CN103874503A - 抗p-选择素抗体及其使用和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

公开了特异结合P-选择素、阻断PSGL-1与P-选择素结合并使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的抗体。本发明鉴定了此前未认知的上述抗体(例如，可以是嵌合抗体、人或人源化抗体)所结合的P选择素的靠近N末端的抗体结合结构域(构象表位)。公开了结合P-选择素构象表位并具有阻断PSGL-1与P-选择素结合和使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的双功能抗体。所述双功能抗P-选择素抗体和其结合片段可以用于治疗各种急性和慢性炎症、血栓性疾病和状况。本发明还公开了用于鉴定和表征所述抗体的筛选方法。

Description

抗P-选择素抗体及其使用和鉴定方法

发明领域

本发明涉及结合P-选择素特异构象表位的抗体和抗体片段，及其使用和鉴定方法。

发明背景

在正常止血和免疫监督中，白细胞在血液中自由循环，并通过细胞粘附分子介导的连续粘附信号传导过程对损伤和感染作出反应(1-3)。在炎症和血栓性疾病中，该过程失调，能维持白细胞攻击自身组织的病状，并能够引起严重的、有时是致命的并发症。众所周知，白细胞粘附在许多炎症和血栓性疾病的病理中发挥主要作用，所述疾病例如镰状细胞病血管闭塞、再灌注损伤、血栓形成、动脉粥样硬化、哮喘、类风湿性关节炎、银屑病和肿瘤转移(4-15)、深部静脉血栓形成(DVT)。P-选择素还参与其它疾病过程，例如炎症相关的组织和器官损伤，如缺血再灌注损伤。因此，P-选择素是用于干预人类炎症和血栓性疾病的靶标。

选择素属于粘附蛋白家族，已知其在将白细胞募集到活化的内皮细胞和血小板中发挥关键作用。P-选择素是粘附糖蛋白的选择素家族的成员，所述家族还包括L-和E-选择素(16)。选择素介导白细胞至炎症部位的募集、起始粘连和滚动、以及粘附(1)。P-选择素贮存于内皮细胞的Weibel-Palade小体和血小板的α颗粒，在血管活性物质例如组胺和凝血酶的刺激下迅速转移到质膜(17)。

镰状细胞病

镰状细胞病(SCD)是一种罕见的遗传性血液疾病，其引起慢性贫血和血管闭塞，在美国主要感染非裔美国人。镰状细胞病是非裔美国人最常见的单基因病，375-600个有非洲血统的人中大约有1人感染(18，19)。镰状细胞状况在地中海国家、非洲、加勒比和部分南美和中美洲的人群中也很常见(18，19)。

SCD是由β珠蛋白基因的单个错义突变(Val6Ala)所引起的常染色体隐性遗传病，所述错义突变使突变的血红蛋白难溶并且在脱氧条件下易于发生聚合。血红蛋白的聚合作用使红细胞发生形变产生镰刀样的细胞(20)。

SCD有三个常见变体：纯合性镰状细胞病(血红蛋白SS病)、双重杂合子镰状血红蛋白C病(血红蛋白SC病)和镰状β地中海贫血。该病最常见和严重的形式发生在遗传有两个拷贝的HbS变体(HbSS)的个体中，在他们的红细胞中主要的血红蛋白是镰状血红蛋白。其它个体可以感染为复合杂合子，其疾病严重性各不相同。他们具有一个拷贝的HbS变体，其与一个拷贝的另一β珠蛋白基因变体配对。HBSC引起的该疾病不严重。Hbβ地中海贫血变体(导致不能产生正常的βA珠蛋白链(β°))或其产物(β⁺)的减少带来一系列的临床严重性。根据每个变体对患者总血红蛋白的贡献，HbSβ°是严重形式，而HbSβ⁺可以是中度或轻度的。如果与S基因结合会产生其它更罕见的变体，另一个异常的血红蛋白遗传自其它亲本，例如D、G或O。镰状细胞在个体中主要以一个拷贝的HbS和一个拷贝的正常β珠蛋白基因(HbA)的形式存在。这些个体均携带镰状细胞遗传性状(18)。

SCD在美国感染了约50,000-100,000人(21-24)。所有个体(HbS纯合子或复合杂合子)均显示SCD的某些临床表现。症状通常在出生后的前6个月出现，但是SCD严重性差别很大(25)。HbSS个体感染最严重，接着是HBbSβ°地中海贫血个体(22，26)。除了基因型外，还有其它因素影响疾病的严重性，例如胎儿血红蛋白的水平、β珠蛋白基因簇的单体型、含有编码血红蛋白β部分的5个基因的区域。尽管能够确定遗传危险因素，但是自出生时预测疾病进程的能力还是有限的(27)。

在美国，所有50个州和哥伦比亚特区都要求在出生时进行镰状细胞筛查，并且提供了早期干预的机会。诊断测试方法通常包括全血细胞计数，并结合血红蛋白电泳、等电聚焦、高效液相色谱和DNA检测中的一种或多种(22)。

慢性贫血和溶血

HbS的不稳定性和循环中反复出现血红蛋白聚合/解聚的作用导致镰状红细胞与正常红细胞相比具有更短的半衰期。这影响细胞膜离子通透性、细胞粘度和可变形性(20)，并且促进膜的氧化损伤(29)。镰状细胞病患者出生后2-3个月出现贫血，并出现慢性贫血和溶血相关的症状和并发症(22，30)，例如肾脏病、眼科疾病、小腿溃疡、***异常***和肺动脉高压(26，31-37)。SCD患者的血红蛋白数值范围在6-10g/dL，血红蛋白S分子氧亲和力较低。血红蛋白值为5或更低或者血红蛋白急剧下降2g/dL或更多时需要对患者进行输血。由于过高的红细胞比容会加速镰变，因此通常通过输血使血红蛋白值恢复到针对每名患者建立的基线水平(38)。SCD患者更容易受到细小病毒属B19感染的影响，所述感染能够阻止红细胞形成，并导致再生障碍性贫血危象(39)。

血管闭塞性疼痛危象

血管闭塞是SCD的临床过程的核心，可能涉及微循环和体循环。在微血管***中发生的闭塞可导致急性疼痛发作或血管闭塞性疼痛危象。血管闭塞性疼痛危象是微血管闭塞的临床标志，其约占成年SCD患者入院总数的90％以上。众所周知，血红蛋白S在脱氧以及细胞镰变期间发生的聚合作用导致微血管***的阻断(40)。然而，最近才清楚，血红蛋白S的聚合作用不是血管闭塞的唯一原因。目前已经证实，镰状红细胞溶解、细胞膜损伤和氧化性应激、反复缺血性损伤与微血管***损伤这些事件，其由于镰状红细胞和内皮细胞之间的粘附相互作用导致促炎环境(41-43)。人们认为，在该慢性血管炎症环境中，白细胞、血小板和镰状红细胞与活化的血管内皮之间的粘附及其相互之间的粘附是微血管***阻断和血管闭塞性疼痛危象的首要原因(43-47)。其它的因素例如镰状细胞僵化、血液粘度增加和局部血管收缩也被认为有可能促进血管闭塞过程。

长期反复的血管闭塞和大血管中发生的闭塞会引起导致器官损伤和衰竭、中风和死亡的威胁生命的并发症(40)。镰状细胞病患者的预期寿命约减少了20-30年(48)。SCD慢性疼痛不仅仅是血管闭塞疼痛的延续：其通常继发于各个关节的骨缺血性坏死(49)。镰状红细胞可能在脾中被截留，使其变大并且促进引起突然和严重贫血的脾脏阻断危象。功能性无脾使患者容易被感染(18)。骨生长迟缓、肾脏(32)、眼(33)和脑血管并发症(范围从临床表现的急性中风到暂时性沉默缺血性梗死)(50)被看作是SCD和血管闭塞损伤的主要临床结果(22)。急性胸部综合征是另一个主要的并发症(51)，其是发病和死亡的重要原因(52)。

疼痛发作似乎由包括寒冷、压力和强体力活动在内的多种因素引发(38，53)。痛危象发生的频率、严重性、位置和持续时间各不相同，即使在特定的疾病亚型中。与具有血红蛋白SC和镰状细胞β°地中海贫血基因型的患者相比，具有纯合性镰状细胞和镰状细胞β°地中海贫血的患者血管闭塞痛危象发生的频率更高(54)。认为疾病的严重性取决于遗传、流变和血液因子以及微血管和内皮因子的复杂相互作用。危象通常包括背、腿、膝、胳膊、胸部和腹部的疼痛(53)。危象和疼痛严重性的频率在不同患者间有相当的不同，并且在同一患者中随时间变化也有相当的不同。一项对从新生儿到50岁患者疼痛程度评价的研究表明，有5.2％的镰状细胞病患者每年重度疼痛发作3-10次(54)。在一项独立的研究中，在美国大约30％的镰状细胞患者(约27000个患者)每年出现3次或更多次疼痛危象(55)。此外，最近的一项对SCD患者健康相关的生活质量进行评价的研究(PiSCES)表明，SCD患者中的疼痛危象可能明显报道不全。

目前对血管闭塞的治疗

SCD患者的血管闭塞可以通过包括血管闭塞性疼痛危象、急性胸部综合征、脑血管发生以及多种类型的器官衰竭在内的多种方式表现。因此，血管闭塞的治疗方式取决于疾病的临床过程和严重性，并且性质上通常是对症的或治标的。对患者进行教育以避免促进血管闭塞性疼痛危象的启动因素已经显示出一些预防性的益处。两种最常见的对症治疗法是输血和镇痛药。大多数SCD患者的血红蛋白值通常是6-10g/dL，血管闭塞性疼痛危象中血红蛋白值通常下降至少1g/dL。可以采用麻醉品治疗血管闭塞性危象引起的重度痛，但是由于关系到麻醉品成瘾和耐受，其应用是有争议的。麻醉品使用的其它并发症是觅药行为、镇静作用和呼吸抑制。尽管缺乏足够的证据支持氧处理的有效性，但已经利用氧处理来治疗血管闭塞性疼痛危象。在血管闭塞性疼痛危象中有时也使用再水化并带来一些益处(22，38)。

可以考虑骨髓移植，其是有治疗效果的，但其使用局限于数量有限的患者，并且具有高发病和死亡的风险(22)。

羟基脲(Droxia)是唯一经FDA批准的用于治疗SCD疼痛危象的药物。其产生有益效果的机制尚不确定，但可能涉及增加RBC中的血红蛋白F水平，从而降低血红蛋白S聚合的水平。羟基脲具有细胞毒性、骨髓抑制性和致畸性(57，58)，这意味着对SCD患者具有致癌风险。然而，对于血液毒性、器官损伤和致癌性的长期作用至今仍不清楚(59，60)。

总之，针对SCD患者血管闭塞性疼痛危象的大多数治疗会缓解症状，但是都没有解决这种衰弱病症的内在原因。至今为止，只有一种治疗被FDA批准用于治疗疼痛危象，因此，SCD患者代表有严重发病率且危及生命的疾病中主要未满足的医疗需求。

P-选择素作为SCD的治疗靶标

如上所述，在SCD中镰状红细胞、血小板、白细胞和微血管***之间的相互作用是依赖P-选择素的过程，其导致血管闭塞和疼痛危象。对工程化表达人β血红蛋白S(β^S)的转基因小鼠的研究已经表明，抗体介导的对P-选择素功能的抑制作用能够阻止和/或减少血管闭塞，提示该靶标有治疗潜力。此外，表达β^S血红蛋白但缺少P-选择素(由于基因缺失)的小鼠没有患血管闭塞，这进一步支持该分子对发病具有关键作用。

SCD患者的高炎症状态具有活化的单核细胞和血管内皮的特征(61-63)。在休眠状态的β^S小鼠中证实了相似的促炎表型，其表现为外周血白细胞和嗜中性粒细胞的水平升高、滚动和粘附的白细胞数量增加以及血流量和红细胞流速降低(64)。β^S小鼠对缺氧/复氧过敏，产生炎症反应，其表现为粘附和移动的白细胞数量显著增加。上述炎症反应可以被功能阻断性抗小鼠P-选择素抗体完全阻断，但不能被功能阻断性抗小鼠E-选择素抗体完全阻断，这证明P-选择素在该过程中发挥关键作用。

P-选择素在将白细胞募集到炎症和血栓部位中发挥核心作用，其通过与其反受体P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)(或镰状红细胞上的PSGL-1样受体)结合，所述P-选择素糖蛋白配体1是在包括中性白细胞、单核细胞、血小板在内的白细胞和某些内皮细胞上组成型表达的粘蛋白样糖蛋白(68)。选择素的最终生理功能是促进白细胞渗出到炎症或损伤组织中。该过程的关键和核心是内皮上的P-选择素首先与白细胞上的PSGL-1结合。白细胞滚动和粘连到活化的内皮和血小板的主要机制是白细胞的PSGL-1与这些细胞上的P-选择素的结合(68，69)。PSGL-1结合P-选择素、L-选择素和E-选择素(70)。已经对P-选择素和SGP-3(根据PSGL-1N末端建模的糖硫肽(glycosulfopeptide))进行了共结晶，并且鉴定了凝集素-配体结合的接触残基(71)。

选择素具有共同的结构基序，包括凝集素结构域(或碳水化合物识别结构域)、表皮生长因子样结构域(EGF)、一系列的共有重复序列、跨膜结构域和胞质尾(70)。如上所述，P-选择素和PSGL-1的相互作用介导白细胞最初的粘连和滚动。因此，对P-选择素功能的阻断可以阻止白细胞滚动和粘连，从而防止与内皮细胞或血小板的牢固粘附，对P-选择素功能的阻断可以通过使用(1)P-选择素抗体、(2)PSGL-1抗体、(3)PSGL-1片段或PSGL-1的重组形式、(4)模拟PSGL-1结合结构域的小分子、以及(5)破坏P-选择素和PSGL-1结合的其它分子。P-选择素或PSGL-1缺失的小鼠也不能支持白细胞在活化的内皮细胞上粘连和滚动(72，74)。L-选择素具有双作用，即在循环的白细胞中组成型表达以及能够通过与其它白细胞的PSGL-1相互作用启动“第二结合”(75)。该过程会导致将新的白细胞进一步募集到炎症部位。L-选择素与PSGL-1的结合在使白细胞向次级淋巴***高内皮微血管(HEV)静脉归巢中也是起作用的(76)。在P-选择素介导之后的数小时内，E-选择素被转录调控并在活化的内皮细胞上表达。E-选择素以低亲和力结合PSGL-1，但还能够结合其它配体。每种选择素的单转基因敲除小鼠已证明这些分子对白细胞归巢和滚动具有选择素补偿机制(77)。

鉴于此，对于将通过破坏P-选择素和PSGL-1的结合靶向选择素作为治疗炎症和血栓疾病方法的新疗法，例如抗体，有明确的需求。因此，本发明构思的目的是阻断P-选择素与PSGL-1结合，从而阻断有助于SCD和本文其它地方所讨论的其它血栓性疾病中的血管闭塞的血细胞的粘附。

发明概述

本发明构思涉及特异结合P-选择素的“双功能”抗体，其不仅会阻断PSGL-1与P-选择素的结合，而且会使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。本发明公开内容描述了P-选择素凝集素结构域(例如，碳水化合物识别结构域，CRD)中迄今为止未被认识到的抗体结合区(构象表位)，双功能抗体(例如，可以是嵌合的、人或人源化抗体或其片段)可以与该抗体结合区结合。因此，本发明构思涉及会与本文所描述的构象表位结合的抗P-选择素抗体或其片段，所述抗体或其片段具有下述的双功能：(1)阻断PSGL-1与P-选择素结合和(2)使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。本发明构思尤其涉及在治疗灵长类动物(包括人)中与血小板、镰状红细胞、白细胞、淋巴细胞和/或内皮细胞粘附相关的的炎症、血栓或其它状况或疾病中使用本文所描述的此双功能抗P-选择素抗体或抗体片段，其中所述状况或疾病包括或相关于(但不限于)以下至少一种：镰状细胞血管闭塞性疼痛危象、炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠炎)、关节炎(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、银屑病、皮炎、败血症、肾炎、红斑狼疮、硬皮病、鼻炎、过敏反应、糖尿病、多发性硬化、动脉粥样硬化、血栓形成、肿瘤转移、***反应、甲状腺炎、缺血再灌注损伤(例如，由于心肌梗塞、中风或器官移植)和大面积创伤相关的状况、或慢性炎症例如IV型迟发型超敏反应(如结核杆菌感染相关)、或全身炎症反应综合症、或多器官衰竭。重要的是，在治疗这些炎症疾病中使用本文所描述的双功能抗体，不仅可以预防炎症，而且由于所述抗体能够使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离，还提供了治疗进行中的炎症疾病进程的机制。例如，对于镰状细胞血管闭塞性疼痛危象，双功能活性抗体不仅抑制或预防未来的血管闭塞事件，而且还治疗进行中的血管闭塞。本文所公开的本发明构思的其它实施方案将在下文的具体实施方式中显见。

附图说明

图1显示了人和小鼠P-选择素氨基酸水平的同源性比较，其中标出了凝集素结构域、EGF结构域、CRl结构域和CR2结构域(箭头↓表示不同结构域之间的过渡)的位置。虚线框表示非线性构象结构域A、B、C1、D、E1、C2、E2、C3和F。氨基酸差异用黑体表示。

图2显示了抗P-选择素抗体G1、G3、G4和G5结合SEQ ID NO：1-4、7-10、18和19的代表性两步BIACORE P-选择素嵌合体结合数据。注意，在Biacore两步结合试验中，G5抗体的结合仅针对SEQ ID NO：1、2、18和19进行。G4是新的抗P-选择素小鼠单克隆抗体，其是由在公认的保藏机构美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(10801University Blvd.，Manassas，VA20110-2209)中所保藏的专利保藏编号为PTA-12154的杂交瘤产生的。

图3显示了BIACORE感应图(sensogram)，其证明通过本文所描述的方法，采用抗P-选择素抗体G1、G3、G4和hSel001(hSel001，也称作SelGl，是G1的人源化形式)，阻断了P-选择素与PSGL-1的相互作用。表明G1、G3、G4和hSel001阻断P-选择素与糖硫肽GSP-6(PSGL-1模拟物)的相互作用。G5结合P-选择素，但并不阻断。对照是P-选择素与GSP-6的稳定结合状态。

图4显示了BIACORE感应图，其证明当暴露于双功能抗P-选择素抗体G1、G4和hSel001时，预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。PSGL-1模拟物GSP-6肽代表PSGL-1。RU值的初始增加表明P-选择素与耦联到链霉亲和素包被的BIACORE芯片上的生物素-GSP-6结合。一旦达到了P-选择素/GSP-6复合物的稳定状态结合(即，复合物的正常解离达到接***衡之后)，即可注射测试抗体并评价其解离特性。G5与预先形成的复合物结合，但不引起其解离。G3与预先形成的P-选择素/GSP-6复合物不结合而且也不能使其解离。G1、G4和hSel001都能结合并引起预先形成的P-选择素/GSP-6复合物解离，表明具有新的双功能性能。

图5显示了结合GSP-6的人P-选择素分子的3-D示意图。凝集素结构域和EGF结构域用虚线隔开。结合区1确定了凝集素/配体结合区远端的A簇构象表位。测试抗体G1结合1区、A簇。G4和hSel001也结合1区、A簇。

图6显示了人嗜中性粒细胞在低和高密度P-选择素上流动的条件下，基于细胞的体外滚动分析结果的图表。结果证明当暴露于抗体G1、G3、G4和hSel001时，预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物阻断和/或解离，随后释放嗜中性粒细胞。整个研究持续期间抗体以20μg/ml的当量浓度导入。由于***的死容积，抗体到达容器之前有大约1分钟的滞留时间。在1分钟间隔之后，对保持结合的细胞进行计数，并表示为细胞结合％。图(A)和(C)显示在低密度(50位点(sites)/μm²)细胞膜P-选择素条件下，分别以5μm/s和6.5μm/s的平均速度滚动的嗜中性粒细胞。图(B)和(D)显示在高密度(380位点/μm²)细胞膜P-选择素条件下，以1μm/s的平均速度滚动的嗜中性粒细胞。

图7是显示在单个P-选择素浓度下G1和hSe1001与P-选择素的结合动力学的感应图。

具体实施方式

在通过示例性附图、实验、结果和实验程序详细解释本发明构思的至少一个实施例之前，应当了解的是本发明构思并不限于以下说明书中阐述或附图、实验和/或结果中所示例部分的构建和设置细节。本发明构思能适用于其他实施例，或以各种方式实施或进行。在本文中所使用的语言希望给出尽可能宽的范围和意思，并且实施例是示例性的，而非穷举。而且应当了解的是在本文中所使用的措辞和术语是用于说明的目的，不应当认为是限制性的。

除非在本文中另外定义，与本发明构思相关的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的意思。此外，除非上下文另有需要，单数术语将包括复数，复数术语将包括单数。通常与本文中所描述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白质、寡核苷酸或多核苷酸化学以及杂交相关的名称和技术是本领域公知且通常使用的。采用重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化的常规技术(例如，电穿孔、脂转染)。根据制造商说明或如本领域通常完成的或如本文中所描述的那样进行酶反应和纯化技术。通常根据本领域公知的常规方法以及如在本说明书所引证和讨论的各种一般或更加特定的参考文献中所描述，进行上述技术和操作。参见例如，Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)and Coliganet al.Current Protocols in Immunology(Current Protocols，Wiley Interscience(1994))，其以引用的方式并入本文。与本文中所描述的分析化学、合成有机化学、药物化学和制药化学相关的名称、实验步骤和技术是本领域公知且通常使用的。使用常规技术用于化学合成、化学分析、药物制备和配制、递送和患者治疗。

说明书提及的全部出版物和专利申请表明本发明构思所属技术领域的技术人员的技术水平。全部出版物和专利申请以相同程度的引用方式并入本文，就好像每个单独的出版物或专利申请明确地和单独地以引用的方式并入本文。

根据本发明公开内容不需要过度的实验即可制造和实施本文所公开和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管在优选实施例中已经对本发明构思的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言显而易见的是，不脱离本发明构思概念、精神和范围的变化可以应用于本文所描述的组合物和/或方法以及方法的步骤和顺序。所有这些对本领域技术人员显而易见的相似替换和修饰属于所附权利要求所限定的本发明构思的精神、范围和概念。

如根据本发明所使用，除非另有声明，下述术语将理解为具有下列含义：

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”配合使用时，措词“a/an(一)表示“一个/种”，但是其也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种以上”的意思一致。虽然本发明公开内容支持仅指可选项和“和/或”的定义，但在权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明显地表示只涉及可选项，或可选项是互相排斥的。在整个申请文件中，术语“大约”用于表示数值包含确定该数值的设备和方法的固有误差变化，或研究对象中存在的变化。术语“至少一个”的使用应理解为包括1以及大于1的任意数量，包括不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100等。根据其后连接的术语，术语“至少一个”可以扩大到高达100或1000或更大。此外，数量100/1000不应被认为是限制性的，因为更高的限值也可以产生满意的结果。

术语“大约”用于表示数值包含确定该数值的设备和方法的固有误差变化，和/或研究对象中存在的变化。

本申请说明书和权利要求中所使用的“包含”(以及任何形式的包含)、“具有”(以及任何形式的具有)、“包括”(以及任何形式的包括)或“含有”(以及任何形式的含有)是包含在内的(inclusive)或开放式的，并且不排除其它未列举的要素或方法步骤。

本发明所使用的术语“或其组合”是指该术语之前所列出的术语的所有排列和组合。例如，“A，B，C或其组合”表示包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中至少一个，并且如果在特定上下文中顺序是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，其还明确包括含有一个或多个项目或术语重复的组合，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员应当了解除非根据上下文明显例外，通常对任意组合中项目或术语的数量没有限制。

本发明所使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。本发明所使用的术语“多肽”是表示天然蛋白、蛋白片段或多肽序列类似物的总称。因此，天然蛋白、蛋白片段和类似物是多种形式的多肽。本发明所使用的术语“分离的肽/多肽/蛋白质”是指cDNA、重组RNA或其合成来源或其某些组合的肽/多肽/蛋白。根据其起源或衍生来源，“分离的肽/多肽/蛋白质”：(1)与天然存在的肽/多肽/蛋白质不相关，(2)不含来自同一来源的其它肽/多肽/蛋白质，例如，不含鼠蛋白，(3)通过不同物种的细胞表达，和/或(4)自然界不存在。

本发明所使用的术语“氨基酸”包括含有氨基官能团和酸性官能团的所有分子，不论天然的还是合成的，并且能包括在天然存在的氨基酸聚合物中。示例性的氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同源物；具有衍变侧链的氨基酸类似物；以及上述任一物质的所有立体异构体。本发明所使用的术语“小鼠氨基酸”是指在小鼠P-选择素中存在、但在人P-选择素相应位置上不存在的氨基酸残基。本发明所使用的术语“人氨基酸”是指在人P-选择素中存在、但在小鼠P-选择素相应位置上不存在的氨基酸残基。

如本文中所使用的，二十种常见氨基酸及其缩写按常规使用。参见Immunology--A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.Gren，Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。二十种常用氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可以是本发明公开和发明构思要求保护的多肽的适宜组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文所使用的多肽标记中，根据标准使用和常规，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。

术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指核苷酸任意长度的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。下面是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、根据连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物装配之前或之后进行氨基酸结构的修饰。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。可以进一步修饰多核苷酸，例如与标记组分结合。术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”可互换使用。如果(1)与“分离的多核苷酸”天然存在的全部或部分多核苷酸无关联，(2)与天然未连接的多核苷酸连接，或(3)并非作为较长序列的一部分天然存在，则认为核酸或多核苷酸是“分离的”。

本发明所使用的术语“载体”是表示能转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指附加DNA片段可以连接到其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中附加DNA片段可以连接到病毒基因组。某些载体在其引入的宿主细胞中能够自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时可以整合到宿主细胞基因组中，从而随宿主基因组一起复制。然而，某些载体能够指导基因的表达。这些载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。

本发明所使用的术语“天然存在”当用于某客体时是指，该客体可以存在于自然界。例如，在生物体(包括病毒)中存在的、可从天然来源分离的、并且其未经实验室或其它地方有目的人为修饰的多核苷酸或多肽序列是天然存在的。在本文中术语“天然存在”可以与“天然的”互换使用。

本发明所使用的术语“白细胞滚动”包括白细胞与血管内皮细胞的弱粘附，以及在白细胞稳定粘附到内皮组织和白细胞迁移到内皮组织之前白细胞沿着血管内皮细胞的滚动。白细胞滚动之后，这些粘附的白细胞能移动通过内皮并且在再灌注期间破坏缺血组织。相应地，白细胞滚动的减少导致由急性炎症反应所引起的组织和器官损伤的减少。

本发明所使用的术语“P-选择素拮抗物”包括能够拮抗P-选择素的任何试剂，例如通过抑制P-选择素和P-选择素糖蛋白配体1间的相互作用，例如通过抑制表达P-选择素的内皮细胞和活化的血小板与表达PSGL-1的白细胞间的相互作用。

术语“分离的”或“纯化的”是指基本上脱离天然环境的分子，并且其是存在的主要种类(例如以摩尔计)，例如组合物的50％以上。例如分离的蛋白质基本上不含其所衍生自的细胞或组织源的细胞物质或其它蛋白质。所述术语还表示分离蛋白为至少60％(w/w)纯度、或至少70％(w/w)纯度、或至少75％(w/w)纯度、或至少80％(w/w)纯度、或至少85％(w/w)纯度、或至少90％(w/w)纯度、至少92％(w/w)纯度、或至少95％(w/w)纯度、或至少96％(w/w)纯度、或至少97％(w/w)纯度、至少98％(w/w)纯度、或至少99％(w/w)纯度、或至少100％(w/w)纯度的制备物。在一些实施方案中，分离的分子其纯度足够用于药物组合物。

“抑制”活性是指与不含有P-选择素抑制剂(例如抗体或其片段)时的P-选择素活性相比，所述P-选择素抑制剂使P-选择素的活性降低。中和抗体可以降低P-选择素的一个或多个活性。例如，活性(例如P-选择素结合至PSGL-1)降低优选至少约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更高。在另一个实例中，双功能抗体或其片段的解离活性(即可引起被解离的预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物的百分比)可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更高。

本发明所使用的术语“P-选择素抑制剂”包括能够抑制P-选择素活性、表达、加工、结合或细胞表位定位的任何试剂，例如中和抗体。认为这些抑制剂“抑制”、“中和”或“降低”P-选择素的生物活性。

术语“有效量”是指生物活性分子或其偶联物或衍生物当以本发明构思所公开的方式使用时，其用量足以表现出可检测的治疗作用，优选地没有过度的不良副作用(例如毒性、刺激和***反应)，这相当于具有合理的利益/风险之比。术语“药学上可接受的”是指化合物和组合物适合施用于人和/或动物，其没有例如毒性、刺激和/或***反应的过度不良副作用，这相当于具有合理的利益/风险之比。本发明构思公开的化合物可设计为利用本领域公知的制剂技术提供迟发、调控或持续的释放。

术语“表位”是指与抗体分子可变区中称为互补位的抗原特异结合位点相互作用的多肽的抗原决定簇。表位可以是线性的或构象的。构象表位由来自线性多肽链不同片段的空间间隔的氨基酸产生。

本发明所使用的术语“单克隆抗体”是指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即除了少量存在的可能天然出现的突变以外，组成所述群的各抗体都是相同的。单克隆抗体通常对单一表位有高特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规多克隆抗体制剂相反，每个单克隆抗体针对单一抗原决定簇。除了具有特异性，单克隆抗体的有益之处在于，在一个实施方案中，它们通过杂交瘤培养物合成，没有被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示获得自基本上同质的抗体群的抗体的特征，并且不被解释为要求通过特定方法生产抗体。

抗体

抗体分子属于称为免疫球蛋白的血浆蛋白家族，其基本构件免疫球蛋白折叠或结构域以多种形式应用于免疫***和其它生物识别***的许多分子中。典型的免疫球蛋白具有四个多肽链，含有称作可变区的抗原结合区以及称作恒定区的非可变区。

天然抗体和免疫球蛋白通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间各不相同。每个重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。每个重链在其一端具有一个可变区(VH)，其后是多个恒定区。每个轻链在其一端具有一个可变区(VL)，在其另一端具有一个恒定区。轻链恒定区与重链第一恒定区对齐，并且轻链可变区与重链可变区对齐。

根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分成不同类型。免疫球蛋白有至少5个主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们中一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4以及IgA1和IgA2。与不同种类的免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据轻链恒定区的氨基酸序列，抗体轻链可以指定为两个明显不同类型——称为κ和λ——中的一个类型。不同类型免疫球蛋白的亚基结构和三维构象是公知的。

抗体可变区中的术语“可变”是指可变区某些部分的序列在抗体中广泛不同的事实。可变区用于结合和确定每个特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在整个抗体可变区中并不是均匀分布的，它们集中在重链和轻链可变区的每条链中称作互补决定区(CDR)的三个部分，也称作高变区。在多数情况下，轻链可变区存在三个CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)，重链可变区存在三个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)。CDR有助于抗体分子的功能活性，并且其被构成支架或框架区的氨基酸序列所分隔。在各CDR中，CDR3尤其是CDRH3序列是最多样化的，因此其对抗体的特异性最有帮助。有至少两种确定CDR的技术：(1)基于不同物种序列可变性的方法(即Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institute of Health，Bethesda，Md.(1987)，其全部内容以引用的方式并入本文)；以及(2)基于抗原-抗体复合物晶体研究的方法(Chothia等人，Nature，342：877(1989)，其全部内容以引用的方式并入本文)。

可变区中较高度保守的部分称作骨架(FR)。每个天然重链和轻链可变区都包含通过三个CDR连接的主要采用β-片层结构的四个FR区，所述CDR形成环连接，在某些情况下，形成部分β-片层结构。每个轻链和重链的CDR通过FR区紧密靠近在一起并参与抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接参与抗体结合抗原，但是表现出多种效应子作用，例如抗体参与的抗体依赖的细胞毒性作用。

因此，本发明构思公开的抗体可以采用多种形式中任一种，包括完整免疫球蛋白、例如Fv、Fab的抗体片段以及类似片段、包含可变区互补决定区(CDR)的单链抗体以及诸如此类的形式，所有这些均落入如本文所使用的宽泛术语“抗体”中。在优选的实施方案中，在下文所描述的治疗和筛选方法中均使用了对本文所述本发明构思的抗原或表位具有免疫特异性的抗体或其片段。

本发明所使用的术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的称为Fab片段的抗原结合片段和一个残留的由于其具有易于结晶能力而称为“Fc”的片段，其中每个Fab片段均有一个抗原结合位点。胃蛋白酶处理产生具有两个能交联抗原的抗原结合片段的F(ab′)2片段和一个残留的其它片段(称作pFc′)。其它片段可以包括由抗体片段所形成的双特异抗体、线性抗体、单链抗体分子和多特异性抗体。本发明所使用的关于抗体的“功能片段”是指Fv、F(ab)和F(ab′)2片段。本发明构思公开的抗体片段例如可以是小至大约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30至35、至40、至45、至50、至75、至100或至150、至200、至250(均是包含在内的)或更多氨基酸。，

下面定义了一些类型的抗体片段：

Fab是包含抗体分子单价抗原结合片段的片段。可以使用木瓜蛋白酶对完整抗体进行消化来制备Fab片段，产生完整的轻链和一条重链的一部分。

Fab′是抗体分子片段，可以使用胃蛋白酶处理整个抗体，随后进行还原，产生完整的轻链和一部分重链而获得。每个抗体分子可以得到两个Fab′片段。

Fab′片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1区羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。

(Fab′)2是抗体片段，可以使用胃蛋白酶处理整个抗体，其后不经还原获得。(Fab′)2是由两个二硫键结合在一起的两个Fab′片段的二聚体。

Fv是最小的抗体片段，其含有完整抗原识别和结合位点。所述区域由一个重链可变区和一个轻链可变区以紧密非共价结合的二聚体组成(VH-VL二聚体)。在该构型中，每个可变区的三个CDR相互作用从而在VH-VL二聚体表面形成抗原结合位点。六个CDR共同决定抗体的抗原结合特异性。然而，尽管比完整结合位点的亲和力低，单个可变区(或Fv的一半，其仅包含三个抗原特异的CDR)也具有识别和结合抗原的能力。

单链抗体(SCA)在本文中定义为基因工程分子，其包括轻链可变区和重链可变区由适合的多肽连接物连接形成基因融合的单链分子。所述单链抗体也称作“单链Fv”或“sFv”或“scFv”抗体片段。Fv多肽通常还包括使sFv形成抗原结合所需结构的VH和VL区之间的多肽连接物。

在一实施方案中公开的本发明构思涉及特异结合人P-选择素的抗体。所述抗体中的CDR不限于VH和VL的特异序列，可以包括保留阻断和解离P-选择素结合PSGL-1能力的这些序列的变体。本领域技术人员使用本领域公知的技术可以制备上述变体。例如，可以根据本发明其它地方所描述的在FR和/或CDR中进行氨基酸替换、缺失或添加。通常设计FR的变化以提高抗体的稳定性并降低其免疫原性，典型地设计CDR的变化以增加抗体对其靶标的亲和力。FR变体还包括天然存在的免疫球蛋白的同种异型。可以通过常规技术由经验确定上述提高亲和力的改变，包括改变CDR，并测定抗体对其靶标的亲和力。

例如，可以在任一公开的CDR中进行保守氨基酸替换。可以根据本领域技术人员公知的方法进行各种改变(78)。这些改变包括但不限于下述的核苷酸序列，其通过序列中编码相同或功能相当的氨基酸残基的不同密码子的替换(“保守替换”)所改变，因此产生“沉默”改变。例如，可以相互保守替换的非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。可以相互保守替换的极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。可以相互保守替换的带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。可以相互保守替换的带负电荷(酸性)的氨基酸包括门冬氨酸和谷氨酸。序列中氨基酸的替换还可以选择氨基酸所属类别的其它成员。

可以采用本领域公知的各种技术，包括重组和合成方法在内，制备本发明构思的抗体衍生物和类似物(79，80)。下面进一步详细论述了其CDR序列与抗P-选择素抗体例如hSel001可变区的CDR序列间的差别仅是保守和非实质的抗体，这些抗体也涵盖于本发明保护范围之内。如上所述的，氨基酸通常被具有相似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸所替换。这些替换属于本领域技术人员的普通技术。此外，本领域技术会了解可以对FR进行改变而不会对抗体结合特性产生不良影响。FR的改变包括但不限于对非人来源的人源化或对抗原接触或稳定结合位点重要的某些骨架残基的工程化，例如改变恒定区的类或亚类，改变可能改变效应物功能(例如Fc受体结合)的特异氨基酸残基。

在一实施方案中公开的本发明构思涉及特异结合P-选择素的抗体，其中将亲本非人源抗体的CDR移植到人受体抗体的FR，这个过程称为抗体人源化。设计人源化过程以减少非人源抗体的免疫原性，同时保留尽可能多的原始亲和力。在一个实施方案中，人重链和/或轻链受体FR是其衍生的种系序列的非突变型氨基酸序列。考虑到在抗体重排和亲和力成熟之前，这些序列在所有人中都存在，预期这些种系FR是非免疫原性的。此外，这些抗体FR的氨基酸残基，尤其是邻近或CDR附近的残基，需要进行氨基酸替换从而更好地保持抗体结合亲和力。例如，当关键氨基酸在亲本小鼠单克隆抗体可变FR和人可变FR受体之间不同时，可以用相应位置的小鼠氨基酸残基替换人FR氨基酸。但是，可以预期，重链和/或轻链FR可以不含氨基酸替换，并且如此人源化来源的抗体，即使没有亲本抗体的全部结合亲和力，仍然可以具有大部分的亲和力。此外，本发明抗体可以包含人VH和/或VL的FR，其完全是种系序列并且这些FR序列的一个或全部均没有替换。

如本文所使用的，P-选择素抗体或其构象表位的“亲和力”用其K_d或解离常数表征。较低K_d值表示较强的亲和力，而较高K_d值表示较弱的亲和力。本发明抗体优选地具有针对P-选择素构象表位的表示为Kd≤1000nM或≤500nM、或≤100nM、或≤50nM、或更优选地Kd≤25nM、并且更优选地Kd≤10nM、更优选地Kd≤5nM或≤1nM或≤0.1nM的亲和力。

如本文所使用的，抗体或抗体片段的“同源物”是指蛋白或多肽的(优选地例如，在CDR和/或VH和/或VL可变区中)的相关氨基酸序列与给定序列至少有50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、至少99.5％同一性、或100％同一性。例如，这些序列可以是衍生自多个物种的变异序列，或者是可以通过重组可以产生的同源序列。所述序列可以通过给定序列的截短、缺失、氨基酸替换或添加而获得。通过标准比对算法，例如局部相似性基本查询工具(Basic Local Alignment Tool)(BLAST)和本领域其它比对算法和方法，确定两条氨基酸序列间的同一性百分比(81-84)。

单克隆抗体的制备对本领域技术人员而言是常规和公知的。可以采用各种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化单克隆抗体。这些分离技术包括蛋白A琼脂糖亲和层析、分子筛层析和离子交换层析。作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方法，通过分别用本文所述构象表位筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)，可以鉴定和分离抗P-选择素单克隆抗体，从而分离本发明的结合P-选择素的免疫球蛋白文库成员。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售可得的(例如，thePharmacia Recombinant Phage Antibody System，目录编号No.27-9400-01；以及the Stratagene SurJZAPTM.Phage Display Kit，目录编号No.240612)。

单克隆抗体的体外内操作方法是本领域技术人员公知的。例如根据本发明方法要使用的单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein(85)首先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组方法制备，例如在美国专利No.4,816,567中所描述的。

另一个方法涉及通过重组方式对单克隆抗体进行人源化以产生例如含有人或灵长类特异且可识别序列的抗体。

本发明构思公开的本文中所描述的以高亲和力结合人P-选择素或其构象表位的抗体的制备方法可以包括用DNA构建体转染细胞，在该细胞表达抗体蛋白的条件下培养所述细胞，并分离所述抗体蛋白，其中所述构建体包含编码本发明P-选择素特异性中和抗体的至少一部分的DNA序列。

优选地，恒定区已被修饰来调节(即降低或增强)本文他处所述的效应子功能(与野生型免疫球蛋白重链Fc区的效应子功能相比)。在多个实施方案中，IgG恒定区具有降低的效应子功能，或增强的效应子功能。Fc效应子功能包括，例如抗体依赖的细胞毒性作用(ADCC)、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性反应和半衰期或清除率功能。改变IgG Fc区的氨基酸序列会影响与Fcγ受体的结合(并因此影响ADCC或吞噬功能)，或改变与补体***的相互作用(补体依赖细胞毒性功能)。

在一个实施方案中，所述抗体包括对至少一个Fc受体具有低亲和力或没有亲和力的恒定区或Fc部分。在另一个实施方案中，第二多肽对补体蛋白C1q具有低亲和力或没有亲和力。通常地，通过改变抗体对例如Fc受体的效应分子的亲和力可以改变抗体的效应子功能。通过修饰效应分子结合位点，通常将改变结合亲和力。在例如美国专利5,624,821和5,648,260中可以找到IgG修饰的公开内容，其改变了与例如Fc受体的效应分子的相互作用。

使用本领域公知的技术可以制备本发明公开的抗体蛋白。例如，可以在细胞中重组制备抗体蛋白(79，86)。

对于重组制备，将编码抗体蛋白的多核苷酸序列***到合适的表达载体，例如含有对于***的编码序列转录和翻译的必需元件的载体。然后将所述表达载体转染到表达该肽的适合靶细胞。本领域公知的转染技术包括但不限于磷酸钙沉淀(87)和电穿孔(88)。可以利用各种宿主表达载体***表达本发明所描述的抗体蛋白，优选地包括真核细胞。

本发明构思进一步提供了分离的核酸，其编码本文公开或以其它方式使可实施的抗体。所述核酸分子可以包括DNA或RNA，并且可以是全部或部分合成或重组的。除非上下文另有要求，否则本文所提及的核苷酸序列包括具有具体指明序列的DNA分子，并且包括具有具体指明序列的RNA分子，其中T替换为U。

在另一实施方案中，编码本发明公开抗体的核酸分子还包括与本发明公开的序列有例如至少50％同一性的核苷酸序列。预期还有下述的实施方案，其中序列与本发明公开序列有至少60％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或至少99.5％同一性，和/或与本发明公开序列在高或中严谨条件下杂交。通过目测和数学计算可以确定同一性百分比。

本发明所使用的严谨(包括“高严谨”)包括本领域技术人员根据例如DNA长度容易确定的条件。通常这些条件被定义为42℃下50％甲酰胺、6xSSC(或其它类似的杂交溶液，例如42℃下50％甲酰胺中的Stark溶液)的杂交条件，并在约68℃下用0.2xSSC、0.1％SDS洗涤。本领域技术人员将了解，必要时，可以根据例如探针长度等因素对温度和洗涤溶液盐浓度进行调节。

本发明所使用的“中度严谨”包括本领域普遍技术人员根据例如DNA长度容易确定的条件。Sambrook等人(79)提供了基本条件，该条件包括对硝酸纤维素过滤器使用预洗溶液(5xSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0))，50％甲酰胺、6xSSC于42℃(或其它类似杂交溶液、例如42℃、50％甲酰胺中的Stark溶液)的杂交条件，以及60℃、0.5xSSC、0.1％SDS洗涤条件。

在本发明中，单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体以及该抗体的片段，只要它们表现出所需的生物活性，所述“嵌合”抗体中，部分重链和/或轻链与特定物种来源的或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而其余的链与另一物种来源的或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源。(美国专利4,816,567)。

抗体片段的制备方法在本领域也是公知的(89)(以引用的方式并入本文)。通过蛋白酶水解抗体或在大肠杆菌中表达编码片段的DNA可以制备本发明的抗体片段。如上所述，通过常规方法使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶对完整抗体进行消化可以获得抗体片段。例如，通过使用胃蛋白酶酶切抗体产生表示为F(ab′)2的5S片段可以制备抗体片段。还可使用硫醇还原剂并任选使用二硫键切割产生的巯基的保护基进一步切割该片段，产生3.5S的Fab′单价片段。或者使用胃蛋白酶酶切直接产生两个单价Fab′片段和一个Fc片段。这些方法在例如美国专利4,036,945和4,331,647以及其中所包含的参考文献中有描述，其以引用的方式将其全部内容明确并入本文中。

还可以使用切割抗体的其它方法，例如分离重链形成单价轻-重链片段，进一步切割片段，或其它酶学、化学或基因技术，只要所述片段结合完整抗体所识别的构象表位。例如，Fv片段包括VH和VL链的结合。所述结合可以是非共价的，或者可变链通过分子间二硫键结合或通过例如戊二醛的化学药品交联。优选地，Fv片段包含由肽连接物连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(sFv)可以通过构建含有由寡核苷酸连接的编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因来制备。将结构基因***表达载体，然后将该表达载体导入例如大肠杆菌的宿主细胞。所述重组宿主细胞合成由连接肽桥连所述两个V结构域的单个多肽链。抗体片段的另一种形式是编码单个CDR的肽。CDR肽(“最小识别单元”)经常参与抗原识别和结合。通过克隆或构建编码目的抗体CDR的基因可以获得CDR肽。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA中合成可变区来制备上述基因。

本发明构思包括工程抗体，其包括全人抗体和人源化形式的非人(例如灵长类或鼠)抗体。所述人源化抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有非人免疫球蛋白来源的最小序列的片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。通常，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白，其中人受体抗体CDR的残基被替换为非人例如小鼠、大鼠或兔子来源的具有所需特异性、亲和力和能力的供体抗体CDR的残基。本发明公开的人源化抗体的实例是包含G4抗体CDR并包含与G4抗体骨架序列同源的人骨架序列的人源化抗体。

在工程抗体制备中，通过成熟的标准方法合成制备编码本发明公开的抗体分子的DNA序列。例如，根据亚磷酰胺法在例如DNA自动合成仪中合成寡核苷酸，并将其纯化、退火、连接和克隆到合适的载体。

然后将DNA序列***到重组表达载体，其可以是便于进行重组DNA操作的任意载体。载体的选择通常取决于其要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体以染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒。另外，载体可以是导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。

在载体中，编码蛋白的DNA序列应当与适合的启动子序列可操作地连接。所述启动子可以是任何DNA序列，其在所选择的宿主细胞中显示转录活性，并且可衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白的基因。用于指导编码DNA序列在哺乳动物细胞中转录的合适启动子的实例包括，但不限于LTR启动子、SV40启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子或2型腺病毒主要晚期启动子。适合在昆虫细胞中使用的启动子是多角体启动子。适合在酵母细胞中使用的启动子包括来自酵母糖分解基因或醇脱氢酶基因的启动子、或TPI1或ADH2-4c启动子。适合在丝状真菌宿主细胞中使用的启动子是例如ADH3启动子或tpiA启动子。

DNA编码序列也可以与适合的终止子可操作地连接，例如人生长激素终止子或(用于真菌宿主)TPI1或ADH3启动子。所述载体可以进一步包含例如多腺苷酸化信号(例如来自SV40或称作腺病毒5Elb的区域)、转录增强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VA RNA的序列)的元件。

重组表达载体可以进一步包含使载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。所述序列(宿主细胞是哺乳动物细胞时)的实例是SV40复制起点。所述载体还可以包含可选择标记，例如产物补偿宿主细胞缺陷的基因，例如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或赋予药物抗性的基因，所述药物例如新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。

用于将编码蛋白的DNA序列、启动子和终止子分别连接并***到含有复制必需信息的合适载体的方法是本领域技术人员公知的。

为了获得本发明公开的重组蛋白，可以通过将编码DNA序列与第二肽编码序列和蛋白酶切割位点的编码序列有效融合，产生编码融合蛋白的DNA构建体，***到重组表达载体中，并在重组宿主细胞中表达，其中所述蛋白酶切割位点的编码序列位于HBP片段和第二肽编码序列之间。在一个实施方案中，所述第二肽选自但不限于由谷胱甘肽S还原酶、小牛胸腺素、细菌硫氧还蛋白或人泛素的天然或合成变体或其肽组成的组。在另一实施方案中，含有蛋白酶切割位点的肽序列可以是具有IEGR氨基酸序列的Xa因子、具有DDDDK氨基酸序列的肠激酶、具有LVPR/GS氨基酸序列的凝血酶或具有切割位点XKX氨基酸序列的水解无色杆菌(Acharombacter lyticus)。

表达载体导入的宿主细胞可以是能表达肽或全长蛋白的任意细胞，优选真核细胞，例如无脊椎动物(昆虫)细胞或脊椎动物细胞，如光滑爪蟾卵或哺乳动物细胞，尤其是昆虫和哺乳动物细胞。适合的哺乳动物细胞系包括但不限于HEk293(ATCC CRL-1573)、COS(ATCC CRL-1650)、BHK(ATCC CRL-1632、ATCC CCL-10)或CHO(ATCC CCL-61)细胞系。转染哺乳动物细胞和表达导入细胞的DNA序列的方法是本领域公知的。

可选地，真菌细胞(包括酵母细胞)也可以用作宿主细胞。适合的酵母细胞实例包括假丝酵母菌某些种(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母某些种(Schizosaccharomyces spp.)的细胞，尤其是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)株。其它真菌细胞的实例是丝状真菌细胞，例如曲霉菌某些种(Aspergillus spp.)或链孢霉某些种(Neurospora spp)，尤其是米曲霉菌(Aspergillus oryzae)或黑曲霉菌(Aspergillus niger)株。在例如EP 238 023中描述了利用曲霉菌表达蛋白。

用于培养细胞的培养基可以是适合哺乳动物细胞生长的任意常规培养基，例如，含有适当添加物的含血清培养基或无血清培养基，或适合昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞或用于表达蛋白的任意细胞生长的培养基。适合的培养基可以通过供应商购买获得或根据出版的配方制备。

然后通过常规方法从培养基中回收细胞重组制备的蛋白，包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过例如硫酸铵的盐使上清或滤液中的蛋白成分沉淀，通过例如HPLC、离子交换层析、亲和层析等各种色谱方法进行纯化。

一旦获得了抗体，例如一旦鉴别了各B细胞和/或产生了单克隆抗体，就能够得到编码这些抗体可变区的序列。例如，通过对杂交瘤、B细胞或噬菌体产生的抗体蛋白首先进行测序，并确定编码核酸序列，可以得到所述可变区序列。在一个实施方案中，也可以对免疫球蛋白可变区(VH和VL)的DNA或cDNA进行测序。如果抗体是从杂交瘤细胞系或分离的B细胞中获得，则可以使用PCR，通过例如Babcook等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-7848(1996))和PCT WO92/02551中所描述的方法，对编码可变区的cDNA进行扩增。以引用的方式将上述两份参考文献的全部内容并入本文。

“嵌合”抗体是指由至少两个不同来源的组分所构成的抗体。在某些实施方案中，嵌合抗体包含第一个物种来源的抗体的一部分，其与另一个分子例如第二个物种来源的抗体的一部分融合。在某些这样的实施方案中，嵌合抗体包含非人动物来源的抗体的一部分，其与人来源抗体的一部分融合。在某些这样的实施方案中，嵌合抗体包含一种动物来源的抗体可变区的全部或一部分，其与第二种动物来源的抗体的一部分融合。例如但并非限制性的，嵌合抗体可以包含非人动物来源的抗体可变区的全部或一部分，其与人来源的抗体恒定区融合。

本发明公开的单克隆抗体的应用需要将其施用给受试者，例如但不限于人。然而，当在非人动物例如啮齿类动物中制备单克隆抗体时，将该抗体施用于病人通常会引发免疫反应，其中所述免疫反应针对该抗体序列。所述反应限制了该治疗方法的持续时间和有效性。为了克服上述问题，将本发明公开的单克隆抗体“人源化”，即对该抗体进行工程改造，以去除其一个或多个抗原部分，并替换为人抗体的相应部分，同时保留对所需表位的抗体亲和力。该工程改造仅涉及少数氨基酸，或可以包括抗体的全部骨架区，仅保留完整的抗体互补决定区。抗体人源化的一些方法是本领域公知的，并且在2001年1月30日授权给Queen等人的美国专利No.6,180,370、在2000年4月25日授权给Brickell的美国专利No.6,054,927、在1999年2月9日授权给Studnicka的美国专利No.,869,619、在1999年1月19日授权给Lin的美国专利No.5,861,155、在1998年1月27日授权给Rodriquez等人的美国专利No.5,712,120和在1989年3月28日授权给Cabilly等人的美国专利No.4,816,567中有公开。以引用的方式将其说明书全部内容明确并入本文中。

如上所提及的，“人源化”抗体是指经修饰使其(在氨基酸序列上)与人抗体更加接近的非人抗体。如上所述的，抗体主要通过位于重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，与CDR以外的序列相比，CDR中的氨基酸序列在各抗体之间更多样化。因为CDR序列负责大多数的抗体抗原反应，因此通过构建表达载体来表达模拟特异的天然存在的抗体性质的重组抗体是可能的，在所述表达载体中，来自天然存在抗体的CDR序列被移植到具有不同性质的不同抗体的骨架序列，例如人抗体骨架区。可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的出版参考文献中获得上述骨架序列。例如，可以在“VBase”人类种系序列数据库(可在互联网mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上获得)以及Kabat，E.A等人(1991年、第五版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH出版编号No.91-3242)的Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest、Tomlinson，I.M等人(1992年J.Mol.Biol.227：776-798)的“TheRepertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups ofVH Segments with Different Hypervariable Loops”和Cox，J.P.L等人(1994年Eur.J.Immunol.24：827-836)的“A Directory of Human Germ-line VHSegments Reveals a Strong Bias in their Usage”(其中每一个的内容均以引用的方式明确并入本文中)中找到人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列。

人源化形式的抗体是主要由人免疫球蛋白序列组成、并且含有非人免疫球蛋白来源的最小序列的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合序列)。可以根据Winter及其同事的方法(Jones et al.，1986；Riechmann et al.，1988；Verhoeyen et al.，1988)，通过将啮齿类动物的CDR序列替换为人抗体的相应序列进行人源化(还参见美国专利No.5,225,539)。在一些情况中，用相应的非人残基替换人免疫球蛋白的Fv骨架残基。人源化抗体还可以包含在接受抗体或者导入的CDR或骨架序列中均不存在的残基。通常地，人源化抗体将包含基本全部的至少一个可变区，典型地两个可变区，其中全部或基本全部的CDR区与全部或基本全部的非人免疫球蛋白CDR区相对应，并且全部或基本全部的骨架区是全部或基本全部的人免疫球蛋白的共有序列的骨架区。最佳地，人源化抗体还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.，1986；Riechmann et al.，1988；andPresta，1992)。

本发明构思进一步包括全人单克隆抗体的应用。全人抗体实质上涉及其中轻链和重链两者的包括CDR在内的全部序列均来源于人类基因的抗体分子。这些抗体在本文中被称作“人抗体”或“全人抗体”。“人抗体”含有人抗体序列，而不含有来自非人动物的抗体序列。在某些实施方案中，人抗体可以进一步含有天然抗体中不存在的合成序列。所述术语不受抗体制备方式的限制。

通过三源杂交瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，Hybridoma，2：7(1983))和用于制备人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人，PNAS，82：859(1985))可以制备人单克隆抗体。人单克隆抗体可以用于本申请公开和要求保护的发明构思的实施中，并且可以通过使用人杂交瘤(参见Cote等人，PNAS，80：2026(1983))或用EB病毒(Epstein Barr Virus)体外转化人B细胞来制备(参见Cole等人，1985)。

此外，通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物中，例如内源免疫球蛋白基因已部分或全部失活的小鼠中，可以制备人抗体。在攻击之后，观察到人抗体的产生，其在各方面与在人中观察到的及其相似，包括基因重排、组装和抗体谱(repertoire)。上述方法在例如美国专利No.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016以及Marks等人J Biol.Chem.，267：16007(1992)、Lonberg等人Nature，368：856(1994)、Morrison，1994、Fishwild等人Nature Biotechnol.，14：845(1996)、Neuberger，Nat.Biotechnol.，14：826(1996)和Lonberg和Huszar，Int Rev Immunol.，13：65(1995)中有描述，但并不限于此。

还可以使用经修饰以对抗原的攻击进行应答产生全人抗体而非动物内源抗体的转基因非人动物来制备人抗体(参见PCT公开文本WO94/02602)。已使非人宿主中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因失活，并将编码人免疫球蛋白重链和轻链的活性基因座***到宿主基因组。例如使用含有必需的人DNA片段的酵母人工染色体纳入人基因。然后通过含有少于全部修饰的中间体转基因动物的杂交育种获得作为子代的具有全部所需修饰的动物。上述非人动物的一个实施方案是在PCT公开文本WO96/33735和WO96/34096中的称作XENOMOUSE^TM的小鼠。该动物产生分泌全人免疫球蛋白的B细胞。可以从目的免疫原免疫后的动物中直接获得例如多克隆抗体制剂的抗体，或者从动物来源的无限增殖B细胞例如产生单克隆的杂交瘤中获得抗体。另外，可以回收并表达编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因直接获得抗体，或可以对上述基因进一步修饰以获得抗体的类似物，例如单链Fv分子。

在1999年8月17日授权给Kucherlapati等人的美国专利5,939,598(其以引用的方式并入本文)中公开了产生非人宿主方法的实例，其以不表达内源免疫球蛋白重链的小鼠作为示例。它可以通过以下方法获得，所述方法包括使胚胎干细胞至少一个内源重链基因座缺失J片段基因，以阻止该基因座的重排并阻止形成重排的免疫球蛋白重链基因座的转录物，所述缺失受到含有编码选择标记基因的靶向载体影响；并由所述胚胎干细胞产生体细胞和生殖细胞均含有编码选择标记基因的转基因小鼠。

在1999年6月29日授权给Hori等人的美国专利5,916,771(以引用的方式并入本文)中公开了产生目的抗体例如人抗体的方法。该方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体导入培养的一种哺乳动物宿主细胞，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体导入另一种哺乳动物宿主细胞，并将上述两种细胞融合形成杂交细胞。所述杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。

术语“中和抗体”或“中和......的抗体”是指减少含有与其特异结合的表位的多肽至少一种活性的抗体。在某些实施方案中，中和抗体减少体外和/或体内活性。术语“抗原结合位点”是指抗体能够特异结合抗原的一部分。在某些实施方案中，抗原结合位点由一个或多个抗体可变区提供。

优选地，本发明的抗体包含一个或多个使补体失活的修饰。从广义上讲，术语“补体活性”包括与补体***、各补体途径相关分子以及编码这些分子的基因活化相关的生物化学和生理活性。因此，补体活性包括例如编码补体途径分子的基因的结构和表达、补体途径分子的生物化学活性(例如酶或调节活性)、引发补体***活化或由补体***活化引起的细胞活性以及存在针对补体途径分子的血清自身抗体。在hSe1001抗体中，使补体失活的优选修饰是用丙氨酸替换重链恒定区CH2位置342的赖氨酸。相同位置的其它替换可以包括例如甘氨酸、亮氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸中任一个，条件是所述替换还可有效消除恒定区活化补体的能力。

术语“补体途径相关分子”、“补体途径分子”和“补体途径相关蛋白”可互换使用，并且均是指在补体活化以及由活化的补体***介导、对其应答或由其引发的下游细胞活性中发挥作用的各种分子。它们包括补体途径的引发剂(即直接或间接引起补体***活化的分子)、补体活化过程中产生或对其起作用的分子(例如，补体蛋白/酶，如C3、C5、C5b-9、B因子、MASP-1和MASP-2)、补体受体或抑制剂(例如，簇连蛋白、玻连蛋白、CR1或CD59)以及由活化补体***调节或引发的分子(例如膜攻击复合物抑制因子MACIF)。因此，除了上文所述的补体蛋白以外，补体途径相关分子还包括，例如C3/C5转化酶调节子(RCA)，如1型补体受体(也称作CR1或CD35)、2型补体受体(也称作CR2或CD21)、膜辅蛋白(MCP或CD46)和C4bBP；MAC调节子，如玻连蛋白、簇连蛋白(也称为“SP40，40”)、CRP、CD59和同源限制性因子(HRF)；免疫球蛋白链，例如Igκ、Igλ或Igγ；C1抑制剂以及其它蛋白，例如CR3、CR4(CD11b/18)以及DAF(CD55)。

双功能抗P-选择素抗体

本发明构思涉及特异结合P-选择素的“双功能”抗体及其片段，其不仅阻断PSGL-1与P-选择素的结合，还使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。本发明公开内容描述了P-选择素凝集素结构域(例如，碳水化合物识别结构域，CRD)中迄今为止未被认识到的抗体结合区(构象表位)，双功能抗体(例如，可以是嵌合的、人或人源化抗体或其片段)可以与该抗体结合区结合。本发明构思还涉及与本文所描述的构象表位结合的抗P-选择素抗体，所述抗体或其片段具有下述的双功能：(1)阻断PSGL-1与P-选择素结合和(2)使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。本发明构思尤其涉及在治疗灵长类动物(包括人)与血小板、镰状红细胞、白细胞、淋巴细胞和/或内皮细胞粘附相关的的炎症、血栓或其它状况或疾病中使用这样的双功能抗P-选择素抗体或其抗体片段，其中所述状况或疾病包括或相关于(但不限于)以下至少一种：镰状细胞血管闭塞性疼痛危象、炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠炎)、关节炎(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、银屑病、皮炎、败血症、肾炎、红斑狼疮、硬皮病、鼻炎、过敏反应、糖尿病、多发性硬化、动脉粥样硬化、血栓形成、肿瘤转移、***反应、甲状腺炎、缺血再灌注损伤(例如，由于心肌梗塞、中风或器官移植)和大面积创伤相关的状况、或慢性炎症例如IV型迟发型超敏反应(如结核杆菌感染相关)、或全身炎症反应综合症、或多器官衰竭。

重要的是，在治疗这些炎症疾病中使用所述双功能抗体，不仅可以预防、减少或抑制炎症，而且由于所述抗体能够使预先形成的P-选择素/PSGL-1解离，还提供了治疗进行中的炎症疾病进程的机制。例如，对于镰状细胞血管闭塞性疼痛危象，双功能活性抗体不仅能够预防未来的血管闭塞事件，而且还能用于治疗进行中的血管闭塞。本发明构思还涉及用于检测与本文新描述的P-选择素构象表位结合的抗P-选择素抗体的筛选方法，所述抗体不仅阻断PSGL-1与P-选择素的结合，还使PSGL-1与P-选择素的结合逆转(即使预先形成的复合物解离)。

如本文所描述的，本发明构思涉及纯化的抗体(包括但不限于嵌合、人或人源抗体及其片段)以及使用该抗体(或其结合片段)的治疗方法，所述抗体识别(即结合)P-选择素(SEQ ID NO：1)，并阻断P-选择素与PSGL-1(或PSGL-1样受体)的结合，进而使得由PSGL-1/P-选择素相互作用介导的预先形成的粘附或细胞复合物解离。

更具体地，本发明构思涉及纯化的抗P-选择素抗体(或其片段)、产生所述抗P-选择素抗体(或其片段)的宿主细胞、鉴定抗P-选择素抗体(或其片段)的筛选方法以及使用所述抗体(或其片段)的治疗方法，所述抗体阻断白细胞、镰状红细胞、淋巴细胞、血小板和内皮细胞P-选择素介导的粘附，还使得由PSGL-1/P-选择素相互作用介导的预先形成的粘附或细胞复合物解离。本发明构思包括针对灵长类动物(包括人)P-选择素的新型抗体及其结合片段，优选地包括但不限于G4、G4的人源化形式和hSe1001抗体。本发明的优选抗体能够与灵长类动物(尤其是人)P-选择素特异结合，并在体外和/或体内抑制P-选择素的一个或多个活性。在本文使用时，术语“PSGL-1”还意在包括镰状红细胞(红细胞)上的“PSGL-1样受体”。

通常地，本发明的抗体或抗体片段可以具有任意的尺寸上限，只要其相对于下述抗体具有类似性质或免疫学性质，所述抗体特异结合本文所描述的P-选择素结合位点，阻断PSGL-1与P-选择素的结合，使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。如本文中所使用的术语“包含在内的”是指本文所列任意两个数之间的全部整数。

如本文另外所述的，本发明的抗体片段保留选择性结合本文所述P-选择素结合表位的全部或部分。优选地，本发明的抗体或抗体结合片段能够结合下述的表位，所述表位包含SEQ ID NO：1所示序列氨基酸残基1-35中一个或多个，或更优选地，氨基酸残基4-23中一个或多个。

如上所述，本发明优选实施方案中的抗体或抗体片段包含同种型IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄或IgG₂/G₄嵌合体的免疫球蛋白，优选地其以高亲和力结合P-选择素(例如其中Kd值≤1000nM)以及优选地包含人恒定区，优选地抑制P-选择素和PSGL-1的结合，更优选地还使预先形成的复合物中P-选择素与PSGL-1的结合逆转。而且，抗P-选择素抗体或其结合片段优选地不通过与C1q相互作用的经典途径活化补体，并且优选地不结合Fc受体，统一称作抗体效应子功能。本发明构思尤其涉及本文所描述和鉴定的这样的双功能抗P-选择素抗体或抗体片段在治疗灵长类动物(包括人)中与血小板、镰状红细胞、白细胞、淋巴细胞和/或内皮细胞粘附相关的炎症、血栓或其它状况或疾病中的应用，其中所述状况或疾病包括的炎症包括或相关于(但不限于)以下至少一种：镰状细胞血管闭塞性疼痛危象、炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠炎)、关节炎(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、银屑病、皮炎、败血症、肾炎、红斑狼疮、硬皮病、鼻炎、过敏反应、糖尿病、多发性硬化、动脉粥样硬化、血栓形成、肿瘤转移、***反应、甲状腺炎、缺血再灌注损伤(例如，由于心肌梗塞、中风或器官移植)和大面积创伤相关的状况、或慢性炎症例如IV型迟发型超敏反应(如结核杆菌感染相关)、或全身炎症反应综合症、或多器官衰竭。

如本文另外所述的，P-选择素在通过与白细胞和淋巴细胞上的表面配体(PSGL-1)结合将这些细胞募集到炎症和血栓部位中以及在镰状红细胞与具有活化内皮细胞的内皮的结合中发挥核心作用。PSGL-1在白细胞(包括中性白细胞和单核细胞)和某些内皮细胞上组成型表达。PSGL-1样受体在镰状红细胞中表达，并使这些细胞能够与活化的内皮细胞上的P-选择素结合。

不想为理论所束缚，人们相信，通过例如本发明抗P-选择素抗体抑制下列任一或多个相互作用对治疗例如镰状细胞血管闭塞性疼痛危象是有效的，所述相互作用为：(1)白细胞上的PSGL-1与活化内皮上的P-选择素结合；(2)镰状红细胞上的PSGL-1样配体与活化内皮上的P-选择素结合；(3)活化血小板表面上的P-选择素与内皮细胞上的PSGL-1结合；(4)镰状红细胞通过未表征的配体-受体相互作用与白细胞结合；(5)活化血小板上的P-选择素与镰状红细胞上的PSGL-1样受体结合，和/或(6)活化血小板表面上的P-选择素与白细胞上的PSGL-1结合。人们相信双功能抗P-选择素抗体在微血管中以细胞-细胞相互作用的多个水平阻断血管闭塞的启动和扩大。另外，如本文另外所述的，所述双功能抗P-选择素抗体使P-选择素/PSGL-1复合物解离，从而能在治疗上用于介入进行中的血管闭塞。

P-选择素介导活化的血小板或内皮细胞与包括某些红细胞(即镰状红细胞)在内的血细胞和包括单核细胞、中性粒细胞、嗜酸细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、B细胞和天然杀伤细胞(NK)在内的白细胞的相互作用。如本文所述的，已知的是，P-选择素参与到许多对由损伤、感染或物理化学攻击所引起的炎症的细胞应答。动脉粥样硬化是一种涉及某些白细胞与血管壁衬里上带有P-选择素的内皮细胞结合的状况的一个实例，其特征是血管内表面的动脉粥样硬化损伤。

如上文所指出的，阻断P-选择素功能的治疗可能对许多类型的炎症和血栓疾病有很深的影响，所述治疗例如使用针对P-选择素的抗体阻止白细胞粘连和滚动以及红细胞(镰状红细胞)的粘附。鉴于P-选择素在启动白细胞向内皮和血小板的滚动和粘连中起关键作用，P-选择素成为治疗炎症和血栓疾病的治疗开发的首要靶标。例如，镰状细胞性贫血急性期的瞬时性与反复出现的器官损伤慢性作用及相关并发症和发病率表明，表现出阻断P-选择素和PSGL-1结合所引起的早期粘附、同时使先前、进行中的或预先建立的粘附解离的治疗性介入在所述和其它炎症和血栓疾病方面会有新的应用。因此，本发明构思包括使用P-选择素的构象抗体结合表位来筛选和鉴定针对P-选择素的“双功能”抗体的方法以及所述抗体在例如但不限于炎症和血栓疾病的疾病治疗方法中的应用，所述“双功能”抗体不仅阻断P-选择素-PSGL-1结合，而且还使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离(并因此使细胞-细胞复合物解离)。

如上所述，已经发现了P-选择素的新型构象结合表位，如本文所述。所述构象结合表位的发现导致高特异性结合所述构象表位的双功能抗P-选择素抗体(因此所述抗体在本文中可以称作“双功能”抗体)的进一步发现，所述双功能抗P-选择素抗体不仅阻断P-选择素和PSGL-1的结合，而且还使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离(即，使P-选择素-PSGL-1的结合逆转)，从而使例如白细胞/内皮细胞、白细胞/血小板、淋巴细胞/内皮细胞、淋巴细胞/血小板、镰状红细胞/内皮细胞或镰状红细胞/血小板复合物的细胞复合物解离。

先前已经对某些P-选择素抗体的结合区进行了定位，其使用了包含小鼠和人天然P-选择素蛋白的凝集素、表皮生长因子(EGF)以及共有重复区(CR)的大功能结构域构建体(90，70，91-95)。这些结果表明，某些功能阻断性P-选择素抗体的首要结合区位于凝集素结合结构域——一个贯穿天然P-选择素蛋白氨基酸残基1-120的区域，或位于贯穿氨基酸121-154的EGF结构域。

下文提供了多个实施例。然而，本发明构思应理解为不限于在这些特定实验、结果和实验过程中的应用。相反，所提供的实施例仅是各种实施方式的一部分，其是示例性的，而非穷举。

本发明公开内容描述了新型非线性(例如构象)表位的发现，所述发现通过使用经功能阻断性P-选择素检测抗体探测的含有P-选择素凝集素结构域、EGF结构域、CR1结构域和CR2结构域的小鼠/人嵌合体。先前的工作已经证明，至少凝集素结构域和EGF结构域的表达是P-选择素构建体正确折叠和构象所需的(91)。人和小鼠P-选择素氨基酸序列的比对表明凝集素结构域在人和小鼠之间具有同源性，并且具有一定数量的氨基酸残基差别。在本文中，使用三维(3-D)结构同源性比较人和小鼠中P-选择素的凝集素结构域、EGF结构域、CR1结构域和CR2结构域(图1)，以确定人和小鼠P-选择素之间的氨基酸差别(根据成熟蛋白的序列和编号)。

所述方法采用P-选择素的3-D模建来比较人和小鼠P-选择素之间蛋白暴露表明上的氨基酸差别位置，并鉴定在折叠蛋白表面上的凝集素结构域和EGF结构域中人和小鼠之间的氨基酸差别簇。所述3-D方法表示出氨基酸差别簇，其是通过蛋白折叠使不连续氨基酸相互靠近毗邻而形成的。例如，通过在螺旋结构的同一表面例如面(face)上，某些氨基酸会形成构象表位。所述簇的同源性比较允许选择氨基酸替换来检测所述改变对功能阻断性(PSGL-1阻断)人P-选择素抗体结合的影响。

所述方法进一步涉及对cDNA开放阅读框架中保守性限制位点进行定位，以确定包含凝集素结构域、EGF结构域、CR1结构域和CR2结构域的嵌合蛋白的构建策略，并且能够对人或小鼠P-选择素中特定位点的单个或多个氨基酸进行替换，从而鉴定优化抗体与人P-选择素结合的那些氨基酸。采用已知的分子克隆技术构建嵌合体，其中使用了人和小鼠P-选择素N末端区域(从ATG到CR2结构域)与合适的载体，例如pBluescript(pBS-hPsel和pBS-mPsel)。将所述嵌合体***到另一个合适的载体，例如pIG1(pIG-hPsel和pIG-mPsel)，在其中所述构建体被融合到含有铰链区、CH2区和CH3区的人IgG1 Fc区。所述构建体保留与P-选择素天然构象一致的结构。因此，天然蛋白表面暴露的结构域也存在于在嵌合体结构中，因而，该结构域作为测试抗体结合的推定表位。使用本领域普通技术人员公知的分子和细胞表达技术能够转染所述构建体并使其瞬时表达。

利用所述方法，可以评价测试抗体与人/小鼠嵌合体的结合，其中使用的方法例如，但不限于本领域普通技术人员公知的荧光激活细胞分选(FACS)和表面等离子共振(BIACORE)方法。通过使人P-选择素的抗体不能够或者能够结合的置换，例如小鼠氨基酸在人序列中的置换，或者相反地，人氨基酸在小鼠序列中的置换，评价嵌合构建体中各位置的氨基酸改变的影响，由此确定最佳结合的特定氨基酸。

嵌合构建体的表征

在下文所描述的嵌合体中，以黑体表示出已替换到人P-选择素序列中的小鼠P-选择素的氨基酸。以斜体黑体表示出已替换到小鼠序列中的人P-选择素的氨基酸。以下划线黑体表示谷氨酰胺替换为组氨酸。

天然蛋白构建体

SEQ ID NO：1

人P-选择素凝集素结构域、EGF结构域、CR1结构域、CR2结构域

SEQ ID NO：2

小鼠P-选择素凝集素结构域、EGF结构域、CR1结构域、CR2结构域-黑体表示与人不同的氨基酸

人/小鼠嵌合构建体

SEQ ID NO：3

嵌合体-1

(人A簇中的小鼠替换-N₄N₁₄V₁₇F₁₈R₂₀R₂₁H₂₂F₂₃)

SEQ ID NO：4

嵌合体-2

(人A簇到I₃₅-其后是小鼠)

SEQ ID NO：5

嵌合体-3

(人A簇替换为小鼠N₄N₁₄V₁₇F₁₈)

SEQ ID NO：6

嵌合体-4

(人A簇替换为小鼠R₂₀R₂₁H₂₂F₂₃)

SEQ ID NO：7

嵌合体-5

(单个氨基酸改变-人H₄改变为小鼠N₄)

SEQ ID NO：8

嵌合体-5Q

(Q替换A簇中的H₄-去除推定的糖基化位点)

SEQ ID NO：9

嵌合体-6

(人序列到EGF-S₁₂₁-小鼠EGF、CR1和CR2)

SEQ ID NO：10

嵌合体-7

(人序列到G₁₇₇-其后是小鼠)

SEQ ID NO：11

嵌合体-7B

(人序列到EGF末端-V₁₅₆-其后是小鼠)

SEQ ID NO：12

嵌合体-8

(单个氨基酸改变-人I₁₄改变为小鼠N₁₄)

SEQ ID NO：13

嵌合体-9

(单个氨基酸改变-人K₁₇改变为小鼠V₁₇)

SEQ ID NO：14

嵌合体-10

(单个氨基酸改变-人Y₁₈改变为小鼠F₁₈)

SEQ ID NO：15

嵌合体-11

(单个氨基酸改变-人Q₂₀改变为小鼠R₂₀)

SEQ ID NO：16

嵌合体-12

(单个氨基酸改变-人N₂₁改变为小鼠R₂₁)

SEQ ID NO：17

嵌合体-13

(单个氨基酸改变-人R₂₂改变为小鼠H₂₂)

SEQ ID NO：18

嵌合体-14

(单个氨基酸改变-人Y₂₃改变为小鼠F₂₃)

SEQ ID NO：19

嵌合体-15

(人序列到C2簇-S₉₇-其后是小鼠)

SEQ ID NO：20

嵌合体-16

(人H₄I₁₄K₁₇N₂₁R₂₂在小鼠A簇中的替换)

SEQ ID NO：21

嵌合体-17

(人序列到B簇到I₃₅-小鼠B簇到I₄₂-人CR1到E₁₅₄-小鼠CR1、CR2)

SEQ ID NO：22

嵌合体-17B

(人序列到B簇到I₃₅-小鼠序列B簇到I₄₂-其后是人)

SEQ ID NO：23

嵌合体-18

(具有小鼠C簇(C1、C2、C3)和小鼠CR1、CR2的人序列)

SEQ ID NO：24

嵌合体-18B

(具有小鼠C簇(C1、C2、C3)的人序列)

SEQ ID NO：25

嵌合体-19

(具有小鼠D簇和小鼠CR1、CR2的人序列)

SEQ ID NO：26

嵌合体-19B

(具有小鼠D簇的人序列)

SEQ ID NO：27

嵌合体-20

(具有小鼠E簇和小鼠CR1、CR2的人序列)

SEQ ID NO：28

嵌合体-20B

(具有小鼠E簇的人序列)

SEQ ID NO：29

嵌合体-21

(具有小鼠F簇的人序列)

抗P-选择素抗体对人/小鼠嵌合体的FACS分析

在例如BD BIOSCIENCES FACS ARIA CELL SORTER的***上采用FACS分析检测抗P-选择素抗体与耦联到包被有山羊抗人Fc抗体的微球(bead)上的人/小鼠嵌合体的结合，从而对与P-选择素人/小鼠嵌合体结合的抗体进行分析。将上述嵌合体包被的微球与抗P-选择素测试抗体孵育，然后用标记有适合FACS***检测的报告子例如FITC的抗小鼠Fc或同种型特异抗体进行检测。

一步表面等离子共振(BIACORE)

在本发明构思的一个方面，利用BIACORE芯片捕获抗P-选择素测试抗体。将本文所描述的人小鼠P-选择素嵌合体配置在芯片上，向预先结合的芯片添加测试抗体。通过共振响应单元来测量嵌合体与测试抗体的结合。

两步表面等离子共振(BIACORE)分析

在本发明构思的另一个方面，捕获芯片例如BIACORE芯片具有与其表面共价连接的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体。将人IgG Fc上的凝集素、EGF、CR1和CR2结构域的P-选择素嵌合人/小鼠构建体注射到芯片上，其被捕获达到根据共振反应所测量的表面包被标准化水平的浓度。在每个P-选择素嵌合构建体上样之后达到的共振反应水平被称作新的“第二基线”水平。然后将抗P-选择素测试抗体(例如小鼠或人源化单克隆抗P-选择素抗体，包括G1、G3、G4、G5和hSel001)注射到BIACORE芯片上，并进行孵育，以与已经在表面上捕获的P-选择素嵌合构建体结合。可以对所述方法进行修改用于检测人源化抗体，所述检测通过在小鼠IgG Fc上生成P-选择素构建体，用山羊抗小鼠IgG Fc多克隆抗体将其捕获，然后用人源化抗P-选择素测试抗体进行探测。与P-选择素构建体结合的抗体使共振反应水平在第二基线的基础上增加。共振反应的增加可以被测量为“增加的共振单元(RU)”，因此其表示测试抗体与预先包被在捕获芯片上的P-选择素构建体的结合水平。利用这些方法，对抗P-选择素抗体与P-选择素嵌合体结合的最佳条件被精确定位到特定构象表位。

双功能抗P-选择素抗体(阻断和使P-选择素与PSGL-1的结合解离的抗体)的鉴定

还使用BIACORE分析来发现特定的抗P-选择素特异抗体的双功能性，即，如本文所讨论的，它们能阻断并使P-选择素和PSGL-1的结合相互作用解离(逆转)。该方法中，使用本领域普通技术人员公知的方法将PSGL-1、例如生物素化的糖硫肽模拟物(例如GSP-6)的PSGL-1结合表位小分子模拟物、或含有PSGL-1N末端的嵌合蛋白捕获到例如链霉亲和素芯片的BIACORE芯片上(GSP-6是PSGL-1暴露N末端氨基酸42-60的糖基化硫化十八氨基酸肽模拟物，其在例如美国专利6,593,459中有详细描述)。首先，在一个实施方案中，为了证明“功能阻断”能力，将抗P-选择素抗体与可溶性P-选择素预先混合，孵育一段时间使P-选择素/抗体复合物形成。然后将产生的抗P-选择素抗体/P-选择素复合物导入带有PSGL-1(或PSGL-1模拟物)的芯片或其它基底上，并检测与PSGL-1或其模拟物的结合。阻止P-选择素与芯片上的PSGL-1或PSGL-1模拟物结合的抗P-选择素抗体在本文中被称作功能阻断性抗体。

其次，可以对已经证实(通过上述方法或另外的类似方法)是功能阻断性抗体(即阻断PSGL-1与P-选择素结合)的抗P-选择素抗体检测其另一个功能，即具有使预先形成的P-选择素PSGL-1复合物的结合解离(逆转)的能力。可以使用本文中所讨论的BIACORE分析方法检测所述抗体的“双功能”性质。在一个实施方案中，为了证明双功能性质，将PSGL-1或其模拟物例如GSP-6耦联到BIACORE芯片。然后在芯片上加入P-选择素并使其与PSGL-1或模拟物结合。当感应图显示P-选择素与PSGL-1或模拟物结合达到平衡之后，将功能阻断性抗P-选择素抗体导入并通过任意适合的方法检测P-选择素与PSGL-1或其模拟物结合的解离。表现出使P-选择素/PSGL-1的结合解离(即逆转)的抗体被称作“解离抗体”，其具有双功能抗体的特征，即它们在破坏P-选择素与PSGL-1结合方面具有功能阻断和解离的性质。由于这些双功能抗体特别适合用于治疗例如本文其它地方所描述的急性和慢性炎症以及血栓疾病的治疗用途，因而是本发明特别优选的实施方案。

构象表位的发现

对成熟人和小鼠P-选择素蛋白的三维(3-D)结构进行分析，并比较了凝集素结构域和EGF结构域的氨基酸差别。经鉴定在该蛋白暴露表面存在六簇构象氨基酸差别。他们被称为A、B、C、D、E和F簇(图1)。包含残基1-35的人和小鼠P-选择素N末端含有8个氨基酸差别。根据第一个氨基酸差别(H4)和最后一个氨基酸差别(Y23)的边界任意地定义A簇。A簇含有20个氨基酸，并形成刚性α螺旋，在靠近该蛋白N末端具有半胱氨酸键(参见图5中的“1”区)。B簇(图1)是包含氨基酸残基36-42的构象表位，其在人和小鼠P-选择素之间含有4个氨基酸差别。本文所使用的术语“构象表位”是指在还原条件下不被识别的表位。C簇和E簇(图1)是构象且非连续的，其通过天然P-选择素蛋白折叠而靠近。C簇具有三个构象区(C1、C2、C3)，其在人和小鼠P-选择素之间含有5个氨基酸差别。C1簇与C2簇间隔51个氨基酸，C2簇与C3簇间隔15个氨基酸。E簇同样具有两个构象表位(E1、E2)，其在人和小鼠P-选择素之间具有5个氨基酸差别，并且E1簇与E2簇间隔19个氨基酸。A、B、C、D和E簇均位于P-选择素的共有凝集素结构域(图1)。F簇位于EGF结构域，在11个氨基酸中具有3个氨基酸差别。C1、E1、C2、E2和C3簇包含先前已被鉴定为参与P-选择素与其生理配体PSGL-1相互作用的关键接触残基(Somers等人)。A簇和B簇位于这些接触残基的远端(上游)。

对人和小鼠P-选择素cDNA的开放阅读框架进行分析，以确定能够用于组装包括上述簇的嵌合体的共有限制性位点。使用PCR和DNA化学合成产生编码特定蛋白或嵌合构建体例如SEQ ID NO：1-29(上文以及序列表所描述)的cDNA。限制性克隆用于构建编码人/小鼠嵌合体的质粒。嵌合体在COS-7细胞中瞬时表达，并被用于FACS和BIACORE分析。使用BIACORE通过分析P-选择素嵌合体与结合到BIACORE芯片上的GSP-6的结合，检测P-选择素嵌合体的结合功能。如上所述的，GSP-6是模拟人PSGL-1N末端的小分子。所有测试的嵌合体均与芯片上的GSP-6结合，但程度不同，因为小鼠P-选择素对人PSGL-1的结合亲和力比人P-选择素对人PSGL-1的结合亲和力低。这表明嵌合体在表达和纯化后保持功能。

FACS分析

表1中概述了使用SEQ ID NO.：1-29对应的构建体或嵌合体进行的抗P-选择素抗体的FACS分析结果。从含有凝集素结构域和EGF结构域的人重组P-选择素免疫小鼠所产生的杂交瘤中分离到四个抗P-选择素测试抗体(G1、G3、G4和G5)(90以及未公布的资料)。这些研究证实所述抗体均是人P-选择素特异的，其中G1、G3和G4是功能阻断性抗体，而G5是非阻断性的(90以及未公布的资料)。通过FACS分析对G1、G3和G5进行分析。使用该方法，G1、G3和G5均与人P-选择素(SEQ ID NO：1)结合，而与小鼠P-选择素(SEQ ID NO：2)不结合。当8个对应的小鼠氨基酸被置换到人序列A簇(嵌合体1，SEQ ID NO：3)中时，消除了G1的结合，而G3或G5的结合则没有被消除，这表明A簇中对应的8个氨基酸位置中至少有一个或多个是G1与P-选择素结合所必需的，用“小鼠”氨基酸替换所述一个或多个位置会消除所述结合。为了确认这些残基的重要性，将位置1-23的8个不同的人氨基酸替换到小鼠序列的A簇(嵌合体-2，SEQ ID NO：4)中。这些替换使G1能够与该小鼠蛋白结合。G1和G3与下述嵌合体结合：含有人P-选择素凝集素结构域且在EGF结构域、CR1结构域和CR2结构域中有小鼠氨基酸替换的嵌合体(嵌合体-6，SEQID NO：9)，以及含有贯穿EGF结构域并进入CR1结构域的人序列、且在余下的CR1结构域和整个CR2结构域中有小鼠序列的嵌合体(嵌合体-7，SEQ ID NO：10)，这表明这些小鼠氨基酸替换之后，主要结合表位仍是完整的，对抗体结合表位的构象没有不利影响。这些数据确认，G1和G3的结合表位位于凝集素结构域中。

使用FACS方法，证明了测试抗体G3与人P-选择素结合，而与小鼠P-选择素不结合，且与G1相反，其结合SEQ ID NO：3(嵌合体-1)，这表明G3与G1结合不同的表位。下文表1中概述了G3表位定位的细节。

使用所述方法还对先前已证实为非阻断性的测试抗体G5进行了分析。显示G5与人P-选择素结合，而与小鼠P-选择素不结合。G5与SEQ ID NO：3和贯穿EGF结构域并且包括CR1到N₁₈₇的第一部分的SEQ ID NO：10结合，但是G5与贯穿到S₁₂₈的SEQ ID NO：9不结合。这些结果表明抗体G5结合CR1的第一部分，并且至少需要氨基酸R₁₂₈到N₁₇₈。

表1.各抗体(G1、G3、G4、G5、hSel001)与人和小鼠P-选择素及其嵌合构建体的结合结果

¹根据FACS，²根据一步BIACORE，³根据二步BIACORE，^W弱结合

一步表面等离子共振(BLACORE)

为了进一步研究A簇结构域(氨基酸4-23)对G1抗体与P-选择素结合的重要性，将单个或多个小鼠氨基酸***到人P-选择素序列中制备多个嵌合构建体，并使用本文所述的表面等离子共振(“一步”BIACORE)法对其结合进行分析。一步BIACORE结合的结果见表1。G1测试抗体被捕获到BIACORE芯片上，并将各嵌合体的结合测定为共振单元。图2示出了代表性的感应图，其中显示了G1与人P-选择素构建体(SEQ ID NO：1)、带有人A簇的小鼠P-选择素构建体(SEQ ID NO：4)和小鼠P-选择素构建体(SEQ ID NO：2)的结合。使用所述方法，证实了G1与人P-选择素结合，并且与SEQ ID NO：4(其中人氨基酸被替换到小鼠P-选择素的A簇中)结合，但与小鼠P-选择素(SEQ ID NO：2)不结合。这些结果证明所述方法与FACS的结果一致。

小鼠P-选择素(SEQ ID NO：2)在位置4具有推定的糖基化位点(N)，而人P-选择素(SEQ ID NO：1)则没有。为了检验上述差别的重要性，用N(形成SEQ ID NO：7)或Q(形成SEQ ID NO：8)替换人P-选择素SEQ IDNO：1的位置4，并检测这些替换对G1抗体结合的影响。将天冬酰胺(N)***人P-选择素位置4会减少G1的结合，这表明人P-选择素中该位点的糖基化会干扰抗体结合。在该位置的谷氨酰胺替换则不会阻止G1结合。

为了进一步鉴定A簇中对G1抗体结合最佳或必要的氨基酸位置，制备了小鼠序列氨基酸在人P-选择素(SEQ ID NO：1)中的单氨基酸替换，并使用本文所述的一步BIACORE法对产生的嵌合体与G1的结合进行检测(表1)。经检测的嵌合体(在括弧中标出具体的替换)是SEQ ID NO：7(H₄N)；SEQ ID NO：12(I₁₄N)；SEQ ID NO：13(K₁₇V)；SEQ ID NO：14(Y₁₈F)；SEQ ID NO：15(Q₂₀R)；SEQ ID NO：16(N₂₁R)；SEQ ID NO：17(R₂₂H)以及SEQ ID NO：18(Y₂₃F)。G1抗体与SEQ ID NO：14、15和18结合，而与SEQ ID NO：12、13和17不结合，并且与SEQ ID NO：7和SEQID NO：16弱结合。上述结果表明氨基酸位置4、14、17、21和22各自是G1结合分别需要的必需位置。在一个优选的实施方案中，这些氨基酸分别是H₄、I₁₄、K₁₇、N₂₁和R₂₂。

为了证实G1的人源化形式(hSel001)保持与亲本抗体相同的表位特异性，使用所述方法检测hSel001与SEQ ID NO：1、2和20的结合。hSel001的结合模式与G1的相同，表明在人源化过程中表位特异性得到保留。

两步表面等离子共振(BIACORE)

为了评价G1、G3、G4和G5(G5是非阻断性的)与其他嵌合体的结合，使用本文所描述的两步表面等离子共振(“两步”BIACORE)分析。测试抗体的“两步”分析结果参见表1和图2。使用所述方法，所研究的测试抗体均不与小鼠P-选择素结合，而与人P-选择素结合，表明其对人P-选择素具有特异性。G1、G3、G4和G5测试抗体均与SEQ ID NO：10结合，表明它们均与经过人P-选择素的凝集素结构域和EGF结构域的贯穿N末端的区域结合。G5非阻断性抗体与SEQ ID NO：9不结合，而与SEQ IDNO：10结合，表明G5与CR1结构域结合。

使用所述方法的进一步分析显示G3与SEQ ID NO：23(其在C1、C2、C3、CR1和CR2簇中***有小鼠氨基酸)和SEQ ID NO：24(其在C1、C2和C3中有小鼠氨基酸)均不结合。G3与在C簇中含有小鼠序列的其它嵌合体，即SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，也不结合。这些结果表明阻断性G3抗体需要C簇进行结合，并证明了通过蛋白折叠相互靠近的氨基酸构象簇可作为抗P-选择素抗体的结合结构域(构象表位)的这一新发现。所述方法还证实G3能阻断PSGL-1与P-选择素的结合，并因此具有功能阻断性质(图3)。然而，所述方法还证明G3与P-选择素/PSGL-1复合物不结合，也不能使其解离(逆转)(图4)，因此不具有本发明优选抗体的双功能性质。

通过形成人/小鼠杂合A簇对有助于G1和G4与P-选择素结合的氨基酸位置进行鉴定。所述杂合A簇嵌合体(SEQ ID NO：20)在位置4、14、17、21和22上含有人P-选择素氨基酸(分别是H、I、K、N和R)，在位置18、20和23上含有小鼠P-选择素氨基酸(分别是Y、Q和Y)。如表1中所指出的，G1和G4均与SEQ ID NO：20结合。所述结果与先前的资料一起考虑时，表明氨基酸位置4、14、17、21和22构成了各自对G1、G4和G1的人源化形式(hSel001)与P-选择素的最佳结合必需的位置。所述结果构成这一新发现：包括G1、G4和hSel001的抗体组结合相同或类似表位，并且发现所述表位位于A簇的螺旋结构，其在先前针对P-选择素鉴定为位于凝集素-配体结合结构域接触残基的远端(71)。在一个优选的实施方案中，位置4、14、17、21和22的氨基酸分别是H、I、K、N和R。所述表位的3-D分析显示为刚性螺旋结构，其中所需氨基酸位于螺旋相同面的位点，因此A簇被称作含有构象表位(图5)。图3和4所显示的BIACORE分析证明G1、G4和hSel001可以阻断P-选择素和PSGL-1结合并使其结合解离，因此，在此所描述的表位与该抗体组的结合具有本发明优选实施方案的双功能性质。

所述结果表明与位于SEQ ID NO：1氨基酸1-35内(更优选地位于SEQID NO：1氨基酸4-23内)的在人P-选择素凝集素-配体结合结构域远端的构象表位结合的抗体具有独特的双功能性质。没有为理论所束缚，认为与该表位结合的抗体通过促成施加到凝集素-配体结合界面的别构力发挥作用，以诱导使P-选择素与PSGL-1结合解离的构象改变。因此，G1能够结合A簇的远端表位，并通过结合和破坏P-选择素凝集素-配体结合位点的分子相互作用来阻断和使复合物解离。与之相反，与P-选择素凝集素-配体结合结构域中的表位结合的抗体，例如G3，能够通过别构位阻(hindrance)阻断P-选择素与PSGL-1的结合，但是由于该抗体在C簇的构象表位被配体占用时不能与其结合，因此不能使P-选择素/PSGL-1复合物解离。测试抗体G5与P-选择素CR1簇结合，证明是非阻断性的(图3)。

总之，与P-选择素结合的抗体特征在于具有三个可能的关于P-选择素和其配体PSGL-1相互作用的活性。

首先，P-选择素抗体能结合P-选择素，但不能干扰PSGL-1与P-选择素的结合(“非阻断性”)。例如，在本文所显示的，抗体G5结合氨基酸157-164，并且需要CR1的R₁₅₇、E₁₆₁、L₁₆₂、E₁₆₃和L₁₆₄参与结合，但是所述结合不阻断P-选择素与PSGL-1的结合。

第二，P-选择素抗体能结合P-选择素，并干扰PSGL-1与P-选择素的结合(“功能阻断性”)，但是不能结合或使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。例如，本文所描述的结果显示抗体G3结合P-选择素中贯穿凝集素-配体结合结构域的不同部分的构象簇。G3结合C簇并需要C1氨基酸Y₄₄、Y₄₅、S₄₆以及C2氨基酸P₉₈和C3氨基酸H₁₁₄，因此需要构象表位。所述抗体阻断P-选择素和PSGL-1之间的相互作用，但不能结合或使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。

第三，我们已经发现具有特定特异性的能够结合P-选择素的P-选择素抗体，其不仅阻断PSGL-1与P-选择素的结合(功能阻断性抗体)，而且还能使形成的P-选择素/PSGL-1结合逆转(解离性结合)。所述抗体在本文中称作“双功能”抗体。本文所公开的结果证明，例如，G1结合A簇中的构象表位，并且包含氨基酸位置4、14、17、21和22的构象表位是结合所必需的，优选地，其中所述氨基酸分别是H、I、K、N和R。如本文其它地方所讨论的，用相应的“小鼠”氨基酸(N、N、V、R和H)分别替换上述任一位置的“人”氨基酸((H、I、K、N和R)，会导致消除本文所述的双功能抗体的结合。

在本发明另一个实施方案中，检测使用常规杂交瘤方法制备的先前未经表征的小鼠单克隆抗P-选择素抗体克隆，称为G4，并使用本文所述方法对其与A簇构象表位的结合以及双功能能力进行检测。检测G4与人/小鼠嵌合体SEQ ID NO.：1-4、7-10、19和20的结合。显示G4与SEQ IDNO：20结合，其具有针对G1所描述的相似的结合特异性(参见表1)。还证明G4阻断P-选择素与PSGL-1的结合(图3)，并使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离(图4)，因此G4具有P-选择素双功能抗体的特征，其与P-选择素凝集素-配体结合结构域远端的表位(A簇中)结合，并阻断P-选择素与PSGL-1的结合并使其解离。因此，G1和G4抗体均与A簇中的表位结合，均证明具有双功能性质。所述结果还证明，将A簇或其特异结合位置或氨基酸用作表位，可以用于筛选具有双功能能力的抗P-选择素抗体。所述双功能抗体具有独特的治疗应用性质，其中可以用于处理急性或慢性状况下P-选择素介导的粘附和/或进行中的P-选择素介导的粘附的启动。使用本文所描述的方法，可以鉴定其它具有双功能性质的抗体，其采用了使用A簇表位或其特异位置或氨基酸的筛选方法。

使用本文所述的筛选方法，还可以筛选称为hSel001的人源化IgG2抗P-选择素抗体(人源化P-选择素结合抗体，含有移植到人骨架区的小鼠抗体G1的CDR，如在公开WO2008/069999中先前所表征的)，其不具有效应子功能。表1中的概要数据显示hSel001抗体与G1抗体结合相同的嵌合体(SEQ ID NO：1和20)。hSel001与本文所描述的位于A簇的构象表位特异结合。结果显示抗体hSel001具有双功能性质，其不仅能够阻断P-选择素与PSGL-1的结合(图3)，还使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离(图4)。因此，hSel001是本发明所涵盖的另一个可选择的抗体，其可以用于本文所述的炎症和血栓疾病的治疗，其阻断P-选择素与PSGL-1的结合，并促使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。

利用人嗜中性粒细胞的流动下基于细胞的体外滚动分析

为了进一步评价抗体G1、G4和hSel001的阻断和解离性质，进行基于细胞的体外滚动分析，使用新鲜分离的人嗜中性粒细胞并以1.0dyn/cm²的流速将其引入低和高水平细胞膜P-选择素包被的流动室。低密度P-选择素以0.25μg/ml包被，高密度P-选择素以2μg/ml包被。使用I¹²⁵标记的单克隆抗体G1确定位点密度分别是50位点/mm²(低)和380位点/mm²(高)。在低密度P-选择素上，嗜中性粒细胞以5μm/s或6.5μm/s的平均速度滚动。在高密度P-选择素上，嗜中性粒细胞以1μm/s的平均速度滚动。通过流动的缓冲液将嗜中性粒细胞引入，并使其开始滚动和粘连。一旦达到平衡，通过流动的不含细胞的缓冲液将测试抗体(G1、G3、G4和hSel001)引入。在抗体到达流动室之前有大约1分钟间隔的死体积。1分钟间隔之后，对仍然结合的细胞进行计数，并表示为结合细胞％。通过视频显微镜记录约0-20分钟的结果，运行后对数据进行分析。

图6的图(A)和(C)的结果显示嗜中性粒细胞在低密度P-选择素上以较高速度滚动。因此，当P-选择素/PSGL-1复合物由于凝集素/配体结合的正常结合/解离(on/off)动力学而释放时，嗜中性粒细胞以更快速度流动较远距离到达下一个P-选择素结合位点。由于复合物释放，先前占用的P-选择素可以被抗P-选择素抗体结合。因此，全部四个抗体G1、G3、G4和hSel001在1-4分钟的过程期间均显示有等同的阻断功能。

图6的图(B)和(D)在高密度的P-选择素上的结果显示，由于存在更多个P-选择素结合位点，嗜中性粒细胞滚动更慢(1μm/s)。在所述密度下，许多嗜中性粒细胞在P-选择素上停止滚动。在这些条件下，小鼠抗体G1和G4以及人源化抗体hSel001均能够通过在1-8分钟里使P-选择素/PSGL-1复合物立即解离来释放滚动和粘连的嗜中性粒细胞。相反地，G3抗P-选择素抗体需要最多达16-20分钟阻断滚动的嗜中性粒细胞。这表明G3抗体仅能结合未占用的P-选择素位点，并因此阻断P-选择素/PSGL-1复合物，而不能结合预先形成的复合物并使其解离。流动条件下的细胞结合分析证实了本文先前所报道的BIACORE结果，其证明小鼠抗体G1和G4以及人源化抗体hSel001均具有双功能性质，阻断和使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。

与小鼠抗体G1相比，hSel001具有增强的结合

使用表面等离子共振(Biacore)体外分析和比较G1和hSel001与P-选择素的结合亲和力。将可溶性人P-选择素与Biacore CM5芯片共价结合，并将小鼠抗体G1和人源化抗体hSel001引入芯片，并对其进行独立检测。

为了进一步评价抗P-选择素抗体与P-选择素(抗原)的相互作用，使用表面等离子共振(SensiQ)进行结合动力学分析。通过SensiQ上的表面等离子共振对小鼠单克隆抗P-选择素抗体G1和人源化hSel001抗体进行分析。为了分析这两个抗体的结合动力学，通过共价结合重组G蛋白使传感器芯片功能化。通过20nM溶液注射1分钟将小鼠抗体G1导入并捕获在芯片上。通过10nM溶液注射1分钟将人源化抗体hSel001导入并捕获在类似功能化的另外的通道上。导入各浓度的可溶性人P-选择素(100nM-1.56nM)，并将结合测量作为共振单元(RU)。使用Qdat分析软件对每个结合数据进行分析。

图7显示在单个P-选择素浓度下两个抗体的结合结果。

根据上述结果，与小鼠抗体G1的K_d值(解离常数)为8.94nM相比，经测定hSel001的K_d值为5.89nM(表2)。这表示与小鼠单克隆抗P-选择素抗体G1相比，人源化抗P-选择素抗体hSel001的结合亲和力提高了34％。此外，hSel001的K_a值(结合常数)比G1高64.7％，意味着hSel001与P-选择素的结合更快。这些结果均表明与G1相比，人源化hSel001抗体具有提高的K_d值(亲和力)和K_a值(起始结合速率)。

通过上述任意方法所提供的本发明抗体优选地用于制造药物组合物，其用于病理状况的治疗，其中所述治疗包括施用药物组合物以减轻、逆转或抑制炎症反应、血栓形成或其他状况。

本发明的一个重要目的是将抗体或所述抗体的功能活性片段或变体用于制造药物组合物及其在预防和/或治疗炎症反应或疾病或血栓形成中的应用，例如但不限于本文中所描述的那些。

例如，本发明尤其涉及，但不限于将本文所描述和鉴定的这些双功能抗P-选择素抗体或抗体片段用于治疗涉及血小板、镰状红细胞、白细胞、淋巴细胞和/或内皮细胞粘附的灵长类动物(包括人)炎症、血栓或其他状况或疾病，其中所述状况或疾病包括或相关于(但不限于)以下至少一种：与镰状细胞血管闭塞性疼痛危象、炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠炎)、关节炎(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、银屑病、皮炎、败血症、肾炎、红斑狼疮、硬皮病、鼻炎、过敏反应、糖尿病、多发性硬化、动脉粥样硬化、血栓形成、肿瘤转移、***反应、甲状腺炎、缺血再灌注损伤(例如，由于心肌梗塞、中风或器官移植)和大面积创伤相关的状况、或慢性炎症例如IV型迟发型超敏反应(如结核杆菌感染相关)、或全身炎症反应综合症、或多器官衰竭。本文所使用的术语“灵长类动物”是指人、猴，包括狒狒和食蟹猴以及猿类，后者包括例如黑猩猩、大猩猩、长臂猿和红毛猩猩(orangutans)。使用本文所描述的抗体和组合物还可以治疗在此没有列出的但涉及炎症或血栓状况或疾病的其它病理状况。

在根据本发明构思的药剂的药物组合物中，所述抗体可以采用配制药物组合物的任何已经建立的方法进行配制，例如在最新版雷明登氏药学全书(Remington′s Pharmaceutical Sciences)中或本文其它地方所描述的方法。所述组合物通常可以采用适合局部或全身注射或输液的形式，并且因此用无菌水或等渗盐或葡萄糖溶液配制。通过本领域公知的常规灭菌技术对所述组合物进行灭菌。所产生的水溶液可以包装供使用，或在无菌条件下过滤并冻干，在施用前，将冻干的配制物与无菌水溶液混合。由于需要近似生理条件，所述组合物可以含有药学上可接受的辅料，例如，缓冲试剂、张力调节剂(tonicity adjusting agents)等，如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。蛋白浓度可以在例如小于约0.01％到高达15-20％或更大(以重量计)之间变化。组合物的单位剂量可以含有例如约1μg到约1000mg的抗体或抗体片段。

本发明的抗体或抗体片段可以局部或通过注射施用。根据要治疗的特定状况和特定个体，医生会开出施用的剂量。根据主治医生确定的参数，可以小心地对剂量和频率进行改动和调节。优选的施用途径可以是口服、通过吸入、皮下、静脉内、肌内、气管内、膀胱内或腹膜内注射，例如，以每kg体重0.01-1000mg，尤其是0.1mg-100mg，特别是1-10mg的范围可以在每24-48小时或每周、每14天、每4周施用。可以通过导管或以单个药丸形式连续施用所述剂量。本发明抗体施用的有效剂量可以是例如，但不限于每kg体重1ng/kg-1μg/kg、0.01μg/kg-50μg/kg、0.1μg/kg-1μg/kg、1μg/kg-5μg/kg、5μg/kg-10μg/kg、10μg/kg-50μg/kg、50μg/kg-100μg/kg、100mg/kg-1mg/kg、1mg/kg-10mg/kg或10mg/kg-100mg/kg的范围。

本发明中所使用的含有本文所述抗体的药物组合物可以另外添加医生根据要治疗的特定状况和特定个体常规开具的其它治疗化合物，例如抗炎症药物，其中所述药物由医生根据要治疗的特定状况和特定个体开具。

根据本文其它地方所述的，P-选择素/PSGL-1的结合现象在以下方面有着功能意义：镰状红细胞、内皮细胞白细胞和血小板相互作用，和/或微泡粘附，白细胞滚动、募集、聚集；白细胞分泌细胞因子；促进凝固作用；以及炎症、血栓形成、凝固作用、免疫反应和信号传导的其它方面，所述其他方面包括但不限于镰状细胞血管闭塞性疼痛危象、炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎和肠炎)、关节炎(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎和牛皮癣关节炎)、移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、银屑病、皮炎、败血症、肾炎、红斑狼疮、硬皮病、鼻炎、过敏反应、糖尿病、多发性硬化、动脉粥样硬化、血栓形成、肿瘤转移、***反应、甲状腺炎、缺血再灌注损伤(例如，由于心肌梗塞、中风或器官移植)和大面积创伤相关的状况、或慢性炎症例如IV型迟发型超敏反应(如结核杆菌感染相关)、或全身炎症反应综合症、或多器官衰竭。例如，本文所描述的P-选择素的中和抗体(或其片段)会在体内或体外抑制患者中一个或多个由P-选择素/PSGL-1受体结合(或在镰状红细胞中，P-选择素/PSGL-1样受体结合)介导的这些活性。因此，本文所描述的利用中和抗体(或其片段)抑制P-选择素/PSGL-1的结合，对治疗患者的各种状况和疾病是有用的，所述状况和疾病包括但不限于本文所描述的那些。

本文所描述的P-选择素特异抗体或结合片段可以与其它分子连接。例如，抗体可以与另一种肽或蛋白、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞生长抑制剂连接。可以通过化学交联或通过重组方法共价连接所述抗体。所述抗体还可以根据美国专利4,640,835、4,496,689、4,301，144、4,670,417、4,791，192或4，179,337中所述方式与多种非蛋白质多聚体中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。例如，通过与多聚体共价结合可以对所述抗体进行化学修饰，以提高其稳定性或半衰期。美国专利4,766,106、4，179,337、4,495,285和4,609,546中还展示了示例性的多聚体以及连接所述多聚体的方法。

所述抗体(或其片段)还可以带有可以检测的标记。可以检测的标记是由于其化学性质提供使得可以检测分子相互作用的可分析检测信号的一种分子。如果与可以被直接(例如，以生色团、荧光基团或放射性同位素的方式)或间接(例如，以催化反应产生有色、发光或荧光产物的方式)检测的分子共价或非共价结合，蛋白包括抗体则具有可检测的标记。可以检测的标记包括放射性标记(例如131I或99Tc)、重金属或荧光底物(例如铕)，例如其也可以使用常规化学与所述抗体连接。可以检测的标记还包括酶标记，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可以检测的标记进一步包括化学部分，例如生物素，可以通过与特定关联的可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)结合对其进行检测。

本发明还涉及筛选抗P-选择素抗体和其结合片段的方法，其阻断P-选择素/PSGL-1结合和/或使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离。

如上所述的，本发明涉及抗P-选择素抗体、产生所述抗P-选择素抗体的宿主细胞、含有编码所述抗P-选择素抗体的DNA的载体、鉴定阻断P-选择素/PSGL-1结合并在另一个实施方案中还使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离而具有“双功能”的抗P-选择素抗体的表达和筛选方法。因此，在一个实施方案中，本发明涉及鉴定特异结合人P-选择素(SEQID NO：1)氨基酸1-35中构象表位、更优选地氨基酸4-23中的构象表位(例如本文所述的构象表位)的抗P-选择素抗体的方法，所述抗体阻断PSGL-1或其模拟物与P-选择素结合，并且可使所述结合逆转，因此表现出阻断由P-选择素/PSGL-1结合引起的选择素介导的粘附和使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的双功能。

优选实施方案中的筛选方法包括基于流体的和/或基于基底的体外分析，其可以用于鉴定抑制或消除P-选择素/PSGL-1结合、优选地还使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的抗P-选择素抗体或其片段。可以通过一系列分析就双功能能力对测试抗体进行筛选，所述分析例如，但不限于本文所描述的，其鉴定与P-选择素氨基酸1-35(更优选地氨基酸4-23)中的构象表位结合并阻断PSGL-1配体与P-选择素结合、并且优选地使形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的那些抗体。到目前为止，还没有能阻断PSGL-1与P-选择素结合并使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的抗P-选择素抗体。在本文中使用时，术语“测试抗体”是指完整的抗体或抗体片段。测试抗体可以是文库(例如噬菌体、酵母或细菌)成员或文库中的抗体片段。通过将与非所需表位结合的所有成员排除可以减少文库。

在筛选方法的第一步，例如，分析抗P-选择素测试抗体阻断PSGL-1与P-选择素结合的能力。筛选出阻断PSGL-1与P-选择素结合的测试抗体，以确定其使预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的能力。经鉴定具有阻断PSGL-1与P-选择素结合、并使P-选择素/PSGL-1复合物解离双功能的测试抗体，特别构成本发明构思的优选实施方案，其可以用于本发明构思的方法。所述分析基于流体的实施方案的实例包括，但不限于(1)采用白细胞或HL60/活化血小板的基于细胞的FACS分析，其检测已暴露于或还未暴露于能结合P-选择素的抗体(例如hSel001)或测试抗体的细胞聚集体，以证明PSGL-l/P-选择素复合物的解离，(2)基于液体的分析，其以已暴露于或还未暴露于能结合P-选择素的抗体(例如hSel001)或测试抗体的P-选择素/GSP-6-链霉亲和素-生物素复合物为基础，并采用SEC(分子排阻色谱)进行检测，以及(3)在基于液体的分析中利用AlphaLisa微球作为基底。

在所述方法的一个实施方案中，首先通过筛选分析对阻断PSGL-1与P-选择素结合的测试抗体进行鉴定。例如，在筛选方法的一个优选实施方案中，通过本领域普通技术人员公知的方法提供了PSGL-1或合成的PSGL-1模拟物(例如GSP-6)、或能够结合P-选择素的PSGL-1末端表位部分(以及任选地与例如BIACORE芯片的支持基底结合)。然后将PSGL-1(或PSGL-1模拟物)(其可以与基底结合)暴露于抗P-选择素测试抗体/P-选择素复合物。接着对该复合物与PSGL-1基底的结合程度进行评价。如果测试抗体/p-选择素复合物与PSGL-1不结合，所述测试抗体则被鉴定为“功能阻断性”抗体。在一个实施方案中，例如，GSP-6或PSGL-1模拟物与生物素结合。GSP-6/模拟物-生物素复合物本身可以与例如基底上包被的链霉亲和素结合。

在筛选方法的另一个实施方案中，提供了P-选择素或其保留完整构象表位的部分，如上所述，其任选地结合支持基底。例如，保留构象表位的P-选择素部分包括，但不限于含有P-选择素凝集素结构域和EGF结合结构域的序列(例如SEQ ID NO：1的氨基酸1-153)。在该实施方案中，将P-选择素或其带有构象表位的部分暴露于测试抗体，其结合形成P-选择素-抗体复合物。然后将PSGL-1或其高分子量模拟物(例如GSP-6/生物素/亲和素复合物)暴露于P-选择素/测试抗体复合物，并评价PSGL-1(或模拟物)与之的结合程度。阻止或抑制PSGL-1与P-选择素/抗体复合物结合的抗体被鉴定为“功能阻断性”抗体。

在筛选方法的另一个实施方案中，如上文所述的，将PSGL-1或其模拟物结合到支持基底(例如微球或BIACORE芯片)。然后将P-选择素加到PSGL-1/基底上以形成P-选择素/PSGL-1(或模拟物)复合物。接着加入测试抗体，由于P-选择素被解离掉，该复合物的解离被检测为质量的减少或共振单元(RU)。诱导P-选择素/PSGL-1复合物解离的功能阻断性抗P-选择素抗体称作双功能抗P-选择素抗体。

在所述筛选方法的一个可选择的实施方案中，P-选择素或含有构象表位的P-选择素部分而非PSGL-1可以与支持基底结合。然后将PSGL-1或其高分子量模拟物(例如GSP-6/生物素/亲和素复合物)暴露于支持基底上的P-选择素，并使得形成PSGL-1/p-选择素复合物。接着将PSGL-1/P-选择素复合物暴露于功能阻断性抗P-选择素抗体，并使用例如如本文其它地方所描述的BIACORE方法对该复合物的解离进行评价。

在所述分析的又一个实施方案中，抗P-选择素抗体本身与支持基底结合，将P-选择素/PSGL-1复合物暴露于它，并如上述对其解离进行检测。

尽管已经详细描述了本发明构思及其益处，但是应当了解的是，在不脱离本文所限定的本发明构思的精神和范围前提下可以进行多种变化、替换和改变。此外，无意将本申请范围局限于本说明书中所描述的过程、产物制造、物质组合物、方式、方法和步骤的特定实施方式。本领域普通技术人员根据本发明公开内容容易理解，现有的或以后将出现的与本文所描述的相应实施方案有基本相同功能或实现基本相同结果的过程、产物制造、物质组合物、方式、方法或步骤都可以根据本发明构思加以利用。因此，在此描述的本发明意欲将上述过程、产物制造、物质组合物、方式、方法或步骤均包括在其范围内。

以引用的方式将本文中所引用的每篇参考文献、专利或出版物的全部内容明确并入本文中，包括但不限于U.S.申请12/974,539、12/974,739、12/516,987以及WO2008/069999。

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Claims (78)

1.一种分离的抗体或其结合片段，其特异结合P-选择素的构象表位，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸位置1-35内。

2.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸位置4-23内。

3.根据权利要求2所述的分离的抗体或其结合片段，其中所述构象表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22。

4.根据权利要求3所述的分离的抗体或其结合片段，其中氨基酸位置4、14、17、21和22的氨基酸分别是H、I、K、N和R。

5.根据权利要求4所述的分离的抗体或其结合片段，其中当氨基酸位置4、14、17、21或22中任一或多个分别替换为N、N、V、R或H时，所述结合被消除。

6.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其含有阻断P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)结合P-选择素的能力。

7.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其进一步含有使预先形成的P-选择素-PSGL-1复合物解离的能力。

8.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其含有通过抑制活化的内皮细胞结合白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板来阻断P-选择素功能的能力。

9.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其含有通过抑制活化的血小板结合白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板来阻断P-选择素功能的能力。

10.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其含有使活化的内皮细胞与白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板之间的细胞-细胞结合解离的能力。

11.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其含有使活化的血小板与白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板之间的细胞-细胞结合解离的能力。

12.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其片段是单克隆的。

13.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其中所述抗体或其片段是嵌合的、人的或人源化的。

14.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM组成的类别。

15.根据权利要求14所述的分离的抗体或其结合片段，其中所述分离的抗体或其结合片段是选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG2/G4嵌合体组成的同种型的IgG。

16.根据权利要求1所述的结合片段，其包括Fab、Fab’、F(ab)2或scFv片段中的至少一个。

17.根据权利要求1所述的分离的抗体或其结合片段，其以K_d≤1000nM、K_d≤500nM、K_d≤100nM、K_d≤50nM、K_d≤25nM、K_d≤10nM、K_d≤5nM、K_d≤1nM或K_d≤0.1nM与构象表位结合。

18.根据权利要求1所述的分离的抗体，其被称为从ATCC保藏号为PTA12154的杂交瘤来源的单克隆抗体，或者包含所述单克隆抗体的CDR的人源化抗体。

19.包含权利要求1所述分离的抗体或其结合片段的组合物，其配置在药学上可接受的递送体、载体或稀释剂中。

20.一种细胞系，其表达权利要求1所述的抗体或结合片段。

21.根据权利要求20所述的细胞系，其包括ATCC保藏号为PTA12154的杂交瘤。

22.一种分离的单克隆抗体，其由权利要求21的杂交瘤产生。

23.根据权利要求22所述的分离的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体被称为G4。

24.一种分离的人源化抗体，其含有由权利要求21的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR。

25.一种治疗或抑制需要所述治疗的受试者中的炎症或血栓状况或疾病的方法，其包括：向所述受试者施用治疗有效量的抗体或其结合片段，所述抗体或其结合片段与SEQ ID NO：1的氨基酸位置1-35内的P-选择素构象表位特异结合。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸位置4-23内。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述构象表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22。

28.根据权利要求27所述的方法，其中氨基酸位置4、14、17、21和22的氨基酸分别是H、I、K、N和R。

29.根据权利要求28所述的方法，其中当氨基酸位置4、14、17、21或22的任一或多个分别替换为N、N、V、R或H时，所述结合被消除。

30.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其结合片段含有阻断P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)结合P-选择素的能力。

31.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其结合片段进一步含有使预先形成的P-选择素-PSGL-1复合物解离的能力。

32.根据权利要求25所述的方法，其中权利要求1所述的抗体或其结合片段含有使活化的内皮细胞与白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板之间的细胞-细胞结合解离的能力。

33.根据权利要求25所述的方法，其中权利要求1所述的抗体或其结合片段含有使活化的血小板与白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板之间的细胞-细胞结合解离的能力。

34.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其结合片段含有通过抑制活化的内皮细胞结合白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板来阻断P-选择素功能的能力。

35.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其结合片段含有通过抑制活化的血小板结合白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板来阻断P-选择素功能的能力。

36.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其片段是单克隆的。

37.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其片段是嵌合的、人的或人源化的。

38.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其片段包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM组成的类别。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体或其结合片段是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG2/G4嵌合体。

40.根据权利要求25所述的方法，其中所述结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2或scFv片段中的至少一个。

41.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或其结合片段以K_d≤1000nM、K_d≤500nM、K_d≤100nM、K_d≤50nM、K_d≤25nM、K_d≤10nM、K_d≤5nM、K_d≤1nM或K_d≤0.1nM与所述构象表位结合。

42.根据权利要求25所述的方法，其中所述炎症、血栓状况或其它状况或疾病与下列至少一个或多个相关：血小板、镰状红细胞、白细胞、淋巴细胞或内皮细胞的粘附、血管闭塞性镰状细胞疼痛危象、血栓形成、动脉粥样硬化、肿瘤转移、***反应、甲状腺炎、银屑病、皮炎、肾炎、红斑狼疮、硬皮病、败血症、鼻炎、过敏反应、糖尿病、多发性硬化、移植排斥、移植物抗宿主病、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、炎性肠病、关节炎和缺血再灌注损伤、大面积创伤相关的状况、或慢性炎症、全身性炎性反应综合征和多器官衰竭。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述缺血再灌注损伤由心肌梗塞、中风和器官移植中至少一个引起。

44.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体经胃肠外、肌内、腹膜内、硬膜外或经口服、静脉内、皮下或以雾化形式施用给所述受试者。

45.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体或结合片段以1ng/kg到100mg/kg的用量施用给所述受试者。

46.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体是在本文中被称为G1、hSe1001、G4的单克隆抗体，或含有上述单克隆抗体CDR的人源化抗体。

47.一种阻断P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)与P-选择素的细胞-细胞结合的方法，其包括：将抗体或其结合片段施用于活化的血小板、白细胞、淋巴细胞和/或镰状红细胞，所述抗体或其结合片段与SEQ ID NO：1的氨基酸位置1-35内的P-选择素的构象表位特异结合。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体或其结合片段进一步含有使预先形成的P-选择素-PSGL-1复合物解离的能力。

49.根据权利要求47所述的方法，其中权利要求1所述的抗体或结合片段含有使活化的内皮细胞与白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板之间的细胞-细胞结合解离的能力。

50.根据权利要求47所述的方法，其中权利要求1所述的抗体或结合片段含有使活化的血小板与白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板之间的细胞-细胞结合解离的能力。

51.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体或其结合片段含有通过抑制活化的内皮细胞结合白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板来阻断P-选择素功能的能力。

52.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体或其结合片段含有通过抑制活化的血小板结合白细胞、淋巴细胞、镰状红细胞和/或血小板来阻断P-选择素功能的能力。

53.根据权利要求47所述的方法，其中所述抗体是在本文中被称为G1、hSe1001、G4的单克隆抗体，或含有所述单克隆抗体的CDR的人源化抗体。

54.一种筛选方法，包括：将P-选择素的构象表位暴露于能够结合该构象表位的测试抗体，形成表位-测试抗体复合物；将所述表位-测试抗体复合物暴露于能够结合P-选择素的PSGL-1或PSGL-1模拟物；当所述PSGL-1或PSGL-1模拟物不能结合所述表位-测试抗体复合物时，推断所述测试抗体阻断PSGL-1与P-选择素的结合。

55.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸1-35内。

56.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸4-23内。

57.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述构象表位包含SEQ IDNO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22。

58.根据权利要求57所述的筛选方法，其中所述构象表位进一步包含SEQID NO：1的氨基酸位置20和23。

59.根据权利要求57所述的筛选方法，其中SEQ ID NO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22的氨基酸分别是H、I、K、N和R。

60.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述构象表位被提供为结合至基底的完整P-选择素蛋白的组分。

61.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述构象表位被提供为结合至基底的部分P-选择素蛋白的组分。

62.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述构象表位与支持基底结合。

63.根据权利要求54所述的筛选方法，其中所述PSGL-1或PSGL-1模拟物与支持基底结合。

64.一种表征抗P-选择素抗体的方法，包括：提供预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物，所述复合物含有与P-选择素蛋白或其片段结合的完整PSGL-1蛋白、PSGL-1片段或PSGL-1模拟物，所述P-选择素蛋白或其片段含有功能阻断性抗P-选择素抗体能够结合的构象表位；将所述预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物在适合所述抗P-选择素抗体结合所述构象表位的条件下暴露于所述抗P-选择素抗体；对所述抗P-选择素抗体使所述预先形成的P-选择素/PSGL-1复合物解离的能力进行表征。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸1-35内。

66.根据权利要求64所述的方法，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸4-23内。

67.根据权利要求64所述的方法，其中所述构象表位包含SEQ ID NO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22。

68.根据权利要求67所述的方法，其中氨基酸位置4、14、17、21和22的氨基酸分别是H、I、K、N和R。

69.根据权利要求67所述的方法，其中所述构象表位进一步包含SEQ IDNO：1的氨基酸位置20和23。

70.根据权利要求64所述的方法，其中含有所述构象表位的所述P选择素蛋白或其片段与支持基底结合。

71.根据权利要求64所述的方法，其中所述完整PSGL-1蛋白、其PSGL-1片段或PSGL-1模拟物与支持基底结合。

72.一种测试基底，其包括支持基底和与所述支持基物结合的构象表位，功能阻断性抗P-选择素抗体能够结合所述构象表位，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸1-35内。

73.根据权利要求72所述的测试基底，其中所述构象表位在SEQ ID NO：1的氨基酸4-23内。

74.根据权利要求72所述的测试基底，其中所述构象表位包含SEQ IDNO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22。

75.根据权利要求72所述的测试基底，其中所述构象表位进一步包含SEQID NO：1的氨基酸位置20和23。

76.根据权利要求72所述的测试基底，其中SEQ ID NO：1的氨基酸位置4、14、17、21和22的氨基酸分别是H、I、K、N和R。

77.根据权利要求72所述的测试基底，其中所述构象表位被提供为结合所述支持基底的完整P-选择素蛋白的组分。

78.根据权利要求72所述的测试基底，其中所述构象表位被提供为结合所述支持基底的部分P-选择素蛋白的组分。

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