CN103866046A - 人疱疹病毒ebv和vzv检测试剂盒 - Google Patents
人疱疹病毒ebv和vzv检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒,由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成,其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针。本发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针,能一步法检测人疱疹病毒EBV和VZV,实现了EBV和VZV感染的同步诊断,对阳性病毒能实时准确定量,可满足临床早期、准确诊断EBV和VZV感染的迫切需要,为EBV和VZV感染的及时针对性治疗提供依据。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及荧光定量PCR检测试剂盒,具体涉及一种双探针实时荧光定量PCR同时检测患者血液、尿液、脑脊液等样本中爱泼斯坦-马尔病毒(Epstein-Barr virus, EBV)和水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)的诊断试剂盒。
背景技术
EBV和VZV是引起儿童病毒性脑炎的常见人疱疹病毒。EBV侵犯中枢神经***后,可导致脑水肿、出血、免疫复合物沉积、脑组织脱髓鞘样改变等,临床可表现为急性起病或慢性活动性损害。急性EBV脑炎多为病毒直接侵入神经***,如脑膜、脑组织和脊髓、外周神经多个部位的神经轴索;慢性EBV脑炎则与自身免疫反应有关,为免疫复合物的沉积、感染后炎性反应造成的脑组织脱髓鞘样改变。VZV初次感染引起水痘,主要发生于儿童;水痘痊愈后病毒潜伏于神经节细胞,再激活引起带状疱疹。VZV脑炎常发生于出疹后1周内,其发病机制可能为病毒直接侵犯中枢神经***,也可能为免疫反应损伤所致。此外,还有同时感染EBV和VZV继发病毒性脑炎的病例报道,两种病毒间可能存在相互促进激活的情况。
EBV和VZV感染的早期诊断和及时抗病毒治疗对可明显改善预后,降低病死率。因EBV和VZV感染的临床表现多样,且与其他疱疹病毒相比临床症状和体征多无特异性,因此早期诊断和及时治疗需依赖实验室检测。传统的EBV和VZV检测方法主要包括病毒分离培养和血清学检测,前者曾为疱疹病毒的诊断“金标准”,但存在需时长(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒药物治疗后)、分型困难等缺陷;后者又分为抗原直接检测法和抗体间接检测法,抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致敏感性低,抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需1周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断,且不同疱疹病毒间存在交叉反应,抗体特异性不高。
随着分子生物学技术的迅速发展,聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术,特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性,在普通PCR基础上设计荧光双标记探针,两端分别标记荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q);探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制,一旦探针被切断,Q基团的抑制作用消失,R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测,并可精确计算初始模板量,除具有定量准确、检测快速等优点外,最大的优势是采用完全闭管检测,省去了对PCR产物的后处理,避免了交叉污染。
目前的实时荧光定量PCR技术随着材料和仪器的进一步发展,通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(FAM、HEX、ROX等)及多通道荧光定量PCR仪,可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。本发明基于上述技术背景,设计针对EBV和VZV的特异性探针,开发能一步法同时检测和定量EBV和VZV的荧光定量PCR试剂盒,旨在满足临床EBV和VZV感染早期、快速诊断的需求,为临床及时进行针对性治疗提供依据。
发明内容
本发明提供一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒,是一种实时荧光定量PCR检测试剂盒,由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成,其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针。
PCR扩增引物序列为:
EBV上游扩增引物序列(SEQ ID No:1):5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’;
EBV下游扩增引物序列(SEQ ID No:2):5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’;
VZV上游扩增引物序列(SEQ ID No:3):5’-TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’;
VZV下游扩增引物序列(SEQ ID No:4):5’-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’。
EBV荧光探针序列(SEQ ID No:5):5’FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’;
VZV荧光探针序列(SEQ ID No:6):5’HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’;
EBV标准品序列(SEQ ID No:7):GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACAT ATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGG GGGCCACAAA CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGA AAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA;
VZV标准品序列(SEQ ID No:8):TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAA ACTTATTAAT ATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTC CAAACCCGGCCATCCCAGAC GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGC CGCAGCACGC GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。
EBV阳性对照和VZV阳性对照分别为EBV和VZV灭活病毒株样品,阴性对照为无菌注射用水样品。
本发明试剂盒应保存于-20℃,尽量减少反复冻融。
本发明试剂盒使用方法:
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照,标准品用无菌去离子水稀释为1×104-1×107拷贝。
病毒DNA的提取:严格按照商品化的QIAamp DNA抽提试剂盒操作,从临床标本或病毒分离培养物中提取病毒DNA。
PCR扩增检测:在双色(或以上)荧光定量PCR仪上进行,每个PCR反应体系总体积为25 ,其中包括20 PCR反应液和5模板(提取的病毒DNA、标准品、阳性或阴性对照)。探针检测模式为:FAM、HEX通道分别用于检测EBV、VZV。PCR反应条件:94℃ 5分钟预变性,94℃ 20秒→60℃ 60秒,共40个循环。设置完成后,保存文件,运行程序。
荧光定量结果报告:① 检测样品的扩增曲线无对数增长期或双探针CT(threshold cycle)值均≥40为阴性;② 检测样品某一探针CT值≤38且扩增曲线有明显对数增长期,则该探针对应的病毒为阳性;同一反应体系中两个探针CT值≤38且扩增曲线有明显对数增长期,则为EBV和VZV混合阳性;③检测样品某一探针38<CT值<40,需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。
本发明采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针,开发研制了用于EBV和VZV定量检测的试剂盒。该发明试剂盒能一步法检测人疱疹病毒EBV和VZV,不仅实现了EBV和VZV感染的同步诊断,而且对阳性病毒能进行实时准确定量,可满足临床早期、准确诊断EBV和VZV感染的迫切需要,为EBV和VZV感染的及时针对性治疗提供依据。
附图说明
图1为本发明试剂盒的结构示意图。
图2为EBV和VZV浓度梯度标准品的标准曲线。
具体实施方式
本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解,这些实施例仅用于说明目的,而不用于限制本发明的范围。
实施例1
参见图1,本发明提供的人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒,由定量PCR反应液1、EBV标准品2、VZV标准品3、EBV阳性对照品4、VZV阳性对照品5、阴性对照品6、说明书7和盒体8组成。
其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针。
PCR扩增引物序列为:
EBV上游扩增引物序列(SEQ ID No:1):5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’;
EBV下游扩增引物序列(SEQ ID No:2):5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’;
VZV上游扩增引物序列(SEQ ID No:3):5’-TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’;
VZV下游扩增引物序列(SEQ ID No:4):5’-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’。
EBV荧光探针序列(SEQ ID No:5):5’FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’;
VZV荧光探针序列(SEQ ID No:6):5’HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’;
EBV标准品序列(SEQ ID No:7):GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACAT ATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGG GGGCCACAAA CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGA AAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA;
VZV标准品序列(SEQ ID No:8):TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAA ACTTATTAAT ATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTC CAAACCCGGCCATCCCAGAC GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGC CGCAGCACGC GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。
EBV阳性对照1和VZV阳性对照2分别为EBV和VZV灭活病毒株样品,阴性对照为无菌注射用水样品。
本发明试剂盒应保存于-20℃,尽量减少反复冻融。
实施例2 人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒的敏感性和特异性试验
(一)材料:
选取病原微生物包括:实验组:EBV(B95-8株)由北京病毒研究所提供,VZV(EF株)由安徽医科大学微生物教研组提供;对照组:金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组由浙江大学附属儿童医院细菌室、病毒室和基因扩增室提供。
(二)引物及探针的设计与合成:
对EBV和VZV的保守区序列进行生物信息学分析,设计并筛选PCR扩增引物和特异性荧光探针,委托上海生工生物公司合成。
EBV上游扩增引物序列(SEQ ID No:1):5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’;
EBV下游扩增引物序列(SEQ ID No:2):5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’;
VZV上游扩增引物序列(SEQ ID No:3):5’-TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’;
VZV下游扩增引物序列(SEQ ID No:4):5’-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’。
EBV荧光探针序列(SEQ ID No:5):5’FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’;
VZV荧光探针序列(SEQ ID No:6):5’HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’。(三)检测标准品的制备:
用EBV上游扩增引物和EBV下游扩增引物扩增EBV病毒株,用VZV上游扩增引物和VZV下游扩增引物扩增VZV病毒株,各扩增片段纯化后***pGEM-T-Easy克隆载体构建重组质粒,用分光光度计对各质粒进行定量,并用无菌去离子水以10倍比稀释各质粒进行荧光定量PCR敏感性试验。
(四)试剂盒的敏感性和特异性试验:
采用人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒对上述常见病原微生物进行检测,实验组两种病毒检测结果均为阳性且分型符合,对照组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组等检测结果均为阴性,特异性为100%。构建的重组质粒标准品倍比稀释后检测敏感性可达10拷贝;用104、105、106、107四个定量的浓度梯度标准品作标准曲线,其CT值与质粒拷贝数之间具有良好的线性关系(图2)。
本发明是结合最佳实施例进行描述的,然而在阅读了本发明的上述内容后,本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。
<110> 浙江大学
<120> 人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒
<160> 8
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测人疱疹病毒EBV上游引物序列
<400> 1
TCATCTACGGGGACACGGAC 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测人疱疹病毒EBV下游引物序列
<400> 2
GAGCTCCACCCCCTTCATC 19
<210>3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测人疱疹病毒VZV上游引物序列
<400> 3
TAGGCGGATGGTGGACGACT 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测人疱疹病毒VZV下游引物序列
<400> 4
GCCCGCAAACTTGTAGAACTG 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人疱疹病毒EBV荧光探针序列
<400> 5
GCACTCGATAAACAGCGAG 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人疱疹病毒VZV荧光探针序列
<400> 6
TTGTTATGACGGCCGAGCT 19
<210> 7
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据人疱疹病毒EBV BALF5基因序列设计的EBV荧光定量检测标准品序列
<400> 7
GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACAT ATCTCTTCTT 60
TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGG GGGCCACAAA 120
CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGA 180
AAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA 227
<210> 8
<211> 224
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据人疱疹病毒VZV ORF28基因序列设计的VZV荧光定量检测标准品序列
<400> 8
TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAA ACTTATTAAT ATCCAATTTG 60
GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTC CAAACCCGGC CATCCCAGAC 120
GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGC CGCAGCACGC 180
GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC 224
Claims (3)
1.一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒,其特征在于,由定量PCR反应液(1)、EBV标准品(2)、VZV标准品(3)、EBV阳性对照品(4)、VZV阳性对照品(5)、阴性对照品(6)、说明书(7)和盒体(8)组成,其中:PCR反应液(1)含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、EBV上游扩增引物、EBV下游扩增引物、VZV上游扩增引物、VZV下游扩增引物、EBV荧光探针和VZV荧光探针;
EBV上游扩增引物序列:5’-TCATCTACGGGGACACGGAC-3’;
EBV下游扩增引物序列:5’-GAGCTCCACCCCCTTCATC-3’;
VZV上游扩增引物序列:5’-TAGGCGGATGGTGGACGACT-3’;
VZV下游扩增引物序列:5’-GCCCGCAAACTTGTAGAACTG-3’;
EBV荧光探针序列:5’FAM-GCACTCGATAAACAGCGAG-BHQ-1-3’;
VZV荧光探针序列:5’HEX-TTGTTATGACGGCCGAGCT-BHQ-1-3’;
EBV标准品序列:GAGCTCCACC CCCTTCATCA GGGTCTTGCC GTCCGTCAGC ACCCCCACAT ATCTCTTCTT TGTAATCAGC ATCAGGCAGG AGAAGGTCTT CTCGGCCTCC AGGGAGATGG GGGCCACAAA CAGGCTCCGG GTGGTGTGGG CGGCCAGGGC CTCGGCAAAG CGCAGGGTCT CGCTCTCTGA AAACCCCCGG CACTCGATAA ACAGCGAGTC CGTGTCCCCG TAGATGA;
VZV标准品序列:TAGGCGGATG GTGGACGACT AAGCTCGGCC GTCATAACAA ACTTATTAAT ATCCAATTTG GGTGATGTAA TCTGGCGATG TGCATCTGCA ATTATGCGTC CAAACCCGGCCATCCCAGAC GGCATGGCCC GTCTATTCCA TTCAGCAATG GAAACACACG ACGCCTCCGC CGCAGCACGC GAGACGGTGT CGTCATATAA CAACAGTTCT ACAAGTTTGC GGGC。
2.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒,其特征在于,EBV阳性对照和VZV阳性对照分别为EBV和VZV灭活病毒株样品,阴性对照为无菌注射用水样品。
3.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒,其特征在于,本发明试剂盒保存于-20℃,减少反复冻融。
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