CN103868778A - 草本植物木质素含量的测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草本植物木质素含量的测量方法，该方法包括以下步骤：⑴植物样本烘干、粉碎、过筛，得植物样本粉末；⑵植物样本粉末中加醋酸，得到充分软化的植物样本粉末；⑶离心得沉淀物A；用醋酸清洗沉淀物A；⑷乙醇-***溶液浸洗沉淀物A，得到沉淀物B；⑸沉淀物B蒸干后加硫酸，搅拌均匀后室温下静置；⑹加入蒸馏水，搅拌均匀后，经沸水浴、室温下冷却后，再依次加入蒸馏水和氯化钡摇匀离心，得到沉淀物C；⑺沉淀物C水冲洗后，依次加硫酸、重铬酸钾，反应后冷却至室温；⑻将步骤⑺所得物质转移至锥形瓶中；⑼锥形瓶中加碘化钾反应后加淀粉指示剂，并用硫代硫酸钠溶液滴定至终点；⑽空白试验；⑾计算木质素含量即可。本发明简便、准确。

Description

草本植物木质素含量的测量方法

技术领域

本发明涉及一种测量方法，尤其涉及草本植物木质素含量的测量方法。

背景技术

众所周知，木质素是自然界中含量仅次于纤维素的第二位有机高分子化合物。木质素主要分布在植物体内木质部的管状分子和纤维、厚壁细胞、厚角细胞、特定类型表皮细胞的次生壁中，与纤维素、半纤维素构成植物骨架的三种主要成分，在植物体中主要起机械支撑、防止生物降解、病害防御、输送水分等功能。木质素是由3类苯丙烯醇（单木质醇）聚合而成：香豆醇（coumarly alcohol）、松柏醇（coniferly alcohol）和芥子醇（sinapya alcohol）。因为木质素单体不同，可将木质素分为3种：由紫丁香基丙烷单体聚合而成的紫丁香基木质素（syringyl lignin, S-木质素），由愈创木基丙烷单体聚合而成的愈创木基木质素（guaiacyl lignin, G-木质素）和由对羟基苯基丙烷单体聚合而成的对羟基苯基木质素（hydroxy-phenyl, H-木质素）。 

木质素对不同的工业生产、生物质能源利用有着不同的影响。一方面，木质素对工业生产具有消极的影响。植物体内木质素与纤维素、半纤维素结合紧密，在工业生产酒精的过程中，会影响纤维素、半纤维素的转化效率。木质素还是造纸工业生产中产生的工业废液（黑液）的主要成分。另一方面，木质素本身可以作为工业原料进行工业生产。例如，以黑液为工业原料，将黑液中的木质素转化为酚醛树脂胶粘剂；木质素与胶乳共沉，形成木质素母胶用于橡胶工业，木质素在其中起到补强剂的作用。此外，木质素具有高热值，可以通过化学修饰或改性转化为可再生的生物能源和资源（如：柴油、酒精等）；木质素对人体和动物基本上无毒，某些木质素类低聚物可能还具有抗癌、抗肿瘤等功效，可广泛用于食品工业，以减少消化道疾病的发生。

在植物体内，木质素总是与纤维素、半纤维素共存，纤维素和半纤维素都是多糖类大分子化合物，除此之外还有一些寡糖（低聚糖）与木质素共存。这主要是由于在木质素的生物合成过程中，木质素单体有一个糖苷化的过程，分别形成香豆醇葡萄糖苷、松柏醇葡萄糖苷、芥子醇葡萄糖苷，这些单体会在细胞壁木质素合成位点上聚合成木质素大分子，因此在木质素大分子上结合有糖类。但木质素与这些多糖的共存方式是物理性混合还是化学结合尚不确定。目前有大量实验证明木质素的部分结构单元与半纤维素中的某些糖基能够通过化学键结合在一起，形成木质素-糖类复合体，表明木质素和半纤维素为化学结合，因此将二者分离就相对较为困难。此外，植物体内可与木质素缩合的糖基还有吡喃型糖醛酸基、木吡喃糖基、***呋喃糖基、半乳吡喃糖基。

木质素是一种复杂的、非结晶性的、三维网状的高分子化合物，不同于蛋白质、多糖、核酸等天然高分子化合物具有规则的结构，可以用化学式来表示，木质素的结构不规则，只能采用结构模型来表示。此外，不同植物纤维原料的木质素的结构不同。针叶树种木材中木质素的结构单元以愈创木基为主，其余为少量的对羟苯基，在一些杉木成熟材（杉木成熟材中的木质素在官能团的结构和量上都与幼龄材中的木质素不同）的木质素中还存在少量的紫丁香基木质素。阔叶树种木材中除具有愈创木基结构单元外，还存在着较多的紫丁香基结构单元。而草本植物中的木质素由愈创木基、紫丁香基和对羟基苯基三种结构单元组成，其中愈创木基结构单元和紫丁香基结构单元的比例与阔叶树相似，但同时含有更多的对羟基苯基结构单元。由于木质素的复杂结构使其难以通过化学或生物降解，因而导致从植物体内定量化的测定木质素含量很困难。

目前，木质素的测定方法主要有硫酸法（Klason法）、酸性洗涤纤维（Acid Detergent Fiber，简称ADF）法、乙酰溴（Acetyl Bromide,简称AB）法、紫外分光光度（Ultraviolet，简称UV）法等。这些方法主要分为两类：第一类是无创性分析法，包括紫外分光光度（UV）法、红外光谱（Infrared Spectroscopy，简称IRS）法、近红外光谱（Near-Infrared Spectroscopy，简称NIRS）法、核磁共振光谱（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，简称NMRS）法。所有这些无创性方法的优点均为可以在不改变样本木质素化学结构的条件下测定样本木质素的含量，但是这些方法都必须依赖一个适当的“木质素标准样”来校正仪器以便进行木质素的测定。第二类是依赖重量法进行测定的方法。该类方法又分为直接测定法和间接测定法。其中，直接测定法主要有72%（v/v）浓硫酸法（Klason法）、酸性洗涤纤维法（ADF法）等；间接测定法主要有乙酰溴法（AB法）、疏基乙酸盐测定法等。

其中，硫酸法（Klason法）是一种传统的测定木质素含量的方法，原理是利用浓硫酸水解样品中的非木质素部分，剩下的残渣即为木质素。该方法的缺点是不准确，因为有少量木质素可以溶解于浓硫酸，而且这种方法只适合于硬木木质素（如桃心木、桦木、黄杨等树木的木质素）的测定，不适合软木木质素（如橡树、木栓栎、栓皮栎等树种的木质素）、草本木质素（如紫花苜蓿、柳枝稷、玉米等植物的木质素），以及一年生植物的木质素含量（如大豆、花生、狗尾草等植物的木质素）的测定，因为这些植物体内不明确的蛋白质和矿物质会对木质素的测定产生干扰。酸性洗涤纤维法（ADF法）主要用于草本植物或一年生植物木质素的测定，它主要测量出的是酸不溶性木质素的含量，在测定的过程中，木质素的化学结构会发生较大变化。紫外光谱法是木质素测定的一种无创性方法，其原理为：以木质素的特征吸收波长280nm来定量测定样品中木质素的含量。这种方法虽然操作简单，但对于测定标样的获取较难。乙酰溴法（AB法）主要是使用乙酰溴的冰醋酸溶液提取木质素，再用紫外分光光度计测定木质素含量，该法测定结果较上述方法来说都较为理想，但该方法涉及的反应中会有木聚糖的降解，且降解产物在波长280nm处也有吸收，会干扰测定结果的准确性，且对于紫外分光光度计测量时标样的获取也比较困难。

目前，有关木质素测定方法的专利技术较少，只涉及某一类或某一种植物的木质素测定方法，针对性较强而普遍适用性较弱。如：公布号为CN103335974A的“一种烟草中木质素含量的测定方法”，该发明主要应用于烟草成分分析领域，具体涉及到一种烟草中木质素含量的测定方法，该方法采用对烟草进行预处理（使用氢氧化钠/尿素溶液），使烟草中的蛋白质、水溶性糖和其他游离杂质等物质从烟草中除去，然后使用硫酸溶液（较低浓度）处理，后在低温条件下，将烟草中的纤维素和半纤维素在氢氧化钠/尿素溶液中溶解，获得酸不溶木质素，再通过计算，得到酸不溶木质素的含量，同时采用紫外吸收光谱法测定烟草酸溶木质素的含量，两者相加可得烟草木质素的含量。公布号为CN101105444A的“一种棉花纤维中木质素含量的检测分析方法”，该发明涉及一种棉花纤维中木质素含量的检测分析方法，主要操作为先将棉纤维的杂质挑去干净，清洗可溶物质。然后消化水解棉纤维，溶解木质素，将消化水解后的溶液稀释，加入氢氧化钠和盐酸羟胺消除溶液背景的影响，定容，静置，采用紫外分光光度计在波长280nm处测定吸光度。公布号为CN102608054A的“一种梨果肉中木质素含量的检测分析方法”，该发明公开了一种梨果肉中木质素含量的检测分析方法，其步骤包括首先对待检测的梨果肉经过一系列的化学处理后，采用紫外分光光度计在波长280nm 处测定吸光度值，代入公式计算木质素含量。上述专利只针对了某一种植物或植物的果实等其他含有木质素的组织、器官的木质素含量的测定，不适用于其它植物或植物组织器官中木质素的测定。公布号为CN101799389A确立棉花纤维中木质素含量和纤维品质相关关系的方法中提到的棉花木质素测定的方法，主要是使用浓硫酸将棉花中除木质素外的其他物质都溶解后，烘干剩余残渣并且在575℃下灰化，称取的灰分重量即为棉花木质素测定值。该方法对植物材料处理的过程较为简单化，致使测定的木质素含量误差过大。此外，除了上述几种发明专利与测定植物体内木质素方法有关外，少有或没有其他类似的测定木质素方法的专利，这说明在木质素测定方法方面尚具有很多问题需要深入研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、准确的草本植物木质素含量的测量方法。

为解决上述问题，本发明所述的草本植物木质素含量的测量方法，包括以下步骤：

⑴将采集到的植物样本在80℃条件下烘干48~72h，采用微型植物粉碎机将植物样品粉碎，粉碎后过30目筛，收集植物样本粉末；

⑵称取0.05~0.10g所述植物样本粉末，并将具体数值记为 n；然后将所述植物样本粉末放入50mL离心管中，加入质量浓度为0.1%的醋酸溶液10mL，用玻璃棒搅拌均匀后放置20~30min，得到充分软化的植物样本粉末；

⑶将内置所述充分软化的植物样本粉末的离心管盖上盖子，放入离心机中，以3500rpm的转速离心5min，分别得到上清液A和沉淀物A；倒掉所述上清液A，并用质量浓度为0.1%的醋酸溶液5mL清洗所述沉淀物A；

⑷用乙醇-***溶液5mL浸洗所述步骤⑶所得的沉淀物A 3~5min，分别得到上清液B和沉淀物B；弃去所述上清液B；重复浸洗3次；

⑸将内置所述沉淀物B的离心管在水温为80℃时放入水浴或直接在冷水中加热直至该离心管内液体蒸干；然后在该离心管中加入质量浓度为72%的硫酸溶液3mL，用玻璃棒搅拌均匀，在室温条件下静置16h，使纤维素充分溶解到硫酸中；

⑹向所述步骤⑸所得的离心管中加入10mL蒸馏水，搅拌均匀后，放置到95~100℃沸水浴中5min，取出该离心管后室温下冷却，再依次加入5mL蒸馏水和质量浓度为10%的氯化钡溶液0.5mL并摇匀，在4000rpm条件下离心5min；分别得到上清液C和沉淀物C；弃去所述上清液C；

⑺所述沉淀物C用蒸馏水冲洗2~3次后，先加入质量浓度为10%的硫酸溶液10mL，再加入0.1mol/L的重铬酸钾溶液10mL，搅拌均匀，然后在95~100℃沸水浴中搅拌反应15min至反应充分完成；将离心管从沸水浴中取出，静置待管内溶液冷却至室温；

⑻将所述步骤⑺所得的离心管中的所有物质转移至150mL锥形瓶中，用15~20mL蒸馏水将该离心管清洗2~3次，并将清洗液全部转移到所述锥形瓶中；

⑼向所述步骤⑻所得的含有残留物的溶液中加入质量浓度为20%的碘化钾溶液5mL，摇动所述锥形瓶使其充分反应；然后加入质量浓度为0.5%的淀粉指示剂1mL，用配置好的硫代硫酸钠溶液滴定，待溶液颜色变为亮绿色，且30s内溶液颜色不变化时即为滴定终点；记录滴定所消耗硫代硫酸钠溶液用量，并记为b；

⑽空白试验：在150mL锥形瓶中加入质量浓度为10%的硫酸溶液10mL和0.1mol/L重铬酸钾溶液10mL并混匀，用所述步骤⑼中已配置好的硫代硫酸钠溶液滴定，所消耗的硫代硫酸钠溶液体积记为a，作为空白对照结果；

⑾按下式计算木质素含量即可：

X=K(a-b)/(n*48)

式中：48为1mol C₁₁H₁₂O₄相当于硫代硫酸钠的当量数；

K为硫代硫酸钠浓度，mol/L；

a为空白滴定所消耗硫代硫酸钠体积，mL；

b为滴定溶液所消耗硫代硫酸钠体积，mL；

n为样品所取质量，g。

所述步骤⑷中乙醇-***溶液是指乙醇与***等体积混合均匀后所得的混合液。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明使用实验室常用的实验装置和仪器设备，没有特殊的专用设备，实验药品为常用的普通试剂，价格低廉，因此，不但工作量小、方法简单、操作容易，而且分析结果正确、分析速度较快、重现性好，且本发明可以有效克服现有技术体系的不足，为草本植物的纤维结构组成和品质评价提供了一种有效的方法。

2、本发明为草本植物的木质素测定建立一套较为完整、简便、快捷、普及性广的技术体系，将有利于开展优良牧草（如紫花苜蓿、白三叶、黑麦草等）进行品种选育以及品质评价。此外，对一些优良的生物质能源植物（如柳枝稷、芒草等）草本植物的工业生产效率的评估和提高产量具有重要的价值，可以在各个实验室以及相关工厂中推广应用。

具体实施方式

草本植物木质素含量的测量方法，包括以下步骤：

⑴将采集到的植物样本在80℃条件下烘干48~72h，采用微型植物粉碎机将植物样品粉碎，粉碎后过30目筛，收集植物样本粉末。

⑵称取0.05~0.10g植物样本粉末，并将具体数值记为 n；然后将植物样本粉末放入50mL离心管中，加入质量浓度为0.1%的醋酸溶液10mL，用玻璃棒搅拌均匀后放置20~30min，得到充分软化的植物样本粉末。

⑶将内置充分软化的植物样本粉末的离心管盖上盖子，放入离心机中，以3500rpm的转速离心5min，分别得到上清液A和沉淀物A；倒掉上清液A，并用质量浓度为0.1%的醋酸溶液5mL清洗沉淀物A。

⑷用乙醇-***溶液5mL浸洗步骤⑶所得的沉淀物A 3~5min，分别得到上清液B和沉淀物B；弃去上清液B；重复浸洗3次。

其中：乙醇-***溶液是指乙醇与***等体积混合均匀后所得的混合液。

⑸将内置沉淀物B的离心管在水温为80℃时放入水浴或直接在冷水中加热直至该离心管内液体蒸干；然后在该离心管中加入质量浓度为72%的硫酸溶液3mL，用玻璃棒搅拌均匀，在室温条件下静置16h，使纤维素充分溶解到硫酸中。

⑹向步骤⑸所得的离心管中加入10mL蒸馏水，搅拌均匀后，放置到95~100℃沸水浴中5min，取出该离心管后室温下冷却，再依次加入5mL蒸馏水和质量浓度为10%的氯化钡溶液0.5mL并摇匀，在4000rpm条件下离心5min；分别得到上清液C和沉淀物C；弃去上清液C。

⑺沉淀物C用蒸馏水冲洗2~3次后，先加入质量浓度为10%的硫酸溶液10mL，再加入0.1mol/L的重铬酸钾溶液10mL，搅拌均匀，然后在95~100℃沸水浴中搅拌反应15min至反应充分完成；将离心管从沸水浴中取出，静置待管内溶液冷却至室温。

⑻将步骤⑺所得的离心管中的所有物质转移至150mL锥形瓶中，用15~20mL蒸馏水将该离心管清洗2~3次，并将清洗液全部转移到锥形瓶中。

⑼向步骤⑻所得的含有残留物的溶液中加入质量浓度为20%的碘化钾溶液5mL，摇动锥形瓶使其充分反应；然后加入质量浓度为0.5%的淀粉指示剂1mL，用配置好的硫代硫酸钠溶液滴定，待溶液颜色变为亮绿色，且30s内溶液颜色不变化时即为滴定终点；记录滴定所消耗硫代硫酸钠溶液用量，并记为b。

⑽空白试验：在150mL锥形瓶中加入质量浓度为10%的硫酸溶液10mL和0.1mol/L重铬酸钾溶液10mL并混匀，用步骤⑼中已配置好的硫代硫酸钠溶液滴定，所消耗的硫代硫酸钠溶液体积记为a，作为空白对照结果；

⑾按下式计算木质素含量即可：

X=K(a-b)/(n*48)

式中：48为1mol C₁₁H₁₂O₄相当于硫代硫酸钠的当量数；

K为硫代硫酸钠浓度，mol/L；

a为空白滴定所消耗硫代硫酸钠体积，mL；

b为滴定溶液所消耗硫代硫酸钠体积，mL；

n为样品所取质量，g。

测定数值实例如表1：

表1. 紫花苜蓿3个品种样品木质素含量检测结果实例

Claims (2)

1.草本植物木质素含量的测量方法，包括以下步骤：

⑴将采集到的植物样本在80℃条件下烘干48~72h，采用微型植物粉碎机将植物样品粉碎，粉碎后过30目筛，收集植物样本粉末；

⑵称取0.05~0.10g所述植物样本粉末，并将具体数值记为 n；然后将所述植物样本粉末放入50mL离心管中，加入质量浓度为0.1%的醋酸溶液10mL，用玻璃棒搅拌均匀后放置20~30min，得到充分软化的植物样本粉末；

⑶将内置所述充分软化的植物样本粉末的离心管盖上盖子，放入离心机中，以3500rpm的转速离心5min，分别得到上清液A和沉淀物A；倒掉所述上清液A，并用质量浓度为0.1%的醋酸溶液5mL清洗所述沉淀物A；

⑷用乙醇-***溶液5mL浸洗所述步骤⑶所得的沉淀物A 3~5min，分别得到上清液B和沉淀物B；弃去所述上清液B；重复浸洗3次；

⑸将内置所述沉淀物B的离心管在水温为80℃时放入水浴或直接在冷水中加热直至该离心管内液体蒸干；然后在该离心管中加入质量浓度为72%的硫酸溶液3mL，用玻璃棒搅拌均匀，在室温条件下静置16h，使纤维素充分溶解到硫酸中；

⑹向所述步骤⑸所得的离心管中加入10mL蒸馏水，搅拌均匀后，放置到95~100℃沸水浴中5min，取出该离心管后室温下冷却，再依次加入5mL蒸馏水和质量浓度为10%的氯化钡溶液0.5mL并摇匀，在4000rpm条件下离心5min；分别得到上清液C和沉淀物C；弃去所述上清液C；

⑺所述沉淀物C用蒸馏水冲洗2~3次后，先加入质量浓度为10%的硫酸溶液10mL，再加入0.1mol/L的重铬酸钾溶液10mL，搅拌均匀，然后在95~100℃沸水浴中搅拌反应15min至反应充分完成；将离心管从沸水浴中取出，静置待管内溶液冷却至室温；

⑻将所述步骤⑺所得的离心管中的所有物质转移至150mL锥形瓶中，用15~20mL蒸馏水将该离心管清洗2~3次，并将清洗液全部转移到所述锥形瓶中；

⑼向所述步骤⑻所得的含有残留物的溶液中加入质量浓度为20%的碘化钾溶液5mL，摇动所述锥形瓶使其充分反应；然后加入质量浓度为0.5%的淀粉指示剂1mL，用配置好的硫代硫酸钠溶液滴定，待溶液颜色变为亮绿色，且30s内溶液颜色不变化时即为滴定终点；记录滴定所消耗硫代硫酸钠溶液用量，并记为b；

⑽空白试验：在150mL锥形瓶中加入质量浓度为10%的硫酸溶液10mL和0.1mol/L重铬酸钾溶液10mL并混匀，用所述步骤⑼中已配置好的硫代硫酸钠溶液滴定，所消耗的硫代硫酸钠溶液体积记为a，作为空白对照结果；

⑾按下式计算木质素含量即可：

X=K(a-b)/(n*48)

式中：48为1mol C₁₁H₁₂O₄相当于硫代硫酸钠的当量数；

K为硫代硫酸钠浓度，mol/L；

a为空白滴定所消耗硫代硫酸钠体积，mL；

b为滴定溶液所消耗硫代硫酸钠体积，mL；

n为样品所取质量，g。

2.如权利要求1所述的草本植物木质素含量的测量方法，其特征在于：所述步骤⑷中乙醇-***溶液是指乙醇与***等体积混合均匀后所得的混合液。