CN103865940B - 一种l-异亮氨酸羟化酶基因及其基因工程菌与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种能特异性地催化L-异亮氨酸生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶基因，以及含有该基因的基因工程菌。利用该菌株生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸，能够克服提取法存在的提取率低、分离纯化困难、原材料需求量大、成本高等不足；化学合成法反应条件苛刻、步骤多、分离困难收率低的问题；以及酶法转化率低且含有大量α-氨基丁酸等副产物的问题，使得发酵液中仅存在（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸一种构型的4-羟基异亮氨酸，并通过L-异亮氨酸羟化酶编码基因过表达的方法进一步提高转化效率，从而达到简化工艺、降低生产成本的目的。
Description
技术领域：
本发明涉及一种能特异性地催化L-异亮氨酸（L-Ile）生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶基因及含有该基因的基因工程菌，利用该菌株生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸产物单一，具有较高的转化率，属于生物技术领域。
背景技术：
4-羟基异亮氨酸（4-Hydroxyisoleucine，4-HIL）是一种主要存在于胡芦巴属植物种子中的L-异亮氨酸羟化物。研究表明4-羟基异亮氨酸具有葡萄糖浓度依赖的促进胰岛素分泌的活性以及促进肌细胞对血糖吸收、加速脂肪代谢、降血脂和保护肝功能的作用。因此，作为有效预防和治疗糖尿病及肥胖症的理想药物，4-羟基异亮氨酸具有广泛的应用前景和市场需求。
目前已报道的4-羟基异亮氨酸的生产方法包括提取法、化学合成法以及酶法，但仅提取法用于工业化生产。研究表明此方法获得的4-羟基异亮氨酸构型较多，但仅（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸具有上述生物学活性，从而使得该方法存在提取率低（仅为0.091-0.6%）、分离纯化困难、原材料需求量大、成本高等不足。化学法合成4-羟基异亮氨酸的报道较多，但主要是以葡萄糖、薄荷酮或2-甲基乙酰乙酸乙酯为原料经多步化学反应生成，该方法反应条件苛刻、步骤多、分离困难收率低，而且容易造成环境污染。酶法合成是以己醛、α-酮戊二酸化及L-谷氨酸为底物经4-羟基-3-甲基-2-酮基-戊酸醛缩酶和分支链氨基酸氨基转移酶两步催化合成，该方法转化率低且产品中含有大量α-氨基丁酸等副产物。
因此，采用特异性L-异亮氨酸羟化酶催化合成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸是较为理想的方法。尽管Haefelé等在胡芦巴种子破碎液中发现能够将L-异亮氨酸（L-Isoleucine,L-Ile）转化为（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的活性组分，但至今未见后续研究报道。Kodera等（2009）首次报道了在苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）中发现能特异性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶。然而目前公布的关于能特异性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶的基因序列有限，且未见采用微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的报道。
发明内容：
本发明的一个目的是提供一种能特异性地催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶基因（以ido表示），该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。其所编码的L-异亮氨酸羟化酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。
本发明的另一个目的是提供一种包含所述L-异亮氨酸羟化酶基因的基因工程菌，利用基因克隆技术将所述L-异亮氨酸羟化酶基因连接到合适的载体上，并转化至宿主细胞进行表达，获得能够生产特异性催化L-Ile生成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的L-异亮氨酸羟化酶的基因工程菌。
本发明的另一个目的是针对目前（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的生产因提取（或反应）液中不同构型4-羟基异亮氨酸共存，但有生物活性的（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸浓度低，致使存在原材料需求量大、成本高、污染严重等问题，提供一种以L-异亮氨酸和α-酮戊二酸为底物，采用微生物转化法合成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的生产方法，使得发酵液中仅存在（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸一种构型的4-羟基异亮氨酸，并通过L-异亮氨酸羟化酶编码基因过表达的方法进一步提高转化效率，从而达到简化工艺、降低生产成本。
本发明解决上述技术问题的技术方案之一是：提供一种构建上述基因工程菌的方法，包括如下步骤：
（1）重组质粒的构建
以本发明所述的L-异亮氨酸羟化酶编码基因为模板、以IDO-3（SEQIDNO:3）和IDO-4（SEQIDNO:4）为引物，进行PCR扩增；
IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(SalⅠ)
IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoRⅠ)
将PCR扩增产物经回收后分别经SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，经电泳、切胶回收后连接至表达载体pXMJ19，获得重组质粒。
（2）重组菌株的构建
将（1）所获得的重组质粒电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032细胞中，获得重组菌株。
本发明解决上述问题所采用的技术方案之二是：提供一种微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子培养：用接种环将1-2支经新鲜斜面活化的上述基因工程菌，接种至装有100mL种子培养基的1L挡板摇瓶，于32-37℃，200rpm振荡培养6-8h。
（2）菌体的发酵培养：以5%-10%接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度32-37℃，溶氧维持在20-40%，流加浓度为60-80%(W/V)的葡萄糖溶液，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵培养8-12h。按照10%接种量将一级种子液转接入5L自动发酵罐，装液量为3L，溶氧控制在20%-30%，培养温度33℃，pH控制在7.0左右。
（3）向发酵罐中添加等物质的量浓度的L-异亮氨酸和α-酮戊二酸无菌溶液，使其终浓度为0.1-0.3mol/L，按步骤（2）继续培养18-24h。经24-36h培养，能够将91.7%的L-Ile转化为（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸。
（4）采用2，4-二硝基氟苯对（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸衍生化后，以高效液相色谱法测定其的含量。
所述斜面培养基成分为：葡萄糖1.0-5.0g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，NaCl2.0-3.0g/L，琼脂25g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
所述种子培养基成分为：葡萄糖25-30g/L，玉米浆15-30mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，KH2PO40.5-1.0g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，MnSO415-30mg/L，FeSO410-30mg/L，尿素2-5/L,pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
所述发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，K2HPO43.0-5.0g/L，MgSO41.0-2.0g/L，MnSO420-50mg/L，FeSO420-50mg/L，玉米浆20-50mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
有益效果：
1、本发明所述ido基因编码的L-异亮氨酸羟化酶具有如下特点：
该酶的Km和Vmax分别为0.15mmol/L和3.13μmol/min/mg；酶活随温度的升高而升高，当温度达到35℃时其活性最高，随着温度的继续升高其活性迅速降低，当温度高于65℃时活性完全丧失（见图7）；pH7.0时活性最高，当pH高于或低于7.0时，随着pH的偏离，其活性急剧下降（见图8）；于35℃条件下处理5h后仍具有87.5%的活性。
2、本发明所述的生产方法克服了提取法存在的提取率低（仅为0.091-0.6%）、分离纯化困难、原材料需求量大、成本高等不足；化学合成法反应条件苛刻、步骤多、分离困难收率低，而且容易造成环境污染的问题；以及酶法转化率低且产品中含有大量α-氨基丁酸等副产物的问题，使得发酵液中仅存在（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸一种构型的4-羟基异亮氨酸，并通过L-异亮氨酸羟化酶编码基因过表达的方法进一步提高转化效率，从而达到简化工艺、降低生产成本。
3、以本发明所述的基因工程菌为催化剂，L-异亮氨酸和α-酮戊二酸为底物，利用微生物转化法合成（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸，专一性强，转化效率高于75%，工艺简单易可行，成本低廉，适用于（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的绿色制造。
附图说明：
图1重组质粒pXMJ-ido构建图；
图2ido基因PCR产物电泳图谱
其中M为Marker泳道1以IDO-1和IDO-2为引物、宏基因组为模板泳道2以IDO-3和IDO-4为引物、pET-ido为模板；
图3重组质粒pET-ido和pXMJ-ido的酶切电泳图谱
其中M为Marker泳道1为pET-ido经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切泳道2为pXMJ-ido经SalⅠ和EcoRⅠ双酶切；
图4重组L-异亮氨酸羟化酶的SDS-PAGE电泳图谱
其中M为Marker泳道1为含空质粒pET-42a的E.coliBL21(DE3)破碎液
泳道2为未经IPTG诱导的BL-IDO破碎液泳道3为经IPTG诱导的BL-IDO破碎液泳道4为经纯化的重组L-异亮氨酸羟化酶；
图5(2S,3R,4S)-4-异亮氨酸标准品及本发明重组L-异亮氨酸羟化酶反应产物的HPLC和MS图谱
其中A为(2S,3R,4S)-4-异亮氨酸标准品HPLC图谱
B为重组L-异亮氨酸羟化酶的反应产物HPLC图谱
C为对照经2，4-二硝基氟苯衍生化后HLPC图谱
D为(2S,3R,4S)-4-异亮氨酸标准品MS图谱
E为重组L-异亮氨酸羟化酶的反应产物MS图谱
保留时间为21.6min的色谱峰为重组L-异亮氨酸羟化酶的反应产物
保留时间为13.5min的色谱峰为衍生剂2，4-二硝基氟苯
保留时间为23.8min的色谱峰为L-异亮氨酸；
图6双倒数曲线；
图7温度对本发明L-异亮氨酸羟化酶活性的影响；
图8pH对本发明L-异亮氨酸羟化酶活性的影响；
图9本发明重组L-异亮氨酸羟化酶的热稳定性；
具体实施方式
实施例1：L-异亮氨酸羟化酶编码基因ido的获取
采用如下方法提取土壤宏基因组：
取天津科技大学花园表层土以下10cm处10g土样置于摇瓶中，加入20mLDNA提取液(100mol/LTris-HCl，100mmol/LEDTA2Na；100mmol/LNa3PO4，1.5mol/LNaCl，2%CTAB，pH8.0)混匀。加入500μL溶菌酶(50mg/mL，pH8.0)，混匀后37℃水浴30min。置于超声清洗仪中处理10min后加入1.5g无菌玻璃珠(直径1mm)，振荡5min。加入40μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀后再加入2mL20%SDS，65℃水浴1h，每隔15-20min轻轻摇晃。于室温10000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。用等体积的苯酚和氯仿/异戊醇(24:1)各抽提一次，10000g离心15min。吸取上清液转移至另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇混匀，沉淀2h以上，10000g离心20min。收集核酸沉淀，用冷的75%乙醇洗涤2次，干燥后溶于适量去离子水中。
以上述土壤宏基因组DNA为模板、利用引物IDO-1（SEQIDNO:5）和IDO-2（SEQIDNO:6）、通过PCR扩增ido基因（ido基因PCR产物电泳图谱见图2）；
IDO-1：5’-_CCGCATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(NdeⅠ)
IDO-2：5’-CCGCTCGAGTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(XhoⅠ)
PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为100μL。取10μLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
将从宏基因组DNA中PCR扩增的目的片段回收后连接至pMDTM18-TVector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒(将3个重组质粒上的ido片段分别命名为ido-1、ido-2、ido-3)并测定ido序列。
测序结果表明，上述3个ido基因均含723个核苷酸，编码240个氨基酸。其核苷酸序列与已报道的B.thuringiensis2-e-2的ido基因序列相似度分别为100%、97.47%和96.13%，其氨基酸序列相似性分别为100%、97.91%和93.33%。
实施例2：重组质粒pET-ido的构建及L-异亮氨酸羟化酶编码基因ido功能分析
提取含ido-3的重组质粒并用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切后进行琼脂糖电泳，切胶回收后连接至经相同酶切的表达载体pET-42a，获得重组质粒pET-ido，将其转化至E.coliBL21（DE3）感受态细胞中获得重组菌株BL-IDO。
将BL-IDO种子培养物接种至LB液体培养基中，采用0.1mmol/LIPTG诱导表达4h。取1mL培养物于4℃10000g离心1min收集菌体，并用1mL缓冲液A(Na2HPO4·12H2O2.9g/L,NaCl8.5g/L,NaH2PO4·2H2O0.30g/L,pH7.4)洗涤菌体沉淀3次后再用1mL缓冲液A重悬。用超声破碎仪超声破碎上述菌悬液，工作条件为：功率350W，工作时间5sec，间隔时间10sec，5个循环，于冰上操作。取部分上述破碎液进行SDS-PAGE。经考马斯亮蓝染色后结果如图4所示，BL-IDO破碎液出现一条分子量约29.0kDa的条带，与L-异亮氨酸羟化酶理论分子量28.92kDa（含6×His标签）一致。
将剩余菌体破碎液离心后取上清液并采用Ni-NTA亲和层析法分离纯化重组L-异亮氨酸羟化酶，经透析、浓缩、SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色后出现分子量约为29kDa的单一条带（图4），采用BCA蛋白定量试剂盒测定其浓度为3.5mg/mL。
取适量重组酶液测定其酶活性。反应条件为：L-异亮氨酸10mmol/L，α-酮戊二酸10mmol/L，FeSO40.5mmol/L，抗坏血酸10mmol/L，重组L-异亮氨酸羟化酶酶液50μL（以加入等体积的缓冲液A为对照），用缓冲液A补充体积至1mL，于35℃反应30min后加入10μL乙酸终止反应。
采用2，4-二硝基氟苯对（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸标准品及取上述反应液衍生化后，采用高效液相色谱质谱联用仪对其进行鉴定。具体条件如下：色谱柱为AgilentZORBAXEclipsAAA(4.6×150mm，5-Micron)，柱温33℃，检测波长360nm。流动相A和B分别为浓度为50%的乙腈和乙酸盐缓冲液（50mmol/L，pH6.4），流速为1.0mL/min。质谱条件为：电喷雾离子源，正离子模式检测，毛细管电压为2000V，取样锥孔电压为15V，萃取锥孔电压为3V，离子源温度为120℃，去溶剂气温度为400℃，去溶剂气流速为400L/h，采用全扫描方式，扫描范围m/z=0～400。检测结果表明，经衍生化的标准品及重组L-异亮氨酸羟化酶酶液催化反应产物均出现保留时间为21.6min的色谱峰，而对照则无。分别将该色谱峰进行质谱分析，结果表明其质核比为311.9（图5），经鉴定为（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸与2,4-二硝基氟苯反应后生成的2,4-二硝基苯基-4-羟基异亮氨酸（其分子量为313.3），故证明ido基因所编码蛋白具有催化L-异亮氨酸生成（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸的活性。
实施例3：重组质粒pXMJ-ido及重组菌株CG-ido的构建（构建过程见图1）
以重组质粒pET-ido为模板、利用引物IDO-3和IDO-4、扩增其ido基因（ido基因PCR产物电泳图谱见图2）；
IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(SalⅠ)
IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoRⅠ)
PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为100μL。取10μLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
将剩余的90μLPCR扩增产物经回收后分别经SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，经电泳、切胶回收后连接至表达载体pXMJ19，获得重组质粒pXMJ-ido（酶切电泳图谱见图3）。然后将重组质粒pXMJ-ido其电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032细胞中，获得重组菌株CG-ido。
实施例4：（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的微生物转化
（1）种子培养：用接种环将1-2支经新鲜斜面活化的实施例3所得的重组菌株CG-ido接种至装有100mL种子培养基的1L挡板摇瓶，于32-37℃，200rpm振荡培养6-8h。
（2）菌体的发酵培养：以5%-10%接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度32-37℃，溶氧维持在20-40%，流加浓度为60-80%(W/V)的葡萄糖溶液，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵培养6-12h。按照10%接种量将一级种子液转接入5L自动发酵罐，装液量为3L，溶氧控制在20%-30%，培养温度33℃，pH控制在7.0左右。
（3）向发酵罐中添加等物质的量浓度的L-异亮氨酸和α-酮戊二酸无菌溶液，使其终浓度为0.1-0.3mol/L，按步骤（2）继续培养18-24h。
（4）采用2，4-二硝基氟苯对（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸衍生化后，以高效液相色谱法测定其的含量，具体条件如下：色谱柱为AgilentZORBAXEclipsAAA(4.6×150mm，5-Micron)，柱温33℃，检测波长360nm。流动相A和B分别为浓度为50%的乙腈和乙酸盐缓冲液（50mmol/L，pH6.4），流速为1.0mL/min。检测结果表明，（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸的出峰时间约为21.6-25.2min，产量为0.099-0.112mol/L，转化率为79.2-91.7%。
斜面培养成分为：葡萄糖1.0-5.0g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，NaCl2.0-3.0g/L，琼脂25g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
种子培养基成分为：葡萄糖25-30g/L，玉米浆15-30mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，KH2PO40.5-1.0g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，MnSO415-30mg/L，FeSO410-30mg/L，尿素2-5g/L。pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，K2HPO43.0-5.0g/L，MgSO41.0-2.0g/L，MnSO420-50mg/L，FeSO420-50mg/L，玉米浆20-50mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
实施例5：（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的微生物转化
（1）种子培养：用接种环将2支经新鲜斜面活化的转化有L-异亮氨酸羟化酶的细菌接种至装有100mL种子培养基的1L挡板摇瓶，于35℃，200rpm振荡培养8h。
（2）菌体的发酵培养：以8%接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度35℃，溶氧维持在30%，流加浓度为80%(W/V)的葡萄糖溶液，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至7.0，发酵培养6h。按照10%接种量将一级种子液转接入5L自动发酵罐，装液量为3L，溶氧控制在30%，培养温度35℃，pH控制在7.0。
（3）向发酵罐中添加等物质的量浓度的L-异亮氨酸和α-酮戊二酸无菌溶液，使其终浓度为0.125mol/L，按步骤（2）继续培养20h。经26h培养，CG-ido能够将89.2%的L-Ile化为4-羟基异亮氨酸。
（4）采用2，4-二硝基氟苯对（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸衍生化后，以高效液相色谱法测定其的含量，具体条件如下：色谱柱为AgilentZORBAXEclipsAAA(4.6×150mm，5-Micron)，柱温33℃，检测波长360nm。流动相A和B分别为浓度为50%的乙腈和乙酸盐缓冲液（50mmol/L，pH6.4），流速为1.0mL/min。检测结果表明，（2S，3R，4S）-4-异亮氨酸的出峰时间约为21.6min，产量为0.112mol/L，转化率为91.7%。
斜面培养成分为：葡萄糖4.0g/L，蛋白胨12.0g/L，牛肉膏12.0g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
种子培养基成分为：葡萄糖25g/L，玉米浆15mL/L，豆粕水解液15mL/L，KH2PO40.6，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO415mg/L，FeSO415mg/L，尿素2.5g/L。pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
发酵培养基成分为：葡萄糖80g/L，K2HPO43.5g/L，MgSO41.5g/L，MnSO425mg/L，FeSO425mg/L，玉米浆25mL/L，豆粕水解液15mL/L，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
实施例6：酶学性质测定
(1)酶活性分析
测定不同L-Ile浓度下实施例2所产酶的酶促反应速度，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法绘制曲线（图6）并获得方程1/V=48.25/[S]+0.32，经计算该酶的Km和Vmax分别为0.15mmol/L和3.13μmol/min/mg，与已报道的B.thuringiensis2-e-2的L-异亮氨酸羟化酶存在一定差异（其Km和Vmax分别0.27mmol/L和1.13μmol/min/mg），表明本研究获得的L-异亮氨酸羟化酶与底物的亲和度和催化效率均高于后者。
(2)最适反应温度
分别测定不同温度下实施例2所产酶相对活性，其活性随温度的升高而升高，当温度达到35℃时其活性最高（已报道的B.thuringiensis2-e-2的L-异亮氨酸羟化酶最适温度为25℃），随着温度的继续升高其活性迅速降低，当温度高于65℃时活性完全丧失（图7）。
(3)最适pH
在最适温度（35℃）条件下测定不同pH对实施例2所产酶活性的影响，pH7.0时活性最高（已报道的B.thuringiensis2-e-2的L-异亮氨酸羟化酶最适pH为6.0），当pH高于或低于7.0时，随着pH的偏离，其活性急剧下降（图8）。
(4)热稳定性
分别将实施例2所产酶于25℃、35℃和45℃放置不同时间以测定其热稳定性。结果表明，在前8h内，其在最适温度35℃下保持较高活性；随着时间的增加，3个温度下重组L-异亮氨酸羟化酶残留活性均呈现下降趋势，但25℃和35℃条件下酶活性下降缓慢，于35℃条件下处理5h后仍具有87.5%的活性。而45℃条件下活性下降最显著，在该温度下放置5h后其活性几乎完全丧失（图9）。
Claims (6)
1.一种编码L-异亮氨酸羟化酶的基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示。
2.权利要求1所述的基因编码的L-异亮氨酸羟化酶，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。
3.一种包含有权利要求1所述的基因的基因工程菌。
4.一种构建权利要求3所述基因工程菌的方法，步骤如下：
以权利要求1所述的L-异亮氨酸羟化酶编码基因为模板、以IDO-3和IDO-4为引物，进行PCR扩增；
IDO-3：5’-CCGGTCGACAAGGAAGCTAGATATGAAAATGAGTGGCTTTAGCATAG-3’(SalⅠ)
IDO-4：5’-CCGGAATTCTTATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA-3’(EcoRⅠ)
PCR条件为：94℃5min1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为100μL，取10μLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；
将PCR扩增产物经回收后分别经SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，经电泳、切胶回收后连接至表达载体pXMJ19，获得重组质粒，然后将其电转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032细胞中，获得重组菌株。
5.一种利用权利要求3所述菌株通过微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子培养：用接种环将1-2支经新鲜斜面活化的上述基因工程菌，接种至装有100mL种子培养基的1L挡板摇瓶，于32-37℃，200rpm振荡培养6-8h；
（2）菌体的发酵培养：以5%-10%接种量将步骤（1）的种子培养物接种至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发罐培养，发酵温度32-37℃，溶氧维持在20-40%，流加浓度为60-80%W/V的葡萄糖溶液，流加25%W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵培养6-12h，按照10%接种量将一级种子液转接入5L自动发酵罐，装液量为3L，溶氧控制在20%-30%，培养温度33℃，pH控制在7.0左右；
（3）向发酵罐中添加等物质的量浓度的L-异亮氨酸和α-酮戊二酸无菌溶液，使其终浓度为0.1-0.3mol/L，按步骤（2）继续培养18-24h。
6.如权利要求5所述的一种通过微生物转化法生产（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的方法，其特征在于：
所述斜面培养成分为：葡萄糖1.0-5.0g/L，蛋白胨10-15g/L，牛肉膏10-15g/L，NaCl2.0-3.0g/L，琼脂25g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min；
所述种子培养基成分为：葡萄糖25-30g/L，玉米浆15-30mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，KH2PO40.5-1.0g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.5g/L，MnSO415-30mg/L，FeSO410-30mg/L，尿素2-5g/L，pH7.0-7.2，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min；
所述发酵培养基成分为：葡萄糖60-80g/L，K2HPO43.0-5.0g/L，MgSO41.0-2.0g/L，MnSO420-50mg/L，FeSO420-50mg/L，玉米浆20-50mL/L，豆粕水解液15-30mL/L，0.075MPa高压蒸汽灭菌30min。
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