CN103860533A - β羟基丁酸在治疗帕金森病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了β羟基丁酸在帕金森病治疗中的应用。本发明经体外和体内药理学实验证实，β羟基丁酸降低帕金森病模型多巴胺神经元氧化应激，减少多巴胺神经元凋亡，减少PD动物模型黑质多巴胺神经元损毁，起到治疗帕金森病的作用。
Description
技术领域
本发明涉及β羟基丁酸的应用，具体涉及β羟基丁酸在帕金森病治疗中的应用。
背景技术
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是第二大常见的神经退行性疾病，人群患病率0.3%，65岁以上人群患病率1-3%。其病理特征是以Lewy小体形成，黑质致密区多巴胺神经元变性损毁为主要特征。
目前，PD的治疗主要是缓解运动症状，尚没有治愈的方法，临床用于治疗帕金森病的药物有复方左旋多巴制剂、抗胆碱能药物、金刚烷胺、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚⁃氧位⁃甲基转移酶抑制剂，以及神经保护剂等。左旋多巴(Levodopa，L-dopa)作为多巴胺前体，是PD治疗的最主要药物，通过提高多巴胺水平，缓解运动障碍，然而左旋多巴治疗的“蜜月期”一般为3-5 年，此后，患者常可出现运动波动或异动症等新的运动障碍。对于运动异常等并发症，目前认为主要由两方面原因引起，其一为左旋多巴半衰期短，在血液和脑组织内的浓度波动明显；其二为随病情进展，多巴胺能神经元不断变性、死亡导致其缓冲能力下降，造成对多巴胺受体的脉冲式刺激。然而，在持续多巴胺能刺激的治疗策略中，2007年，多巴胺受体激动剂培高利特在上市19 年后由于被发现具有损害心脏瓣膜的作用而退出市场。
PD病情进行性进展的关键是多巴胺神经元进行性损毁。目前PD的临床治疗不能阻止或减缓PD多巴胺神经元损毁的进行性发展，患者随着患病时间的延长病情逐渐加重。目前企待开发新的有效治疗PD的方法。
β羟基丁酸是机体能量代谢中间产物，在持续运动和禁食饥饿状态下的重要能源物质。饥饿状态下，肝脏增强脂肪酸代谢，血中β羟基丁酸升高至1-2 mM，长时间禁食，升高至6-8 mM以上。本发明人在研究中发现，β羟基丁酸减少PD模型多巴胺神经元活性氧(reactive oxygen species,
ROS)产生，减少PD模型多巴胺神经元凋亡和损毁，起到治疗帕金森病的作用。
发明内容
本发明公开了β羟基丁酸在治疗帕金森病中的应用。
具体的说，本发明提供了β羟基丁酸降低PD模型多巴胺神经元ROS产生，减少PD模型多巴胺神经元凋亡和损毁的用途。
本发明所述的药物β羟基丁酸通过市售得到。
本发明所述的PD模型为PD细胞模型和PD动物模型。
本发明所述的体外细胞PD模型为鱼藤酮PD细胞模型和MPP+(1-甲基-4-苯基吡啶离子)PD细胞模型。细胞为多巴胺神经元细胞株。
本发明所述的动物PD模型为单侧黑质立体定位注射鱼藤酮制备。
PD细胞模型中，β羟基丁酸的有效浓度范围为0.1-20 mM, 最佳浓度范围为1-5 mM。PD动物模型中β羟基丁酸的有效剂量范围为100-2000 mg/kg，最佳剂量范围为200-600 mg/kg。
本发明通过测定PD细胞模型多巴胺神经元活性氧ROS产生和细胞凋亡研究β羟基丁酸对体外PD细胞模型的作用。
本发明通过酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）免疫染色研究β羟基丁酸对PD动物模型黑质多巴胺神经元损毁的救援作用。
本发明中，β羟基丁酸治疗PD的优势在于：①β羟基丁酸降低PD模型多巴胺神经元ROS产生，②减少PD模型多巴胺神经元凋亡，③增加PD动物模型TH阳性细胞数，减少PD模型多巴胺神经元损毁。
本发明提供了β羟基丁酸的用途，即β羟基丁酸对PD的治疗用途。
附图说明
图1是β羟基丁酸减少鱼藤酮PD细胞模型多巴胺神经元凋亡。明亮的蓝色荧光染色表示凋亡细胞。
图2是β羟基丁酸减少MPP+ PD细胞模型多巴胺神经元凋亡。明亮的蓝色荧光染色表示凋亡细胞。
图3是β羟基丁酸减少鱼藤酮PD动物模型多巴胺神经元损毁。
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围。
本发明实施例中所使用的β羟基丁酸购自TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO。
实施例中，体外实验研究对象为多巴胺神经元细胞株SH-SY5Y，整体实验，研究对象为昆明种小鼠。
计量资料以均数±标准差表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析，p<0.05为有显著性差异。
实施例 1 ：β羟基丁酸减少鱼藤酮PD细胞模型多巴胺神经元ROS。
Day1：将培养于25cm2培养瓶的SH-SY5Y细胞制成细胞悬液，铺于6孔板中，每孔细胞大约1×106。
Day2：细胞融合约30-40%，给予β羟基丁酸，终浓度为1，2.5，5 mM。
Day3：24小时后加入鱼藤酮，终浓度为0.5 μM。
Day4：24小时后，吸出培养基，PBS清洗，加入1:1000用无血清培养基稀释的DCFH-DA荧光探针 1 ml，37℃孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3次，胰酶消化后，离心，1 ml PBS重悬，流式细胞仪检测DCF的荧光，结果见表1。
表1. β羟基丁酸对鱼藤酮PD细胞模型多巴胺神经元产生ROS影响（n=6）
| 组别 | ROS |
| 正常对照 | 231.61±34.24 |
| 鱼藤酮 | 2134.41±237.46 |
| β羟基丁酸 1 mM | 1347.43±149.62* |
| β羟基丁酸 2.5 mM | 847.26±102.43* |
| β羟基丁酸 5 mM | 443.14±60.84* |
注：*与鱼藤酮组比较，p<0.05。
实施例 2 ：β羟基丁酸减少MPP+ PD细胞模型多巴胺神经元ROS。
Day1：将培养于25cm2培养瓶的SH-SY5Y细胞制成细胞悬液，铺于6孔板中，每孔细胞大约1×106。
Day2：细胞融合约30-40%，给予β羟基丁酸，终浓度为1，2.5，5 mM。
Day3：24小时后加入MPP+，终浓度为1 mM。
Day4：24小时后，吸出培养基，PBS清洗，加入1:1000用无血清培养基稀释的DCFH-DA荧光探针 1 ml，37℃孵育30 min，无血清培养基洗涤细胞3次，胰酶消化后，离心，1 ml PBS重悬，流式细胞仪检测DCF的荧光，结果见表2。
表2. β羟基丁酸对MPP+ PD细胞模型多巴胺神经元产生ROS影响（n=6）
| 组别 | ROS |
| 正常对照 | 246.75±40.29 |
| MPP+ | 1743.48±219.76 |
| β羟基丁酸 1 mM | 1126.37±140.47* |
| β羟基丁酸 2.5 mM | 546.72±72.18* |
| β羟基丁酸 5 mM | 469.58±75.42* |
注：*与MPP+组比较，p<0.05。
实施例 3 ：β羟基丁酸对鱼藤酮PD细胞模型多巴胺神经元凋亡的影响。
细胞凋亡――Hoechst 33342染色检测
Day1：多巴胺神经元细胞株SH-SY5Y铺24孔板。
Day2：细胞融合约30-40%，给予β羟基丁酸，终浓度为1，2.5，5 mM。
Day3：24小时后加入鱼藤酮，终浓度为0.5 μM。
Day4：24小时后 Hoechst 33342染色，荧光显微镜检测细胞凋亡。
结果显示，鱼藤酮PD细胞模型凋亡明显，而预先给予β羟基丁酸减少鱼藤酮诱导的细胞凋亡（见图1）。
细胞凋亡――PI流式检测
Day1：将培养于25cm2培养瓶的SH-SY5Y细胞制成细胞悬液，铺于6孔板中，每孔细胞大约1×106。
Day2：细胞融合约30-40%，给予β羟基丁酸，终浓度为1，2.5，5 mM。
Day3：24小时后加入鱼藤酮，终浓度为0.5 μM。
Day4：24小时后，吸出培养基，PBS清洗，胰酶消化后，离心，加入1 ml 70%冷乙醇重悬，4℃固定过夜。
Day5：将70%冷乙醇固定的细胞离心，弃去乙醇，1 ml PBS重悬5 min，离心，1 ml PI染液重悬，4℃避光孵育30 min，400目的尼龙网过滤，流失细胞仪检测。结果见表3。
表3. β羟基丁酸对鱼藤酮PD细胞模型多巴胺神经元的细胞凋亡（PI染色流式测定）影响（n=6）
| 组别 | 凋亡率(%) |
| 正常对照 | 0.25 ±0.28 |
| 鱼藤酮 | 8.85 ±2.49 |
| β羟基丁酸 1 mM | 5.35±2.13 |
| β羟基丁酸 2.5 mM | 2.46±1.81* |
| β羟基丁酸 5 mM | 2.14±1.43* |
注：*与鱼藤酮组比较，p<0.05。
实施例 4 ：β羟基丁酸减少MPP+ PD细胞模型多巴胺神经元凋亡的影响。
细胞凋亡――Hoechst 33342染色检测
Day1：多巴胺神经元细胞株SH-SY5Y铺24孔板。
Day2：细胞融合约30-40%，给予β羟基丁酸1，2.5，5 mM。
Day3：24小时后加入MPP+，终浓度为1 mM。
Day4：24小时后 Hoechst 33342染色，荧光显微镜检测细胞凋亡。
结果显示，MPP+ PD细胞模型凋亡明显，而预先给予β羟基丁酸减少MPP+诱导的细胞凋亡（见图2）。
细胞凋亡――PI流式检测
Day1：将培养于25cm2培养瓶的SH-SY5Y细胞制成细胞悬液，铺于6孔板中，每孔细胞大约1×106。
Day2：细胞融合约30-40%，给予β羟基丁酸，终浓度为1，2.5，5 mM。
Day3：24小时后加入MPP+，终浓度为1 mM。
Day4：24小时后，吸出培养基，PBS清洗，胰酶消化后，离心，加入1 ml 70%冷乙醇重悬，4℃固定过夜。
Day5：将70%冷乙醇固定的细胞离心，弃去乙醇，1 ml PBS重悬5 min，离心，1 ml PI染液重悬，4℃避光孵育30 min，400目的尼龙网过滤，流失细胞仪检测(结果见表4)。
表4. β羟基丁酸对MPP+ PD细胞模型多巴胺神经元的细胞凋亡（PI染色流式测定）影响（n=6）
| 组别 | 凋亡率(%) |
| 正常对照 | 0.37 ±0.31 |
| MPP+ | 10.35 ±3.18 |
| β羟基丁酸 1 mM | 6.26±3.27 |
| β羟基丁酸 2.5 mM | 3.82±2.91* |
| β羟基丁酸 5 mM | 2.49±2.16* |
注：*与MPP+组比较，p<0.05。
实施例 5 ：β羟基丁酸救援鱼藤酮PD动物模型。
动物分组：DMSO右侧黑质定位注射组，鱼藤酮右侧黑质定位注射PD模型组，β羟基丁酸干预组。
右侧黑质脑立体定位注射，坐标：(1)前囟门后3.0 mm，(2) 外侧向中线1.3 mm，(3) 头骨表面腹侧4.7 mm。给予鱼藤酮0.5 μg（0.5 μl）或DMSO 0.5 μl每只。β羟基丁酸干预组应用鱼藤酮同PD模型组，同时每天给予β羟基丁酸300 mg，腹腔注射。8周后, 开始在50×50cm 的空旷区域内测试由阿朴***(apomorphine, APO)诱发的旋转行为（结果见表5）。
表5. β羟基丁酸对鱼藤酮PD动物模型阿扑***诱导旋转的影响（n=6）
| 组别 | 旋转（转/5 min） |
| 正常对照 | 3.7±3.5 |
| 鱼藤酮 | 46.0±4.2 |
| β羟基丁酸 | 17.2±3.5* |
注：*与鱼藤酮组比较，p<0.05。
8周后，酪氨酸氧化酶（TH）免疫组织化学染色，结果显示，鱼藤酮右侧黑质定位注射PD模型组，右侧黑质TH免疫活性降低，多巴胺神经元细胞明显破坏。β羟基丁酸显示出明显的救援作用，TH免疫活性接近对照侧，（见图3）。
Claims (3)
1.β羟基丁酸在治疗帕金森病中的应用。
2.权利要求1所述的β羟基丁酸在治疗帕金森病中的应用，其特征在于β羟基丁酸降低帕金森病模型多巴胺神经元活性氧产生。
3.权利要求1所述的β羟基丁酸在治疗帕金森病中的应用，其特征在于β羟基丁酸减少帕金森病模型多巴胺神经元凋亡，增加帕金森病动物模型黑质TH免疫染色，减少多巴胺神经元损毁。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈鑫: "生酮饮食在帕金森病的神经保护作用", 《立体定向和功能性神经外科杂志》, vol. 23, no. 1, 28 February 2010 (2010-02-28), pages 52 - 54 * |
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