶上分离经过或未经HA酶处理的组织提取物，然后用0.005%(w/v)染色剂进行染色，所有染料都在50%(v/v)乙醇中。将凝胶在25℃、光保护下染色过夜，并在水中脱色并暴露于室内光线6h后，HA显示为淡蓝色的带。通过比较Select-HA HiLadder和HMW HA(Healon)来评估HA的大小。

将来自实施例2(冷冻γ-辐射)的生物化学数据与室温γ-辐射进行比较以确定在γ-辐射过程中进行冷冻的防护效应。对于每单位重量的AM提取物的蛋白质浓度，当在室温下对AM产品进行γ-辐照时，蛋白质的提取效率显著降低。对于每单位重量的AM提取物的总蛋白质，当在室温下对AM产品进行γ-辐照时，每单位重量提取的蛋白质的量显著减少。唯一的例外是未经γ-辐照的对照，这可被解释为是由于与对冷冻的AM产品使用PBS相比，使用了高盐溶液(4M GnHCl)来提取室温AM产品。对于每单位重量提取的HA的浓度，当在室温下对AM产品进行γ-辐照时，HA的提取效率显著降低。对于每单位重量的AM提取物的HA的量，当在室温下对AM产品进行γ-辐照时，每单位重量提取的HA的量显著减少。唯一的例外是未经γ-辐照的对照，这可被解释为是由于与对冷冻的AM产品使用PBS相比，使用了高盐溶液(4M GnHCl)来提取室温AM产品。

该数据表明，与冷冻γ-辐射相比，室温γ-辐射损伤AM产品中存在的更多成分。γ-辐射呈现出与自由基的产生相关的降解的挑战，尤其是当HA处于其水化状态时，HA链由HMW断裂为LMW。从HMW HA到LMW HA的降解通常在水溶液中进行，并且冻干较好地保护了HA的基本结构。简言之，需要对AM组织进行γ-辐照冷冻以防止水的水解，该水解释放出损害AM组织的活性生物化学成分的羟基自由基(OH)、氢原子(H)和电子(e)。

功能分析–破骨细胞测定

向用50ng/ml的RANKL处理的鼠RAW264.7巨噬细胞提供1体积分数的AM样品，以确定其抑制破骨细胞形成的效能。1体积分数被定义为已针对其原始组织重量进行标准化的AM组织提取物的体积的八分之一。

将RAW264.7巨噬细胞以4.0x10⁴个细胞/ml的密度培养在96-孔板中的0.15ml体积的补充有10%FBS、100μg/ml青霉素和链霉素的α-MEM培养基中。在加入AM样品后，在存在或不存在RANKL刺激的情况下孵育细胞。根据以下所列的条件以时间依赖性方式加入50ng/ml RANKL刺激：六个一组(n=6)进行每种条件。

表32：用于破骨细胞分析的实验样品

实验样品	样品添加	RANKL添加
			1.-ve CTL(PBS1X)	24h	n/a
2.+ve CTL(PBS1X)	24h	24h
			3.HC-HA/PTX3(5ug/ml HA)	24h	24h
4.AMP(200ug/ml蛋白质)	24h	24h
			5.#1–AG/100(CTL，未经γ-辐照的)	24h	24h
6.#2–PBS(γ-辐照的)	24h	24h
			7.#310%海藻糖(γ-辐照的)	24h	24h
8.#5–10%甘油(γ-辐照的)	24h	24h
			9.#6–30%甘油(γ-辐照的)	24h	24h
10.#7–50%甘油(γ-辐照的)	24h	24h
			11.#8–70%甘油(γ-辐照的)	24h	24h
12.#9–10%丙二醇(γ-辐照的)	24h	24h
			13.#10–30%丙二醇(γ-辐照的)	24h	24h
14.#11–50%丙二醇(γ-辐照的)	24h	24h
			15.#12–70%丙二醇(γ-辐照的)	24h	24h

在相差显微镜下将巨噬细胞可视化，连续进行5天。在第5天结束培养，并且在裂解以备TRAP比色染色之前用150μl的1x DPBS洗涤来自每个孔的细胞。在破骨细胞中表达酒石酸盐抗性酸性磷酸酶(TRAP)。通过移液用50μl(每个96孔板)1X PBS和1%Triton来裂解细胞，然后将其转移至1.5ml微量离心管(在该阶段保持在-80℃下)中。解冻后，将样品在10000rpm下离心10分钟。对于TRAP比色分析，在加入100μlTRAP(酸性磷酸酶白细胞试剂盒，Sigma)之前，将15μl上清液转移至96孔(n=2)板中。由裂解缓冲液(PBS中的1%Triton)组成的样品用作背景对照。以稳态方式加入TRAP介质并一式两份对每个样品进行检测。样品在37℃下孵育30-60分钟(每隔15分钟进行目测检查)。在570nm下读取该板以获得TRAP吸光度读数。

无RANKL诱导的巨噬细胞在第5天未显示出破骨细胞(大的多核细胞)的形成，而用RANKL处理的细胞从第3天开始显示出除破骨细胞的形成(图4)。用HC-HA/PTX3、AMP和所有实验AM提取物处理的细胞没有显示出显著的破骨细胞形成。

TRAP比色分析表明，用RANKL诱导的巨噬细胞表达最高浓度的TRAP(图5)。未经RANKL处理的细胞具有显著较低的TRAP活性(p=0.0006)。包含HC-HA/PTX3和AM粉末(AMP)的实验对照也显示出TRAP活性的显著降低(p=0.001和p=0.003)。在γ-辐照的样品中，只有保存在PBS、10%Gly、30%Gly和10%PG中的AM显示出对破骨细胞形成的显著抑制(p<0.05)。

AM组织需要进行γ-辐照冷冻以防止水的水解，该水解释放出损害AM组织的活性生物化学成分的羟基自由基(OH)、氢原子(H)和电子(e)。基于蛋白质和HA数据，高浓度的甘油(50%和70%)和低浓度的丙二醇(10%和30%)提供了对γ-辐射的最佳防护。基于功能分析，在PBS、10%Gly、30%Gly和10%PG中的γ-辐照的样品显著抑制了破骨细胞的形成。

实施例8

在本实施例中，通过组织学分析评估了室温储存对γ-辐射后冷冻保存的AM的影响。根据ASTM F1980标准(医疗器械无菌屏蔽***加速老化标准指南)使样品经历加速老化，其中样品产品在55℃下46天相当于在室温下1年。使用组织学样品，通过分别将其在55℃下老化46天和92天，来确定胎儿支持组织产品在室温下于1年和2年时间点的保存期。对于生物化学和功能分析(实施例9)，将AM组织在55℃下保持11.5天(使用杂交箱进行)，以进行3个月的室温储存读取。

本研究使用的AM分为三组：

1)未经γ-辐照的AM–对产品进行无菌处理。作为对照。

2)老化1.0年或2.0年的未经γ-辐照的AM–对产品进行无菌处理。

3)老化1.0年或2.0年的γ-辐照的AM–产品是无菌的。

如实施例6所述进行组织学评估，用于确定胎儿支持组织产品中上皮、基底膜和基质结构的存在，无论是连续的还是不连续的。

利用方差分析(ANOVA)，将老化1.0年或2.0年的γ-辐照的AM测试样品与老化1.0年或2.0年的未经γ-辐照的AM测试样品的形态学进行比较，并且也与作为对照的未经γ-辐照的AM(在-80℃下冷冻1周)的形态学进行比较；在分析过程中标记对照与测试样品之间的任何统计学显著性差异。如果在三个不同的样品中记录到这样的变化，则认为该条件是不可接受的，除非利用足够的样本量进行重复以得出统计学差异。

如果在对照(未经γ-辐照的AM)、老化1.0年或2.0年的γ-辐照的AM测试样品与老化1.0年或2.0年的未经γ-辐照的AM测试样品之间没有统计学显著性，则该评估被认为对经历γ-辐射之后的组织学完整性是有效的。

方差分析(ANOVA)方法通常用于检验零假设，即两个以上群体的平均值(μ)是相等的。在本实验中，存在三个群体：1)+ve对照，2)1.0年或2.0年的γ-辐照的AA，和3)1.0年或2.0年的未经γ-辐照的AA。ANOVA用于确定在未经γ-辐照的(对照)、老化1.0年或2.0年的γ-辐照的羊膜(AM)与老化1.0年或2.0年的未经γ-辐照的羊膜(AM)之间在组织学质量属性方面是否存在显著结构差异。当对数据进行分析时，作出三种假设：1)样品所取自的群体为(近似)正态分布；2)样品所取自的群体具有相同的方差(或标准差)；3)取自不同群体的样品是随机并独立的。显著性水平被设定为1%(α=0.01)。

室温老化1.0年

评估的所有样品满足“通过”的验收标准，因为所有样品读数都显示出总平均值≥50%存在的连续或不连续的组织学。评估的样品没有一个满足“失败”标准。通过方差分析(ANOVA)方法，实现了以下关于组织学质量属性的验证，即在-80℃下储存1周的(+)对照羊膜与在室温下保持1.0年的γ-辐照的羊膜之间没有显著性差异。此外，也实现了以下关于组织学质量属性的验证，即在-80℃下储存1周的(+)对照羊膜与在室温下保持1.0年的未经γ-辐照的羊膜之间没有显著性差异。还实现了以下关于组织学质量属性的验证，即在保持在室温下1.0年的γ-辐照的羊膜与保持在室温下1.0年的未经γ-辐照的羊膜之间没有显著性差异。

室温老化2.0年

评估的所有样品满足“通过”的验收标准，因为所有样品读数都显示出总平均值≥50%存在的连续或不连续的组织学。评估的样品没有一个满足“失败”标准。因此，实现了以下关于组织学质量属性的验证，即在-80℃下储存1周的(+)对照羊膜与在室温下保持2.0年的γ-辐照的羊膜之间没有显著性差异。还实现了以下关于组织学质量属性的验证，即在-80℃下储存1周的(+)对照羊膜与保持在室温下2.0年的未经γ-辐照的羊膜之间没有显著性差异。还实现了以下关于组织学质量属性的验证，即在保持在室温下2.0年的γ-辐照的羊膜与保持在室温下2.0年的未经γ-辐照的羊膜之间没有显著性差异。表33总结了获得的组织学分析数据。

表33：组织学分析的总结

实施例9

在本实施例中，通过生物化学和功能分析对用于γ-辐射之后的室温储存的多种冷冻防护剂和辐射防护剂的有效性进行评估。

对于甘油、PG、海藻糖和DMSO，冷冻/辐射防护剂组的浓度设定为10%，并且Gly和PG的浓度改变为0%、10%、30%、50%和70%。对照为在1:1DMEM/甘油中冷冻保存的AM，未经γ-辐照。AM样品如实施例7所述制备。根据实施例7中所述的样品制备步骤将经过和未经γ-辐照的AM组织转化为AM提取物。通过BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Rockford,IL)使用用4M胍/HCl提取的上清液测定蛋白质的浓度并对PBS进行透析。使用HA检测试剂盒(Corgenix#029-001,Broomfield,CO)来量化HA的浓度。如实施例8所述使用杂交箱进行AM组织的老化。

生化分析

与冷冻保存的(冷冻的)样品相比，从不同冷冻介质中的AM(除PBS和10%甘油样品外)提取的总蛋白质在储存在室温下3个月后减少(图6)。与它们的冷冻保存的样品不同，对于不同浓度的甘油和丙二醇未观察到明显趋势。在3个月老化之后的γ-辐照的AM组织中提取的蛋白质的量为以下顺序：PBS>50%PG>70%PG=30%PG=10%海藻糖=10%甘油=70%甘油。

γ-辐照的Gly样品的总趋势也显示出，在3个月的室温储存后与冷冻保存的对照相比有相同的HA提取水平(图7)。唯一的例外是PG样品和CTL(AG/100)样品，其在3个月的室温储存后与冷冻保存的样品相比显示出降低的HA水平。在3个月的室温储存后在γ-辐照的AM组织中存在的HA的量为以下顺序：30%甘油>50%甘油=70%甘油>30%PG=50%PG。

HA:蛋白质比值表明，30%Gly提取物在3个月室温储存后具有最高的HA量，然后为50%Gly和70%Gly(图8)。HA:蛋白质比值还表明，在3个月室温储存后所有PG样品中的HA水平都显著降低。

功能分析–破骨细胞测定

如实施例7所述向用50ng/ml的RANKL处理的鼠RAW264.7巨噬细胞提供1体积分数的AM样品，以确定其抑制破骨细胞形成的效能。通过TRAP比色分析来评估对破骨细胞形成的抑制。TRAP比色分析表明，用RANKL诱导的巨噬细胞表达了最高浓度的TRAP(图9)。未经RANKL处理的细胞具有显著较低的TRAP活性(p=0.001)。包含HC-HA/PTX3和AM粉末(AMP)的实验对照也显示出TRAP活性的显著降低(分别为p=0.049和p=0.002)。在γ-辐照的样品中，保存在PBS、10%海藻糖、30%Gly、50%Gly、10%PG、30%PG和50%PG中的未经γ-辐照的AM(AG/100)和γ-辐照的AM显示出对破骨细胞形成的显著抑制(p<0.05)。这表明在3个月室温储存后AM的功能成分仍保存在γ-辐照的AM中。

总之，基于蛋白质数据，γ-辐照的AM样品最好保存在PBS、50%PG、70%PG、10%Gly和70%Gly中进行室温储存。基于HA数据，γ-辐照的AM样品最好保存在30%甘油、50%甘油、70%甘油、30%PG和50%PG进行室温储存。基于HA:蛋白质的比值，γ-辐照的AM样品最好保存在30%甘油、50%甘油和70%甘油中进行室温储存。基于功能分析，在50%Gly、PBS、10%海藻糖、30%Gly、10%PG和30%PG中的γ-辐照的样品显著抑制破骨细胞的形成。

表34总结了得到的生化分析和功能分析的数据。总结的数据表明，基于总蛋白质、HA和从组织中提取的其他活性成分，高浓度的甘油(30%-70%)和低浓度的丙二醇(10%-30%)最佳地保护了AM免受辐射损害。

表34：γ-辐射和室温储存后的生化分析和功能分析的总结

虽然本文已经示出和描述了优选实施方案，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，此类实施方案仅作为示例提供。现可进行许多变化、改变和替代。应当理解，在实施所述方法时，可以采用本文所述的实施方案的各种替代方案。旨在用下列权利要求限定这些实施方案的范围，并涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等价物。

Claims (100)

1.一种无菌胎儿支持组织产品，其中该胎儿支持组织产品的生物活性得到保持。

2.如权利要求1所述的无菌胎儿支持组织产品，其中通过暴露于γ-辐射一段足以将所述胎儿支持组织产品灭菌的时间来对所述胎儿支持组织产品进行灭菌。

3.如权利要求1所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述无菌胎儿支持组织产品的无菌保证水平(SAL)为10^-6。

4.如权利要求1所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。

5.如权利要求1所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年。

6.如权利要求1所述的无菌胎儿支持组织产品，其进一步包含辐射防护组合物。

7.如权利要求6所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述辐射防护组合物包含甘油或丙二醇或其组合。

8.一种通过包括以下步骤的方法生产的无菌胎儿支持组织产品：使辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于能有效地将所述胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射，其中所述胎儿支持组织产品用包含甘油或丙二醇或其组合的辐射防护组合物进行辐射防护，并且其中所述胎儿支持组织产品的生物活性得到保持。

9.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射一段足以将所述胎儿支持组织产品灭菌的时间。

10.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射约1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时。

11.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品在暴露于γ-辐射之前进行冷冻。

12.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下进行冷冻。

13.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃的温度下暴露于γ-辐射。

14.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

15.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述无菌胎儿支持组织产品的无菌保证水平(SAL)为10^-6。

16.如权利要求8所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。

17.如权利要求8-16中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年。

18.一种对胎儿支持组织产品进行灭菌的方法，其包括：将辐射防护的胎儿支持组织产品暴露于能有效地生产无菌胎儿支持组织产品的剂量的γ-辐射，其中所述胎儿支持组织产品用包含甘油或丙二醇或其组合的辐射防护组合物进行辐射防护。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射一段足以将所述胎儿支持组织产品灭菌的时间。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品暴露于γ-辐射约1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时。

21.如权利要求18中的任一项所述的方法，其进一步包括使所述胎儿支持组织产品与所述辐射防护组合物接触一段预定的时间的步骤。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。

23.如权利要求18所述的方法，其进一步包括在暴露于γ-辐射之前将所述辐射防护的胎儿支持组织产品进行冷冻。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷冻。

25.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在约0℃、-5℃、-10℃、-20℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下暴露于γ-辐射。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

27.如权利要求18所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品的无菌保证水平(SAL)为10^-6。

28.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品的生物活性得到保持。

29.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品的结构完整性得到保持。

30.如权利要求18所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年。

31.如权利要求18所述的方法，其中所述辐射防护组合物是冷冻防护组合物。

32.如权利要求18所述的方法，其中所述辐射防护组合物是溶液。

33.如权利要求18所述的方法，其中所述辐射防护组合物包含约30%至约70%的甘油。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述辐射防护组合物包含约50%的甘油。

35.如权利要求18所述的方法，其中所述辐射防护组合物包含约1%至约30%的丙二醇。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述辐射防护组合物包含约10%的丙二醇。

37.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品与辐射防护组合物接触一段足以保护所述胎儿支持组织产品免受γ-辐射灭菌的时间。

38.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在4°C下与辐射防护组合物接触。

39.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品与作为储存介质的辐射防护组合物接触。

40.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在被分配到容器中之后暴露于γ-辐射。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在被分配到适合于保持所述胎儿支持组织产品的无菌性的容器中之后暴露于γ-辐射。

42.如权利要求18-41中的任一项所述的方法，其中所述γ-辐射的剂量范围介于10kGy和60kGy之间。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述γ-辐射的剂量范围介于17kGy和30kGy之间。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述γ-辐射的剂量范围介于17kGy和20kGy之间。

45.如权利要求42所述的方法，其中所述γ-辐射的剂量范围介于20kGy和24kGy之间。

46.如权利要求42所述的方法，其中所述γ-辐射的剂量范围介于25kGy和30kGy之间。

47.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品通过暴露于所述辐射防护组合物而进行辐射防护。

48.如权利要求18所述的方法，其中所述辐射防护组合物进一步包含海藻糖、DMSO或其组合。

49.如权利要求18所述的方法，其进一步包括在暴露于γ-辐射之前对所述辐射防护的胎儿支持组织产品进行冻干。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述辐射防护的胎儿支持组织产品的约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的含水量通过冻干去除。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述辐射防护的胎儿支持组织产品在低于约0℃的温度下进行冻干。

52.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品在暴露于γ-辐射之前不进行冻干。

53.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品来源于胎盘羊膜、脐带羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、胎盘、脐带或其任意组合。

54.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品是组织移植物。

55.如权利要求18所述的方法，其中所述胎儿支持组织产品是胎儿支持组织产品粉末。

56.如权利要求18所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品在室温下储存。

57.如权利要求18所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品在室温下运输。

58.如权利要求18所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品通过一种方法制得，该方法包括：

a)首先，获得包含羊膜、绒毛膜、羊膜-绒毛膜、脐带、胎盘或其任意组合的胎盘组织；和

b)其次，洗涤该胎盘组织以从该胎盘组织中去除血液。

59.如权利要求58所述的方法，其进一步包括从胎盘组织中分离羊膜。

60.如权利要求58所述的方法，其进一步包括从胎盘组织中分离脐带。

61.如权利要求58所述的方法，其进一步包括从胎盘组织中分离绒毛膜。

62.如权利要求58所述的方法，其进一步包括从胎盘组织中分离羊膜-绒毛膜。

63.如权利要求58所述的方法，其进一步包括使所述胎儿支承组织与基质接触。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述基质选自膜、绷带或伤口敷料。

65.如权利要求63所述的方法，其进一步包括使所述胎儿支持组织产品与聚醚砜(PES)膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜接触。

66.一种通过如权利要求18-65中的任一项所述的方法制得的无菌胎儿支持组织产品。

67.如权利要求1、8或66所述的无菌胎儿支持组织产品，其中所述无菌胎儿支持组织产品抑制或减少炎症，抑制或减少瘢痕形成，抑制或减少血管生成，抑制或减少粘连，或促进创伤愈合。

68.一种在有需要的个体中治疗创伤的方法，其包括将如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品施用于所述创伤一段足以治疗所述创伤的时间。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述创伤是烧伤或溃疡。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述溃疡是足溃疡、糖尿病性溃疡或静脉性溃疡。

71.如权利要求68所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品是创伤覆盖物。

72.一种在有需要的个体中治疗脊柱状况的方法，其包括将如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品施用于所述个体一段足以治疗所述脊柱状况的时间。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述脊柱状况选自椎间盘脱出、脊柱粘连、椎间盘炎、退行性/疼痛性椎间盘、刺激性/炎性神经/坐骨神经通路、面/骶髂疼痛、椎骨骨折、骨缺损上暴露的神经结构、笼或侧沟添加剂及其组合。

74.一种在有需要的个体中治疗关节炎状况的方法，其包括将如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品施用于所述个体一段足以治疗所述关节炎状况的时间。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述关节炎状况选自骨关节炎、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、强直性脊柱炎和椎关节强硬。

76.一种在有需要的个体中再生或修复神经、骨骼、肌腱、组织或软骨的方法，其包括将如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品施用于所述个体一段足以再生或修复神经、骨骼、肌腱、组织或软骨的时间。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述个体患有选自以下的病症：骨软骨缺陷、关节炎、扳机指、腕管综合征、腕肌腱炎、网球肘、高尔夫球肘、撞击综合征、肩滑囊炎、弹响髋综合征、髋滑囊炎、应力性骨折、外胫炎、软骨软化、跟腱炎、跗管综合征、胫后肌腱炎及其组合。

78.一种补充组织的方法，其包括将如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品注射到需要补充的组织中。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述无菌胎儿支持组织产品是真皮填充物。

80.一种在有需要的个体中治疗眼部病症方法,其包括将如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品施用于所述个体一段足以治疗所述眼部病症的时间。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述眼部病症是眼创伤或干眼。

82.如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品作为创伤覆盖物、粘连屏障或真皮填充物的用途。

83.如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品作为肌腱包裹物或神经包裹物的用途。

84.如权利要求1、8或66中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品用于抑制或逆转瘢痕形成、炎症、粘连或不期望的血管生成的用途。

85.一种无菌胎儿支持组织产品，其通过γ-辐射进行灭菌，并且与未辐照的胎儿支持组织产品相比具有完整的胎儿支承组织的至少49%的上皮、基质和基底膜层。

86.一种无菌胎儿支持组织产品，其通过γ-辐射进行灭菌，并且与未辐照的胎儿支持组织产品相比具有至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的活性。

87.一种无菌胎儿支持组织产品，其通过γ-辐射进行灭菌，并且在室温下稳定1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年。

88.如权利要求85-87中的任一项所述的无菌胎儿支持组织产品，其进一步包含辐射防护组合物。

89.如权利要求88所述的方法，其中所述辐射防护组合物包含甘油或丙二醇。

90.一种对胎儿支持组织产品进行灭菌的改进的方法，其包括使胎儿支持组织产品暴露于足以将所述胎儿支持组织产品灭菌的剂量的γ-辐射，所述改进包括：用包含甘油或丙二醇或其组合的辐射防护组合物对所述胎儿支持组织产品进行辐射防护。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述改进进一步包括在暴露于γ-辐射之前冷冻所述辐射防护的胎儿支持组织产品。

92.如权利要求90或91所述的方法，其中所述改进进一步包括在约0℃或低于约0℃对所述胎儿支持组织产品进行辐射。

93.如权利要求92所述的方法，其中胎儿支持组织产品在干冰上暴露于γ-辐射。

94.一种包含甘油或丙二醇或其组合的辐射防护组合物。

95.如权利要求94所述的辐射防护组合物，其中所述辐射防护组合物是溶液。

96.如权利要求94所述的辐射防护组合物，其中所述辐射防护组合物包含约30%至约70%的甘油。

97.如权利要求96所述的辐射防护组合物，其中所述辐射防护组合物包含约50%的甘油。

98.如权利要求94所述的辐射防护组合物，其中所述辐射防护组合物包含约1%至约30%的丙二醇。

99.如权利要求98所述的辐射防护组合物，其中所述辐射防护组合物包含约10%的丙二醇。

100.如权利要求94所述的辐射防护组合物，其中所述辐射防护组合物进一步包含海藻糖、DMSO或其组合。

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