CN103869065B

CN103869065B - 一种黄曲霉毒素m1纳米抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103869065B
Application number: CN201410121748.7A
Authority: CN
Inventors: 李培武; 张奇; 何婷; 张兆威; 丁小霞
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-03-28
Filing date: 2014-03-28
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-03-28
Also published as: CN103869065A; US9435776B2; US20150276729A1

Abstract

本发明涉及黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用。本发明免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，所述黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC₅₀为0.208ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2交叉反应率分别为9.43%、5.93%、4.87%和6.17%；其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，编码基因序列如SEQIDNO:8所示，本发明黄曲霉毒素纳米抗体免疫亲和柱可用于净化与浓缩上机检测前样品提取液，且该免疫亲和柱可以多次重复使用。

Description

一种黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用。

背景技术

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的剧毒代谢产物，是迄今发现的最强致癌物质之一。黄曲霉毒素目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素B1（AFB₁）、B2（AFB₂）、G1(AFG₁)、G2(AFG₂)和 M1（AFM₁）等，其中AFB₁的毒性最强。黄曲霉毒素M1（AFM₁）是AFB1的羟基化代谢产物，哺乳动物摄入AFB1污染的饲料后，在体内经羟基化会分泌于乳汁当中。通常，当动物摄入了AFB1污染的食物后，黄曲霉毒素M1的排出量为AFB1摄入量的1%～3%。大量的研究者对黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性进行了深入的研究，研究结果也促使国际癌症研究机构将黄曲霉毒素M1的致癌等级由二类致癌物质变为一类致癌物质。黄曲霉毒素M1性质稳定，即使经过巴氏杀菌，也几乎完全不能被破坏。在许多乳制品中均含有黄曲霉毒素M1，由于乳制品是婴幼儿食物的主要来源，因此黄曲霉毒素M1污染问题引起了世界各国的广泛关注，并对黄曲霉毒素M1进行了严格的限量。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，因此加强乳及乳制品中黄曲霉毒素M1的检测、特别是速测，及时了解和掌握乳及乳制品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是较早用于检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，该法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法主要包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，这些方法灵敏度高，准确性好，然而要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，传统的样品前处理技术，如液-液萃取、固相萃取、固相微萃取等，前处理过程繁琐、特异性不强。因此，建立快捷有效的样品前处理技术已成为黄曲霉毒素检测分析中需解决的首要和瓶颈问题。免疫亲和柱是一种新型高效的样品前处理技术，基于抗原抗体间特异性的可逆结合来实现对复杂样品中目标物质的富集净化。免疫亲和柱与液相色谱分析、荧光速测仪以及ELISA法结合，可广泛应用于农产品及食品黄曲霉毒素检测中。

目前，黄曲霉毒素免疫亲和柱制备主要采用传统抗体（多克隆抗体或单克隆抗体）与琼脂糖凝胶、硅胶微球等偶联制备而成，由于传统抗体使用过程中活性退化较快，市场现有免疫亲和柱一直存在可重复使用次数偏少的技术难题。纳米抗体是在骆驼科动物体内天然存在的重链抗体，与传统的抗体相比，具有稳定性好、耐高温、耐酸碱、耐有机试剂等优点，可用于免疫亲和柱的制备中，延长亲和柱的货架期；此外，纳米抗体的生产采用基因工程手段，具有成本低、制备方便等优点，因此，纳米抗体在免疫亲和柱的制备中与常规抗体相比更具有优势。目前，尚未有黄曲霉毒素纳米抗体免疫吸附剂和免疫亲合柱的相关报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用。

为实现本发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂，其特征在于：该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体上偶联的黄曲霉毒素纳米抗体，所述黄曲霉毒素纳米抗体为黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因序列如SEQ ID NO:8所示。

按上述方案，所述黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2的三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。

按上述方案，所述固相载体为琼脂糖凝胶或硅胶微球。

上述黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：

所述固相载体选用硅胶微球时，制备方法为：称取1~5g硅胶微球，用纯水和pH为6.0的磷酸盐缓冲液交替冲洗，再量取5~25mL pH为6.0的磷酸盐缓冲液溶解硅胶微球，搅拌后使硅胶微球全部悬起，得到硅胶微球悬浮液；用1~5mL pH为6.0的磷酸盐缓冲液溶解2~10mg黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，然后逐滴加入到硅胶微球悬浮液中；最后称取70~350mg 碳二亚胺（EDC），快速加入到硅胶微球悬浮液中，4℃搅拌反应18~22h后，得到以硅胶微球为固相载体的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂；或者

所述固相载体选用琼脂糖凝胶时，制备方法为：称取0.3~1g 琼脂糖，用1mM HCl溶液反复冲洗，将琼脂糖溶于5~15mL偶联缓冲液中，再加入0.6~2mg黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，在室温下搅拌反应1~2h，得到琼脂糖凝胶溶液，将琼脂糖凝胶溶液中未与琼脂糖凝胶偶联的抗体溶液过滤后，用偶联缓冲液冲洗琼脂糖凝胶，再加入0.1M、pH8.0的Tris-HCl缓冲液，室温下反应2h，然后用0.1M、pH8.0的Tris-HCl缓冲液和0.1M、pH4.0的Tris-HCl缓冲液交替冲洗琼脂糖凝胶后，得到以琼脂糖凝胶为固相载体的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和吸附剂，所述偶联缓冲液为0.1MNaCO₃、0.5M NaCl、pH8.3。

装载有上述黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱。

上述黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的制备方法，具体包括如下步骤：首先将黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和吸附剂填充于固相萃取管中，然后加入pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液后自然沉淀，再用pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤后，保存于含0.02wt%叠氮钠的pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液中，得到黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱。

上述黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的应用，其特征在于，利用所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱对上机前的样品提取液进行净化与浓缩。具体操作为：首先将制备好的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱用纯水冲洗，然后加入样品提取液，最后用纯水淋洗，待液体流干后，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液即为净化与浓缩后的样品提取液，可直接用于上机检测。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明所述黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2对黄曲霉毒素B1的50%抑制浓度IC₅₀为0.208 ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2交叉反应率分别为9.43%、5.93%、4.87%和6.17%；制备得到的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的柱容量为500~600ng，对黄曲霉毒素M1的平均加标回收率为84~100wt%。

（2）本发明黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱具有稳定性好、耐高温、耐酸碱、耐有机试剂等优点，所述亲和柱的货架期长、且可以重复多次使用，可用于净化与浓缩上机检测前的样品提取液。

（3）本发明黄曲霉毒素M1纳米抗体是采用基因工程手段生产得到，具有成本低、制备方便等优点，因此由其制备得到的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱与常规抗体亲和柱相比更有优势。

具体实施方式

实施例1黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建与纳米抗体的制备

1. 动物免疫

购买2岁龄的雄性羊驼一只，免疫黄曲霉毒素M1完全抗原（AFM₁-BSA, Sigma公司）。将200μg黄曲霉毒素M1完全抗原与弗氏不完全佐剂乳化后，对羊驼进行皮下多点注射。间隔2周免疫一次，每次免疫后7-10天对羊驼进行静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，选取效价最高的一次免疫后，取血10mL，提取总RNA。

2.cDNA文库的构建

（1）提取总RNA：选取羊驼血清效价最高的一次免疫，免疫后7-10天，对羊驼进行静脉取血10mL，提取总RNA：采用Life Technology公司的LeukoLOCK总RNA分离试剂盒提取羊驼血液中的总RNA。

（2）合成cDNA：以步骤1获得的总RNA 为模板，oligo (dT) ₁₅为引物，按照Promega公司的反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA第一链，获得cDNA文库。

3.黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建

（1）以步骤2中合成的cDNA为模板，R1、F或R2、F为引物，进行PCR扩增得到羊驼重链抗体可变区基因，即VHH基因：取cDNA 2μl，10×PCR Buffer 5μl，MgSO₄（50mM）2μl，dNTP(10mmol/L) 1μl，F引物（10μmol/L)1μl，R1(或R2)引物(10μmol/L)1μl，DNA酶0.1μl，无菌纯水37.9μl至50μl，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应，反应条件为：94℃变性2min后；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸5min。

R1: 5’-CGG CGC ACC TGC GGC CGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG -3’

R2: 5’-CGG CGC ACC TGC GGC CGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGG -3’；

F: 5’-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’，其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E（his）同源的位点；以R1、F为引物进行4个PCR扩增反应，以R2、F为引物进行6个PCR扩增反应。PCR 产物经过0.7％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收450bp大小的DNA片段。

（2）pCANTAB 5E（his）载体构建：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI-F: 5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(Sfi I)；下游引物：p5E N-P-H-R: 5’- GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTTTTC-3’进行PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his(SfiI/PspoMI)粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到含有六聚组氨酸标签的pCANTAB 5E（his）载体。

（3）双酶切处理pCANTAB 5 E（his）：

Sfi I单酶切：

按照如下体系配制反应液：pCANTAB 5 E（his） vector 30μl

Sfi I 1μl

10×M Buffer 10μl

ddH₂O 补至总体系 100μl

50℃水浴2 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收。

Not I酶切：

按照如下体系配制反应液：

pCANTAB 5 E （his）Sfi I单酶切回收产物 30μl

Not I 1μl

10×H Buffer 10μl

ddH₂O 补至总体系 100μl

37℃水浴4 h 后用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收；

（4）VHH基因与双酶切处理的pCANTAB 5 E（his）载体的连接

按照如下体系进行In-Fusion连接：

Sfi I/Not I双酶切处理的pCANTAB 5 E （his）vector 120ng

VHH基因 40ng

5×In-Fusion buffer 2μl

In-Fusion Enzyme 1μl

ddH₂O补至总体系 10μl

37℃水浴15min后，放入50℃水浴15min，水浴后立即放在冰上5min, 加入40μl TE缓冲液，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒进行回收，-20℃保存待用。

（5）连接产物的电转化

将上述连接产物取 5μl加入到50μl E. coli TG1电转化感受态细胞中，混匀后，加入到预冷的 0.1 cm 电转化杯 (Bio-RAD) 中，冰上放置10min，然后放在Bio-rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8 kV，200 Ω，25 μF，电转化后立即在电转化杯中加入1 mL 2YT 液体培养基吹打后转移至一灭菌后的干净15 mL 摇菌管中，37℃缓慢振摇复苏1 h。取2μl菌液倍比稀释后涂布于LB 氨苄平板，37℃倒置过夜，第二天数菌落个数计算库容量。

（6）黄曲霉毒素纳米抗体基因库的拯救：共进行上述十次电转化，将复苏后的菌液全部转入200mL SB培养基中，于37℃ 250rpm振摇至OD₆₀₀值为0.5时，加入1mL，1×10¹²pfu的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置1h后，继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃ 10000rpm离心15min，将上清转移至无菌的离心瓶中，加入1/4体积的5x PEG/NaCl，于冰上静置2h后，4℃ 12000rpm离心20min，用10mL无菌的重悬溶液（含1×蛋白酶抑制剂，0.02% NaN₃和0.5% BSA的PBS缓冲液）溶解沉淀得到噬菌体拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库。

4.黄曲霉毒素M1纳米抗体的淘选

用AFM₁-BSA（1μg/孔）及3% 的BSA-PBS溶液（用作阴性对照）分别包被ELISA 板，4℃过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用3％脱脂奶粉封闭1 h；PBST洗板3 次，在包被有AFM₁-BSA的孔中加入上述拯救后的黄曲霉毒素纳米抗体基因库50 μl，37℃孵育1 h；PBST 洗板10次后，每孔加入100μl、100ng/mL AFM₁溶液，室温（20℃~30℃）震荡30min洗脱。将洗脱液转至包被有3%BSA-PBS溶液的孔中，37℃孵育1h（去除非特异性吸附）；孵育后，取上清侵染2mL生长至对数期的TG1菌液，37℃侵染20min，取1μl 、10μl 分别涂布LB氨苄平板上，并于37℃培养箱中静置过夜，次日数平板上的菌落数确定洗脱液中噬菌体滴度。另将上述剩余的被侵染后的TG1菌液转入6mLSB培养基中，加100mg/mL的氨苄青霉素1.5μl，37℃振摇1h，补加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，继续振摇1h后，加入1mL辅助噬菌体M13KO7（1×10¹²pfu/mL），37℃静置30min，转入100mL SB培养基，补加氨苄青霉素（100mg/mL）46μl，继续振摇2h后，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并于37℃振摇过夜。次日，将菌液于10000rpm 4℃离心15min，转移上清，并加入1/4体积PEG/NaCl溶液，于冰上孵育2h，12000rpm 4℃离心20min，用1%BSA-PBS溶液溶解沉淀，得到第一轮淘选扩增产物，并用于下一轮淘选。在随后几轮的淘选中，包被抗原AFM₁-BSA的浓度分别为0.5μg/孔、0.1μg/孔、0.05μg/孔，洗脱液分别为500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL的AFM₁溶液。

5.阳性克隆的鉴定：

经过4轮淘选后，取2μl洗脱液倍比稀释后侵染生长至对数期的TG1菌液，涂布LB氨苄平板上，37℃倒置过夜。次日，随机挑取30个克隆分别于3mL SB-氨苄培养基中，37℃震荡培养6-8h，至OD₆₀₀为0.6左右，加入30μl辅助噬菌体M13KO7（1×10¹²pfu/mL），37℃静置30min后继续振摇2h，加入卡那霉素至终浓度为70μg/mL，并震荡培养过夜；次日，将菌液于10000rpm 4℃离心15min后，得到菌液上清。

用包被液配制AFM₁-BSA至终浓度0.2μg/ml，包被96孔ELISA 板，每孔100μl，同时另取ELISA板，其中的32个孔用3%BSA包被，4℃包被过夜；次日，倾掉包被液后，PBST 洗板3 次，然后用3％脱脂奶粉-PBS封闭1 h；取AFM₁标准品储存液，用10%甲醇/PBS配制成100ng/mL、0ng/mL的工作液，分别加入到包被有AFM₁-BSA抗原的孔中，再每孔加入50μl上述菌液上清，每种工作液浓度重复3次；在包被有BSA的孔加入10%甲醇/PBS和50μl上述菌液上清作为对照，轻摇板子混匀后，置37℃温箱反应1 h；PBST 洗板10次后，每孔加入100 ul用PBS按1：5000比例稀释的HRP/ANTI-M13，37℃保温1 h；PBST 洗板6次，每孔加入100μl新鲜配制的 TMB 底物溶液，37℃保温15 min；加2mol/L H₂SO₄，每孔50μl中止反应，用酶标仪分别测定OD₄₅₀值；对BSA不吸附，对AFM₁-BSA有吸附，并且加入黄曲霉毒素后存在竞争的即为阳性噬菌体克隆，由此筛选得到吸光值和灵敏度均较高的孔，得到噬菌体展示的黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2。

采用间接竞争ELISA方法测定黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2的抗体特异性，具体用交叉反应率描述，测试方法如下：将AFM_1、AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂五种不同标准品储存液，用10%甲醇/PBS梯度稀释至十个不同的工作浓度，同等条件下采用间接竞争ELISA方法进行测定，依次绘制五种黄曲霉毒素的竞争ELISA曲线，求出各自抑制率为50%时的标准品浓度，用IC₅₀表示，并根据下述计算公式计算交叉反应率：交叉反应率（%）=（AFM₁IC₅₀/ 类似物IC₅₀）×100%，所述类似物为AFB_1、AFB₂、AFG₁或AFG₂，得到黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2对于对黄曲霉毒素M1的50%抑制浓度IC₅₀为0.208 ng/mL，与黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的交叉反应率分别为9.43%、5.93%、4.87%和6.17%。因此，黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2是一种抗黄曲霉毒素M1的特异性纳米抗体。经耐受性试验，黄曲霉毒素纳米抗体2014AFM-G2比常规鼠源与兔源抗体耐有机溶剂能力提高35%，耐高温能力提高45%，因此能有效降低检测时样品提取液中有机溶剂等其他成分的干扰，从而提高检测灵敏度。

同时将筛选到的含有黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2的克隆菌液送至上海桑尼科技有限公司进行测序分析，测序引物为噬菌体载体通用引物R1：5’-CCA TGA TTA CGC CAA GCT TTG GAG CC-3’。得到黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示，编码基因序列如SEQ ID NO:8所示，其中三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。

6.黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2的制备与纯化：

（1）获得能分泌黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2的TG1菌液，使用Qiagen的DNA小量提取试剂盒提取质粒，转化到HB2151感受态细胞中，并涂布到LB氨苄平板上；

（2）挑取含有黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2质粒的HB2151菌落于100mLSB氨苄液体培养基中，250 rpm，37℃培养至OD600＝0.5-0.8，加入200μl 0.5M IPTG溶液诱导过夜。

（3）4℃，10 000 rpm，冷冻离心15 min，无菌操作台中小心去除上清，菌体沉淀采用渗透休克法进行可溶性蛋白提取，得到上清蛋白。将上清蛋白过0.22μm滤膜后，用平衡缓冲液（50mM磷酸盐，300mM 氯化钠，20mM咪唑；pH 7.4）透析过夜。

（4）采用His60 镍柱（Clontech Technology）纯化抗体：首先用10倍柱体积的平衡缓冲液冲洗镍柱，将步骤（3）中透析后的上清蛋白上样His60 镍柱（Clontech Technology）进行抗体纯化，再用10倍柱体积淋洗缓冲液（50mM磷酸盐，300mM 氯化钠，40mM咪唑；pH 7.4）洗涤柱子，最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液（50mM磷酸盐，300mM 氯化钠，300mM咪唑；pH 7.4）洗脱抗体2014AFM-G2，收集洗脱液，装入透析袋，用0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析2-3天后浓缩，分装于-20℃保存备用。

实施例2：黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和吸附剂和免疫亲和柱的制备

本实施例免疫亲和吸附剂包括固相载体（硅胶微球）和与该固相载体偶联的黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，具体制备方法如下：

称取1g 丙烯酰胺硅胶微球，放入锥形瓶中，用纯水和pH为6.0的磷酸盐缓冲液交替冲洗微球；量取5mL pH为6.0的磷酸盐缓冲液溶解微球，得微球溶液，将微球溶液转移至搅拌杯中，开启搅拌器使微球全部悬起，用1mL pH为6.0的磷酸盐缓冲液溶解2mg黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，然后逐滴加入到上述微球溶液中，称取70mg EDC，迅速导入搅拌杯中，4℃搅拌反应18-22h后，得到黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和吸附剂。

黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的制备：将上述制备的免疫亲和吸附剂（0.2mL）填充于固相萃取管中，加入pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液后自然沉淀，再用pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤后，保存于含0.02wt%叠氮钠的pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液，即得到黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱，于4℃保存待用。

实施例3：黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和吸附剂和免疫亲和柱的制备

本实施例免疫亲和吸附剂包括固相载体（琼脂糖）和与该固相载体偶联的黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，具体制备方法如下：

称取0.3g 琼脂糖，放入锥形瓶中，用1mM HCl溶液反复冲洗15min以上，将琼脂糖溶于5mL偶联缓冲液中（0.1M的NaCO₃，0.5M NaCl，pH8.3），再加入0.6mg黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，在室温下以150rpm的速度搅拌反应1h，得到琼脂糖凝胶溶液，将琼脂糖凝胶溶液转移到砂氏漏斗中，使得未偶联的含抗体的溶液流出，然后用体积是琼脂糖凝胶溶液5倍的偶联缓冲液冲洗琼脂糖凝胶，再加入体积是琼脂糖凝胶溶液2倍的封闭缓冲液（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH8.0）室温反应2h，然后用高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH8.0）和低pH（0.1M Tris-HCl缓冲液，pH4.0）缓冲液交替冲洗凝胶三次后，得到黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和吸附剂。

实施例4：黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱柱容量的测定：

将实施例2或实施例3制备得到的免疫亲和柱用10mL纯水冲洗，将10mL 10%甲醇/PBS溶解的黄曲霉毒素M1标准品溶液（浓度为100ng/mL，黄曲霉毒素M1的含量总计为1mg）过柱，用10mL 纯水冲洗柱子去除未结合的黄曲霉毒素M1，最后用5mL甲醇溶液洗脱，1mL/管分管收集，用液相色谱法检测洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。结果表明，黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的柱容量为500~600ng。将免疫亲和柱重复使用5次后，测定其柱容量，柱容量仍然能达到480ng；该结果表明免疫亲和柱可以多次重复使用。同时交叉反应测定结果表明，本发明所述黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱可特异性结合黄曲霉毒素M1，而不会结合玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、赭曲霉毒素等其他真菌毒素。

实施例5：黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱加标回收率的测定：

取10 mL乳制品装入50 mL 离心管中在3500 g，4℃下离心10 min，去掉上层乳脂部分，保留中间部分（即牛奶样品）；称取10 g奶粉准确溶于50℃预热纯水中，定容至100mL，3500 g，4℃下离心10 min，去掉上层乳脂部分，保留中间部分（即奶粉样品）。向牛奶样品和奶粉样品中分别加AFM1标准品至浓度为50、100、500pg/mL，用15mL 70%甲醇水（含4% NaCl）于50℃超声提取10min，提取液用滤纸过滤，取4mL滤液加2mL石油醚，涡旋混匀，静置分层；取下层3mL，加8mL纯水，用0.45μm有机膜过滤，得到过滤液。将制备好的免疫亲和柱用10mL纯水冲洗，加8mL上述过滤液，最后用纯水10mL淋洗，待液体流干后，用1mL甲醇洗脱，收集洗脱液上机检测。检测结果显示：牛奶样品黄曲霉毒素M1的平均回收率为97.3wt%，奶粉样品黄曲霉毒素M1的平均回收率为98wt%。

序列表

＜110＞中国农业科学院油料作物研究所

＜120＞一种黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法和应用

＜160＞8

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213>羊驼

<400>1

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211>8

<212> PRT

<213>羊驼

<400>2

Val Asn Trp Ser Gly Arg Arg Thr

1 5

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213>羊驼

<400>3

Ala Ala Gly Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr Gly Ala Pro Asp Tyr

1 5 10 14

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213>羊驼

<400> 4

ggacgcacct tcagtagcta tgcc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213>羊驼

<400> 5

gttaactgga gtggtcgccg caca 24

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213>羊驼

<400> 6

gcagccggga aggatggtag ttactatggc gctcctgact ac 42

<210> 7

<211> 130

<212> PRT

<213>羊驼

<400> 7

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg

35 40 45

Glu Phe Val Ala Val Val Asn Trp Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

65 70 75

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Asn Cys Ala Ala Gly Lys Asp Gly Ser Tyr Tyr

95 100 105

Gly Ala Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

110 115 120

Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp

125 130

<210> 8

<211> 390

<212> DNA

<213>羊驼

<400> 8

cagttgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggacg caccttcagt agctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagtc gttaactgga gtggtcgccg cacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggctgttt ataactgtgc agccgggaag 300

gatggtagtt actatggcgc tcctgactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 360

tcagaaccca agacaccaaa accacaagac 390

Claims

1.一种黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂，其特征在于：该免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的黄曲霉毒素纳米抗体，所述黄曲霉毒素纳米抗体为黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因序列如SEQ IDNO:8所示；所述黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2三个互补决定区的氨基酸序列分别为：CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；三个互补决定区的编码基因序列分别为：CDR1的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示、CDR2的编码基因序列如SEQ ID NO:5所示，CDR3的编码基因序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体为琼脂糖凝胶或硅胶微球。

3.权利要求1~2所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂的制备方法，其特征在于：

所述固相载体选用硅胶微球时，制备方法为：称取1~5g硅胶微球，用纯水和pH为6.0的磷酸盐缓冲液交替冲洗，再量取5~25mL pH为6.0的磷酸盐缓冲液溶解硅胶微球，搅拌后使硅胶微球全部悬起，得到硅胶微球悬浮液；用1~5mL pH为6.0的磷酸盐缓冲液溶解2~10mg黄曲霉毒素M1纳米抗体2014AFM-G2，然后逐滴加入到硅胶微球悬浮液中；最后称取70~350mg 碳二亚胺，快速加入到硅胶微球悬浮液中，4℃搅拌反应18~22h后，得到以硅胶微球为固相载体的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂；或者

4.装载有权利要求1~2所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱。

5.权利要求4所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫吸附剂填充于固相萃取管中，加入pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液后自然沉淀，然后用pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液洗涤后，保存于含0.02wt%叠氮钠的pH 6.0，0.01M的磷酸盐缓冲液中，得到黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱。

6.权利要求4所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的应用，其特征在于，利用所述黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱对上机前样品提取液进行净化与浓缩。

7.根据权利要求6所述的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱的应用，其特征在于，具体操作为：首先将制备好的黄曲霉毒素M1纳米抗体免疫亲和柱用纯水冲洗，然后加入样品提取液，最后用纯水淋洗，待液体流干后，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，所述洗脱液即为净化与浓缩后的样品提取液，可直接用于上机检测。