CN103834680A - 一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法，该方法包括用农杆菌转化完整的裂壶藻细胞。本发明还包括制备转基因裂壶藻的方法以及将目标基因转入裂壶藻的方法。本发明还包括用于上述方法的裂壶藻培养基。本发明的方法避免了已公开的电击转化或农杆菌介导的原生质体转化法中原生质体的制备过程，且获得了更高的转化效率。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及用农杆菌介导对裂壶藻进行基因转化的方法。
背景技术
裂壶藻（Schizochytrium）具有很强的DHA合成能力。Schizochytrium sp.ATCC 20888（Schizochytrium sp.S31,US5130242-1992）在葡萄糖培养基中能够实现221g/L生物量的发酵水平（CN01806451.5），在甘油培养基中也能够实现145g/L的生物量水平（US20090209014）并积累细胞干重大量的油脂。裂壶藻如此强的生产能力，显然是异源基因重组表达的潜力宿主。裂壶藻的分类目前还不完善，研究者先后提出的Schizochytrium aggregatum，Schizochytrium minutum Schizochytrium octosporum，Schizochytriummangroei，Schizochytriumlimacinum都有待调整（Yokoyama Rinka & HonaDaiske.Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu latobased on morphology,chemotrxonomic characteristics,and 18S rRNA genephylogeny(Thraustochytriaceae,Labyrinthulomycetes):emendation forSchizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.)Mycoscience,2007 48:199-211），现在确定该属有Schizochytriumaggregatum种（代表株ATCC 28209），常见的ATCC 20888、ATCC 20889、ATCC20111、FJU-512、SR21等暂时都视为独立的种。一般培养裂壶藻使用50%的海水或人造海水（海盐兑水而成），培养基中盐分主要成分为NaCl，约240mM。裂壶藻ATCC20888菌株能够特异地在非氯钠盐培养基中生长，且能在高达22.7g/L（培养基中钠离子浓度316mM）的Na2SO4中生长旺盛。
将外源基因导入宿主细胞中，通常有基因枪、电击转化、化学转化、病毒转化和农杆菌转化等方法，适用于不同的载体和宿主***。对裂壶藻而言，已经有公开的转化方法有基因枪法（particle bombardment）（CN1556850A）和原生质体（Streptomyces greiseus protease XIV酶解）电击转化法（electroporation）（US 2010/0266546A1），上述两种转化方法都未提及转化效率数据。不过，本领域研究人员熟知，基因枪、电击两种转化方法都无法控制进入宿主细胞载体的拷贝数，而利用宿主自身原件构建非转基因生物是避免食品安全风险的重要手段，但上述转化方法很容易引发非期望位点的遗传重组，从而给某些转基因应用带来困扰。如重组改造应用或异源表达中，内源性原件位点的额外***会干扰所在位点基因的活性，从而影响重组藻的生长。农杆菌（Agrobacterium）介导的转化中，其T-DNA一般以单拷贝的方式整合到受体菌中，因而能可控地产生重组菌。目前国内海洋三所公开了农杆菌LBA4404转化裂壶藻原生质体的方法（CN102220359A），每107个裂壶藻细胞可得到100个以上的转化子。相同作者发表的文章中，农杆菌转化裂壶藻原生质体，每个平板获得菌落约60个（农杆菌EHA105转化）和约170个(农杆菌LBA4404转化)（Rubin Cheng,Ruijuan Ma,Ke Li,Hui Rong,Xiangzhi Lin,ZhaokaiWang,Shanjun Yang,Yong Ma，2012 Agrobacterium tumefaciens mediatedtransformation of marine microalgae Schizochytrium.MicrobiologicalResearch 167:179-186）。除了酶解成本外，该方法的不足还包括原生质体制备麻烦：摇动、离心、移液枪吹打、洗涤、涂布都会破坏原生质体，原生质体间可能会发生融合，细胞壁再生效率影响转化效率等。
因此，本领域仍然需要一种以更高的转化效率将外源基因转入裂壶藻宿主细胞的方法。
发明内容
本发明提供一种对裂壶藻进行基因转化的方法，所述方法包括使用含目标基因的重组农杆菌转化完整的裂壶藻细胞的步骤。
本发明提供一种制备重组裂壶藻的方法，所述方法包括使用含目标基因的重组农杆菌转化完整的裂壶藻细胞的步骤。
本发明提供一种将目标基因转入裂壶藻的方法，所述方法包括使用含目标基因的重组农杆菌转化完整的裂壶藻细胞的步骤。
使用农杆菌转化完整的裂壶藻细胞的方法包括：
（1）分别培养裂壶藻细胞和农杆菌到对数期；
（2）取步骤（1）所得的对数期裂壶藻细胞及农杆菌混匀，将混合物涂布在诱导平板上孵育；和
（3）收获共孵育菌体，将其涂布到选择平板上；
由此获得转入了转化的裂壶藻。
在一具体实施例中，所述裂壶藻为产油脂裂壶藻。
在其它实施例中，所述裂壶藻为表达外源蛋白的裂壶藻。
在某些实施例中，所述裂壶藻为低产油脂的裂壶藻菌株，可用于例如产生外源酶蛋白。
在一具体实施例中，所述裂壶藻选自Schizochytrium sp.ATCC 20888、Schizochytrium S8（ATCC 20889）、Schizochytrium ATCC 28209、Schizochytrium SR21（ATCC MYA-1381）、Schizochytrium sp.NBRC102615、Schizochytrium sp.NBRC 102617、Schizochytrium sp.BAFCcult 3502、Schizochytrium sp.BAFCcult 3511、Schizochytrium sp.BL4、Schizochytriumsp.BR2.1.2、Schizochytrium sp.BUCAAA 032、Schizochytrium sp.BUCAAA093、Schizochytrium sp.BUCACD 152、Schizochytrium sp.BUCARA 021、Schizochytrium sp.BUCHAO 113、Schizochytrium sp.BURABQ 133、Schizochytrium sp.BURARM 801、Schizochytrium sp.BURARM 802、Schizochytrium sp.FJU-512、Schizochytrium sp.KH105、Schizochytriumsp.KR-5、Schizochytrium sp.KRT1、Schizochytrium sp.KRT2、Schizochytrium sp.PJ10.4、Schizochytrium sp.SBL1、Schizochytrium sp.SBL2、Schizochytrium sp.SBL3、Schizochytrium sp.SEK 210、Schizochytriumsp.SEK 345、Schizochytrium sp.SEK 346、Schizochytrium sp.SKA10、Schizochytrium sp.SKA6、Schizochytrium sp.SR21和Schizochytrium sp.TIO01。
在一具体实施例中，所述农杆菌选自根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）。
在一具体实施例中，所述农杆菌选自根癌农杆菌EHA105、EHA101、LBA4404、AGL-0、AGL-1、NT1、C58-Z707和GV3101::pMP90。
在一具体实施例中，所述转化包括将对数期的裂壶藻细胞与对数期的农杆菌混合共培养的步骤。
在一具体实施例中，通过使用钠离子浓度为0.240摩尔/升以上的裂壶藻培养基培养裂壶藻细胞，获得所述对数期的裂壶藻细胞。
在一具体实施例中，所述对数期的裂壶藻细胞培养物的OD600为1.0-1.5。
在一具体实施例中，所述裂壶藻培养基含有：葡萄糖、L-谷氨酸单钠、酵母粉、磷酸氢二钾、硫酸钠或氯化钠、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、痕量盐储液和维生素储液，pH约6.5-7.5，优选约7.0。
在一具体实施例中，所述痕量盐储液含有EDTA二钠、氯化铁、硼酸、氯化锰、氯化锌、硫酸镍、硫酸铜和锰酸钠。
在一具体实施例中，所述维生素储液可含有VB1、生物素和/或VB12。
在一具体实施例中，所述裂壶藻培养基含有：葡萄糖20-40g/L；L-谷氨酸单钠15-25g/L；酵母粉0.1-0.5g/L；磷酸氢二钾0.3-0.7g/L；硫酸钠10-15g/L，或能提供相同的钠离子量的氯化钠；硫酸镁1.0-1.5g/L；氯化钾0.1-0.5g/L；氯化钙0.03-0.07g/L；碳酸氢钠0.05-0.20g/L；痕量盐储液0.5-2ml/L，其中EDTA二钠3-9g/L、氯化铁0.1-0.4g/L、硼酸5-8g/L、氯化锰0.5-1.2g/L、氯化锌0.03-0.09g/L、硫酸镍0.01-0.05g/L、硫酸铜0.001-0.003g/L和锰酸钠0.002-0.008g/L；和维生素储液0.5-2ml/L，其中VB1 50-200mg/L、生物素0.3-0.8mg/L和VB12 0.3-0.8mg/L。
在一具体实施例中，所述培养基中含有8-30g/L的硫酸钠。
在一具体实施例中，所述裂壶藻培养基含有：酵母粉5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，葡萄糖10-30g/L，30%-70%海水，pH6.2-6.8。
在一具体实施例中，所述对数期的农杆菌培养物的OD600为0.3-1.5。
在一具体实施例中，所述共培养在含有盐储液、甘油、水、琼脂、2-吗啉乙磺酸和葡萄糖的诱导培养基中进行。
在一具体实施例中，所述共培养包括在28℃左右培养箱中培养对数期的裂壶藻细胞与对数期的农杆菌的混合物15-30小时。
在一具体实施例中，所述方法还包括：在含30-80μg/ml重组农杆菌载体所携带的抗生素标记及100-300μg/ml头孢噻肟的裂壶藻培养基中选择转入了所述基因的裂壶藻细胞的步骤。
在一具体实施例中，对数期的农杆菌培养物的OD600为0.3-0.6，诱导培养基中不含有乙酰丁香酮。
本发明还提供一种裂壶藻培养基，所述培养基含有：葡萄糖、酵母粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、痕量盐储液、维生素储液以及用于提供钠离子的钠盐，pH在6.5～7.5之间，其中，钠离子浓度为0.240摩尔/升以上。
在一具体实施例中，所述用于提供钠离子的钠盐选自：Na2SO4、L-谷氨酸单钠和NaCl。
在一具体实施例中，所述培养基含有：葡萄糖20-40g/L；L-谷氨酸单钠15-25g/L；酵母粉0.1-0.5g/L；磷酸氢二钾0.3-0.7g/L；硫酸钠10-15g/L，或能提供相同的钠离子量的氯化钠；硫酸镁1.0-1.5g/L；氯化钾0.1-0.5g/L；氯化钙0.03-0.07g/L；碳酸氢钠0.05-0.20g/L；痕量盐储液0.5-2ml/L，其中EDTA二钠3-9g/L、氯化铁0.1-0.4g/L、硼酸5-8g/L、氯化锰0.5-1.2g/L、氯化锌0.03-0.09g/L、硫酸镍0.01-0.05g/L、硫酸铜0.001-0.003g/L和锰酸钠0.002-0.008g/L；和维生素储液0.5-2ml/L，其中VB150-200mg/L、生物素0.3-0.8mg/L和VB12 0.3-0.8mg/L。
本发明还提供一种裂壶藻培养基，所述培养基含有：酵母粉5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，葡萄糖10-30g/L，30%-70%海水，pH6.2-6.8。
本发明方法可以使用农杆菌转化完整的裂壶藻细胞，避免了已公开的电击转化或农杆菌介导的原生质体转化法中原生质体的制备过程，获得了更高的转化效率〔约105个裂壶藻细胞可得到50个以上转化子，为已公开的原生质体转化方法中每105个细胞得到1个以上转化子（见CN102220359A）的50倍〕，且乙酰丁香酮不是裂壶藻转化必须的。
附图简述
图1显示通过PCR扩增GUS基因鉴定重组裂壶藻的结果。“S”为野生型裂壶藻；“农菌液”为转化用农杆菌菌液；“农菌落”为转化用农杆菌菌落；“共铺板”为共同涂板诱导。红框标出阳性PCR产物，表明该样品中含有目的基因。
图2显示通过PCR扩增zeocin基因鉴定重组裂壶藻的结果。阴性对照为出发菌株，框显示为阳性PCR产物，表明含有目的基因。
图3显示ABH03农杆菌转化所得裂壶藻菌落PCR条带测序结果（测序所得序列见SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3）。
图4显示GUS染色结果。1-3分别为实施例二所得重组裂壶藻和实施例四所得重组裂壶藻及野生型裂壶藻。所用样品湿重相当。
具体实施方案
本发明方法转化的裂壶藻包括但不限于Schizochytrium sp.ATCC 20888、Schizochytrium S8（ATCC 20889）、Schizochytrium ATCC 28209、Schizochytrium SR21（ATCC MYA-1381）、Schizochytrium sp.NBRC102615、Schizochytrium sp.NBRC 102617、Schizochytrium sp.BAFCcult 3502、Schizochytrium sp.BAFCcult 3511、Schizochytrium sp.BL4、Schizochytriumsp.BR2.1.2、Schizochytrium sp.BUCAAA 032、Schizochytrium sp.BUCAAA093、Schizochytrium sp.BUCACD 152、Schizochytrium sp.BUCARA 021、Schizochytrium sp.BUCHAO 113、Schizochytrium sp.BURABQ 133、Schizochytrium sp.BURARM 801、Schizochytrium sp.BURARM 802、Schizochytrium sp.FJU-512、Schizochytrium sp.KH105、Schizochytriumsp.KR-5、Schizochytrium sp.KRT1、Schizochytrium sp.KRT2、Schizochytrium sp.PJ10.4、Schizochytrium sp.SBL1、Schizochytrium sp.SBL2、Schizochytrium sp.SBL3、Schizochytrium sp.SEK 210、Schizochytriumsp.SEK 345、Schizochytrium sp.SEK 346、Schizochytrium sp.SKA10、Schizochytrium sp.SKA6、Schizochytrium sp.SR21、Schizochytrium sp.TIO01等。
可用于本发明方法的农杆菌可以是本领域已知的各种用于基因转化的农杆菌，包括但不限于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105、EHA101、LBA4404、AGL-0、AGL-1、NT1、C58-Z707、GV3101::pMP90等。
本发明方法中，使用农杆菌转化完整的裂壶藻细胞。“完整的裂壶藻细胞”指细胞结构完整，包括细胞壁、细胞膜等裂壶藻细胞应有的结构。更具体而言，完整的裂壶藻细胞不是裂壶藻原生质体，后者经处理而不含有细胞壁。
本发明中，农杆菌含有感兴趣的目标基因。所述目标基因可以是任意脱氧核糖核酸。所述目标基因相对于待转化的裂壶藻而言可以是外源的，即该裂壶藻自身不存在的；也可以是内源的，即符合裂壶藻本身遗传信息的核酸。所述目标基因包括但不限于具有生物学活性的核酸，如蛋白编码基因、用于调控基因转录的核酸等；以及不具备生物活性的核酸，如应用于基因整合、敲除的核酸片段。在某些实施例中，目标基因编码感兴趣的酶和各种功能蛋白。
1．培养对数期的裂壶藻
可采用常规的条件，例如培养时间、接种量、温度等，来培养裂壶藻至对数期。
培养裂壶藻的培养基宜是含有高浓度钠离子的培养基。在优选的实施例中，培养基中钠离子浓度为0.240摩尔/升以上。在其它实施例中，培养基中钠离子浓度为0.240～1.000摩尔/升，例如0.240～0.800摩尔/升、0.240～0.700摩尔/升、0.240～0.550摩尔/升、0.240～0.450摩尔/升、0.240～0.425摩尔/升、0.240～0.420摩尔/升不等。在其它实施例中，培养基中钠离子浓度为0.250～1.000摩尔/升，例如0.250～0.800摩尔/升、0.300～0.800摩尔/升、0.350～0.700摩尔/升、0.250～0.425摩尔/升、0.250～0.420摩尔/升不等。
对钠离子来源并无特殊限制。例如，可用Na2SO4、NaCl、海水、海盐或作为裂壶藻生长营养素的钠盐（如L-谷氨酸单钠等氨基酸钠盐）来提供钠离子。例如，可将钠盐如Na2SO4、NaCl等或其混合物加到培养基中，以提供钠离子。在一个实施例中，通过在培养基中加入海水来提供钠离子。在一个实施例中，提供L-谷氨酸单钠与Na2SO4的混合物来提供0.240～0.800摩尔/升、优选0.240～0.550摩尔/升、更优选0.240～0.425摩尔/升的钠离子。在一个具体实施例中，裂壶藻培养基中，Na2SO4提供大约45-75％的钠离子，而L-谷氨酸单钠提供大约25-55％的钠离子。在另一个具体实施例中，Na2SO4提供大约55-75％的钠离子，而L-谷氨酸单钠提供大约25-45％的钠离子。在一具体实施例中，NaCl提供大约55-75％的钠离子，而L-谷氨酸单钠提供大约25-45％的钠离子。
本发明使用的裂壶藻培养基（在本文中可称为“FJS培养基”）含有：葡萄糖、L-谷氨酸单钠、酵母粉、磷酸氢二钾、硫酸钠、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、痕量盐储液和维生素储液等，pH 6.5～7.5。该培养基中，钠离子浓度为0.240摩尔/升以上。
用于本发明各种裂壶藻培养基中的痕量盐储液可含有EDTA二钠、氯化铁、硼酸、氯化锰、氯化锌、硫酸镍、硫酸铜和锰酸钠等。
用于本发明各种裂壶藻培养基中的维生素储液可含有VB1、生物素和VB12等。
在一个具体实施例中，本发明的裂壶藻FJS培养基含有：葡萄糖20-40g/L；L-谷氨酸单钠15-25g/L；酵母粉0.1-0.5g/L；磷酸氢二钾0.3-0.7g/L；硫酸钠10-15g/L；硫酸镁1.0-1.5g/L；氯化钾0.1-0.5g/L；氯化钙0.03-0.07g/L；碳酸氢钠0.05-0.20g/L；痕量盐储液0.5-2ml/L（EDTA二钠3-9g/L；氯化铁0.1-0.4g/L；硼酸5-8g/L；氯化锰0.5-1.2g/L；氯化锌0.03-0.09g/L；硫酸镍0.01-0.05g/L；硫酸铜0.001-0.003g/L；锰酸钠0.002-0.008g/L）；维生素储液0.5-2ml/L（VB1 50-200mg/L；生物素0.3-0.8mg/L；VB12 0.3-0.8mg/L）。
在另一具体实施例中，本发明的裂壶藻FJS培养基含有：葡萄糖30g/L；L-谷氨酸单钠21g/L；酵母粉0.3g/L；磷酸氢二钾0.5g/L；硫酸钠12.6g/L；硫酸镁1.2g/L；氯化钾0.25g/L；氯化钙0.05g/L；碳酸氢钠0.1g/L；痕量盐储液1ml/L（EDTA二钠6g/L；氯化铁0.2g/L；硼酸6.84g/L；氯化锰0.86g/L；氯化锌0.06g/L；硫酸镍0.026g/L；硫酸铜0.002g/L；锰酸钠0.005g/L）；维生素储液1ml/L（VB1 100mg/L；生物素0.5mg/L；VB12 0.5mg/L）；用氢氧化钾调pH到7.0。
可通过添加适量琼脂粉（例如加入大约1.8％的琼脂粉）来配置固体FJS培养基。
若本发明的FJS培养基作为选择培养基使用，则可在FJS培养基中添加适量的抗生素和头孢噻肟钠。例如，可加入约30-200μg/ml的潮霉素和约150-300μg/ml的头孢噻肟钠。
在一具体实施例中，本发明FJS培养基中含有约8-30g/L的硫酸钠。在一具体实施例中，FJS培养基中的Na2SO4为22.7g/L。在另一具体实施例中，FJS培养基中的Na2SO4改为8.24g/L，使总Na+为0.24摩尔/升。
用于培养裂壶藻的培养基的另一例子是含有以下成分的培养基（在本文中也称为“YPD培养基”）：酵母粉5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，葡萄糖10-30g/L，30%-70%海水，pH6.2-6.8。通过调节海水的量，使钠离子浓度满足本发明要求，达0.240摩尔/升以上。
在一具体实施例中，裂壶藻YPD培养基含有酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，50%海水，pH6.2-6.8。其中Na+约为240mM。
在另一实施例中，使用氯化钠替换FJS培养基中的硫酸钠。例如，可在FJS培养基中含有适量的氯化钠，使钠离子浓度满足本发明要求。在一具体实施例中，FJS培养基中的Na2SO4换成等钠的NaCl，为10.28g/L。
在另一实施例中，发明人进一步提高Na+浓度，结果显示，Na+浓度为300mM、453mM均表现出良好的效率。
通常，将裂壶藻从甘油管中转接到裂壶藻培养基中，25-30℃、100-300rpm培养数天（例如1-5天左右）作为种子液。然后将种子液转接到新鲜培养基中，培养基中Na+浓度优选高于240mM。转接量5-10%(V/V)，培养时间约6-8h至OD6001.0-1.5，优选OD600 1.0-1.2。如本申请实施例所证明的，当裂壶藻OD600为1.0-1.2时，诱导物乙酰丁香酮浓度从0到250μM都能获得很高的转化效率。
由此培养获得的裂壶藻可用于转化。
2．培养对数期的农杆菌
可采用常规的条件培养农杆菌至对数期。将外源基因转入农杆菌可使用公知的液氮速冻后接37℃水浴热激的方法。
在本发明中，可使用Luria-Bertani培养基来培养农杆菌，该培养基含有：酵母提取物3-7g/L；蛋白胨5-15g/L；NaCl 5-15g/L，pH约7.0。
在一具体实施例中，该培养基含有：酵母提取物5g/L；蛋白胨10g/L；NaCl10g/L，pH7.0。
通常，可从甘油管中接种重组农杆菌到约5ml LB培养液中（含30-100μg/ml卡那霉素），25-28℃、100-300rpm摇床培养约18-32h，1-5%转接到新50ml培养基中，25-28℃、100-300rpm培养约4-8天至OD600约0.3-1.5，优选OD600 0.3-0.6。如此培养所得可的农杆菌可用于转化裂壶藻。
3．混合并孵育对数期裂壶藻和对数期农杆菌
可使用诱导培养基来分别洗涤、重悬培养至对数期的裂壶藻细胞和农杆菌。具体而言，可使用诱导培养基洗涤对数期农杆菌，然后用诱导培养基重悬。重悬后的体积一般取决于用来收集的菌液量，一般约是原菌液体积的1/20。可使用诱导培养基洗涤对数期裂壶藻，然后重悬到0.8-1.2×1010个/ml（重悬到1.5-2.5ml）。通常取等体积的两种悬液混匀。但也可取不同体积比的两种悬液混匀。
用于本发明的诱导培养基IM通常含有盐储液、甘油、水、琼脂、MES（2-吗啉乙磺酸）和葡萄糖。IM中可含有乙酰丁香酮，也可不含有。如本申请实施例所证明的，当使用OD600 0.3-0.6的农杆菌进行转化时，使用不含有乙酰丁香酮的IM也可获得较高的转化率。若含有诱导物乙酰丁香酮，则其浓度可为200～400μM。
在一具体实施例中，IM含有50-100ml盐储液、0.5-3ml甘油、50-150ml水、1.0％-2.0％琼脂和5-15ml的0.5-2M的MES、2-10ml的200-700mM葡萄糖。
用于本发明各种IM中的盐储液可含有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和硫酸铵。其含量可以是，例如，磷酸二氢钾3-5g/L、磷酸氢二钾3-7g/L、氯化钠0.1-0.5g/L、硫酸镁0.8-1.8g/L、氯化钙0.1-0.3g/L、硫酸亚铁0.0030-0.0090g/L和硫酸铵0.8-1.8g/L。
在一具体实施例中，用于本发明各种IM中的盐储液含有磷酸二氢钾3.625g/L；磷酸氢二钾5.125g/L；氯化钠0.375g/L；硫酸镁1.25g/L；氯化钙0.165g/L；硫酸亚铁0.0062g/L；硫酸铵1.25g/L。
配置本发明的IM时，可先混合盐储液、甘油、水和琼脂，高压灭菌冷却后再加入0.22μm滤膜过滤除菌的MES溶液和葡萄糖溶液以及任选的乙酰丁香酮。
用于实施本发明方法的一种具体IM含有：80ml盐储液（磷酸二氢钾3.625g/L；磷酸氢二钾5.125g/L；氯化钠0.375g/L；硫酸镁1.25g/L；氯化钙0.165g/L；硫酸亚铁0.0062g/L；硫酸铵1.25g/L），1ml甘油，103ml水，1.6%琼脂，高压灭菌冷却后加入8ml 1M MES，4ml 500mM葡萄糖和4ml 1.96mg/ml乙酰丁香酮。
可采用常规的方式混匀裂壶藻悬液和农杆菌悬液，并取适量混合菌液（例如30-80μl，如50μl）涂布到含有诱导培养基的诱导培养平板上。可采用常规平板制备方法来制备所述诱导培养平板，每板可含有15-20ml的诱导培养基。然后28℃左右培养箱中培养15-30小时。
4．对诱导后的裂壶藻进行选择
诱导孵育后，使用生理盐水洗下诱导培养平板上的菌苔，无菌生理盐水重悬到约2ml，取约20μl涂布FJS选择平板（含30-80μg/ml裂壶藻选择抗生素（即重组农杆菌载体所携带的抗生素标记）及100-300μg/ml头孢噻肟），25-28℃培养2-3天。从而收获转入了外源基因的裂壶藻。
可采用本领域周知的各种方法验证外源基因是否已转入裂壶藻细胞中，这些方法包括但不限于抗性、PCR方法验证、核酸杂交等。
应理解，虽然上述对培养基的各成分和含量进行了描述，但本领域技术人员可根据实际需要对其成分和含量做出适当改动。下文将以具体实施例的方式描述本发明。实施例中所用的试剂、反应条件等，除非另有说明，否则均为本领域常规的试剂和反应条件。
实施例一：重组农杆菌以及裂壶藻宿主细胞的准备
通过设计引物（ZEOU:AAAACTCGAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC;ZEOD：AAAACTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA，即下文的SEQ ID NO:6和7），在zeocin抗性基因上下游分别增加XhoI酶切位点，以商业载体pGAPZαA（购自普如汀生物技术（北京）有限公司）为模板，扩增zeocin基因并将PCR产物构建到pUCm-T载体（购自生工生物工程（上海）有限公司）中测序。使用XhoI限制性内切酶处理pUCm-T-zeo及pCAMBIA1301（Cambia，货号CPC054）两个载体，将zeo基因取代pCAMBIA1301中的hygromycin抗性基因。构建的pCAMBIA1301zeo及pCAMBIA1301两个载体通过液氮速冻、水浴热激方式转入农杆菌EHA105（普如汀生物技术（北京）有限公司）中：
1、按照公知的NaCl、CaCl2溶液处理的方法制备农杆菌感受态（李明刚.植物基因操作原理与技术(第一版).天津:天津科学技术出版社,2000:180-181）；200μl/管分装，液氮速冻后保存在超低温冰箱中。
2、取感受态细胞，冰上融化后各加入3μl上述重组载体，混匀、冰浴30分钟。
3、将步骤2的离心管浸入液氮中速冻1分钟，然后立即放入37℃水浴中热激3分钟，冰浴2分钟后加入1ml YEP液体培养基，在28℃、180rpm摇床振荡培养3-4h。
4、涂布步骤3的菌液到含有50μg/ml利福平及50μg/ml卡那霉素的YEP平板上，28℃培养箱培养48h。得到含有pCAMBIA1301载体的重组农杆菌AB1301-9及含有pCAMBIA1301zeo载体的重组农杆菌ABH03。
裂壶藻宿主细胞为ATCC20888株复筛所得，复筛步骤如下：
1、原始菌株10倍梯度稀释涂平板，28℃培养箱培养5天后挑出菌落最大的36个单菌落；
2、单菌落筛选所得单克隆接种到液体发酵培养基中培养并转接，分析种子液、发酵终液OD620值，检测生长情况，选出两代培养液OD值最高的8株菌；分析其生物量干重，挑选出干重数据最大的一株；
3、将所得生物量干重最大菌株菌落进行梯度稀释并涂布平板，最先生长出来的、直径较大的、富有油渍感的菌落并接种到液体培养基中培养；选择生物量最大的9株菌；
4、分析这9株菌发酵物的生物量及脂质组成，获得生产性能最好的一株。
实施例二
FJS培养基配方如下：葡萄糖30g/L；L-谷氨酸单钠21g/L；酵母粉0.3g/L；磷酸氢二钾0.5g/L；硫酸钠12.6g/L；硫酸镁1.2g/L；氯化钾0.25g/L；氯化钙0.05g/L；碳酸氢钠0.1g/L；痕量盐储液1ml/L（EDTA二钠6g/L；氯化铁0.2g/L；硼酸6.84g/L；氯化锰0.86g/L；氯化锌0.06g/L；硫酸镍0.026g/L；硫酸铜0.002g/L；锰酸钠0.005g/L）；维生素储液1ml/L（VB1 100mg/L；生物素0.5mg/L；VB12 0.5mg/L）；用氢氧化钾调pH到7.0。
IM培养基配方如下：MES 7.8g/L、葡萄糖2g/L、硫酸铵0.52g/L、甘油0.5g/L、氯化钙0.078g/L、硫酸亚铁0.0025g/L、氯化钠0.15g/L、硫酸镁0.25g/L、磷酸氢二钾2.28g/L、磷酸二氢钾1.36g/L，pH5.3。
1、将1.5ml裂壶藻菌液（ATCC 20888）接种到50ml FJS培养液中（250ml挡板三角瓶），28℃200rpm摇床培养48h作为种子液；然后按10%比例转接到新的50ml FJS培养液中（250ml挡板三角瓶），28℃200rpm培养约8h至OD600约1.5。使用血球计数板计数，裂壶藻菌体密度约为600×106个/ml。
2、将农杆菌AB1301-9从甘油管中接种到5ml LB培养基中（添加卡那霉素到50μg/ml），28℃200rpm摇床培养过夜；然后按10%比例接种到50ml LB培养液中（250ml三角瓶，添加卡那霉素到50μg/ml），28℃、200rpm摇床培养6h到OD600约1.5。
3、分别于4000rpm离心收集裂壶藻及农杆菌菌体，各用10ml IM液体洗涤菌体，离心后使用IM重悬各菌体到2.5ml。各取1ml菌液合并混匀，取50μl涂布在含有250μM乙酰丁香酮及50μg/ml卡那霉素的IM平板上，28℃培养箱培养20h。使用玻璃涂布器及2ml生理盐水将菌苔刮下，吸出洗脱液并使用生理盐水补到约2ml，取20μl涂布在选择平板上。每个平板上涂布量约3×106个裂壶藻细胞。
4、选择平板在28℃培养箱培养2-3天，平板上菌落镜检均为裂壶藻。挑单克隆，使用pCAMBIA 1301上GUS基因对应引物进行菌落PCR验证，具体验证过程如下：
在无菌PCR管中加入10μl无菌水，使用无菌μl移液枪头将单菌落挑入，吹打、弹动使之成为均匀菌液，使用该菌液划线接种到新的选择平板上上备种。剩余菌液在95℃水浴中加热裂解10分钟，取出冰浴并自然沉淀5分钟。取5μl裂解上清作为PCR检测用模板，PCR检测目标为pCAMBIA 1301载体上的GUS基因，两引物分别为：
GUSU：ATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCTAGT（SEQ ID NO:4）；
GUSD：GAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAA（SEQ ID NO:5）。
PCR程序为95℃5min；10循环降落PCR 95℃50s，65℃(每循环降温1℃)50s，72℃90s；15循环95℃50s，53℃90s；72℃10min。
5、选择不同的共孵育时间：17、20、49小时；选择共涂诱导平板孵育；或在液体IM中静置共孵育；或在液体IM中震荡共孵育。
随着孵育时间由17-49h增加，平板上阳性菌落的数量由约6000个降低到约500个，即转化效率2000/106个细胞降到200/106个细胞。液体静置、液体震荡共孵育（每平板涂布裂壶藻细胞量约3×108个），平板上阳性菌落数量分别约2000、1500个，即转化效率6/106、5/106。即培养裂壶藻到OD600 1.5时，诱导17小时，转化效率能到2000/106个细胞。菌落PCR显示（图1），阳性率50%-100%，及转化效率至少1000/106个细胞。
实施例三：优化实验
FJS培养基配方如下：葡萄糖30g/L；L-谷氨酸单钠21g/L；酵母粉0.3g/L；磷酸氢二钾0.5g/L；硫酸钠12.6g/L；硫酸镁1.2g/L；氯化钾0.25g/L；氯化钙0.05g/L；碳酸氢钠0.1g/L；痕量盐储液1ml/L（EDTA二钠6g/L；氯化铁0.2g/L；硼酸6.84g/L；氯化锰0.86g/L；氯化锌0.06g/L；硫酸镍0.026g/L；硫酸铜0.002g/L；锰酸钠0.005g/L）；维生素储液1ml/L（VB1 100mg/L；生物素0.5mg/L；VB12 0.5mg/L）；用氢氧化钾调pH到7.0。
GS、LS培养基与FJS培养基相比，仅硫酸钠含量不同，其余组分均相同，其中GS培养基的Na+浓度453mM，其中328mM来自硫酸钠，124mM来自L-谷氨酸单钠；LS的Na+浓度240mM，其中116mM来自硫酸钠，124mM来自L-谷氨酸单钠。
与FJS培养基相比，Cl-培养基除使用NaCl取代Na2SO4外，其余组分均相同，在Cl-培养基中Na+浓度300mM，其中176mM来自NaCl，124mM来自L-谷氨酸单钠。
1、将1.5ml的裂壶藻甘油菌种保藏液（ATCC 20888）全部接种到50ml FJS培养液中（250ml挡板三角瓶），28℃、200rpm摇床培养48h作为种子液；然后按10%比例转接到新的50ml培养液中（250ml挡板三角瓶，分别使用FJS（Na+浓度301mM，其中177mM来自硫酸钠，124mM来自L-谷氨酸单钠），GS（Na+浓度453mM，其中328mM来自硫酸钠，124mM来自L-谷氨酸单钠），LS（Na+浓度240mM，其中116mM来自硫酸钠，124mM来自L-谷氨酸单钠），Cl-（Na+浓度300mM，其中176mM来自NaCl，124mM来自L-谷氨酸单钠）和YPD（Na+浓度240mM，完全来自海水）五种培养基，28℃、200rpm培养至OD600约1.0-1.5。FJS、GS、LS三种培养基除硫酸钠含量不同外，其余组分相同；Cl培养基为NaCl取代Na2SO4的FJS培养基。
2、将农杆菌AB1301-9从甘油管中接种到5ml LB培养基中（添加卡那霉素到50μg/ml），28℃、200rpm摇床培养过夜；然后按1%比例接种到50ml LB培养液中（250ml三角瓶，添加卡那霉素到50μg/ml），28℃、200rpm摇床培养约6h到OD600约0.3。
3、4000rpm离心收集裂壶藻及农杆菌菌体，各用10ml IM液体洗涤细胞；再次离心后用IM培养基重悬到1.5-2.5ml。各取1ml菌液合并，混匀并取50μl混合菌液涂布在含有0-250μM乙酰丁香酮及50μg/ml卡那霉素的IM平板，28℃培养箱培养17-20h。使用玻璃涂布器及2ml生理盐水将菌苔刮下，吸出洗脱液并补到约2ml，取20μl涂布在选择平板上。估算每个平板上涂布量约2-3×106个裂壶藻细胞。
4、选择平板在28℃培养箱培养2-3天，平板上菌落镜检均为裂壶藻。随机挑单克隆，使用pCAMBIA 1301载体上GUS基因对应引物进行菌落PCR验证，验证方法同实施例二。
使用FJS培养基培养裂壶藻细胞到OD600 1.0，诱导物乙酰丁香酮浓度从0到250μM都能获得很高的转化效率，筛选平板上抗性菌落数量都在约8000菌落/板，各浓度诱导物未导致转化效率出现明显差异。而使用FJS培养基培养裂壶藻细胞到OD600约1.5时，不同诱导物浓度导致转化效率有较大变动，0、50、100、150、200、150μM乙酰丁香酮诱导下，筛选平板上抗性菌落分别为约8000个、3600个、2240个、8000个、6400个、2344个。显然感受态细胞培养时间增加后的裂壶藻敏感性与诱导剂的浓度有关，而较年轻的裂壶藻在各浓度诱导剂下都有很高的敏感性。跟实施例二对比看，降低农杆菌培养状态到OD6000.3是无需使用乙酰丁香酮诱导农杆菌进行转化的关键。
使用不同培养基培养裂壶藻到OD6001.0，计数，如上述方法收集细胞、洗涤并悬浮到浓度1010个/ml，取1ml与1ml上述农杆菌悬液混匀，共培养及筛选。不同预培养来源的裂壶藻转化效率不同，GS（Na+453mM）、FJS（Na+301mM）、Cl-（Na+300mM）、YPD（Na+240mM）、LS（Na+240mM）培养基所获裂壶藻转化效率分别为每106个细胞获得抗性菌落1280、1160、1120、185、120个，GS（Na+453mM）、FJS（Na+301mM）和Cl-（Na+300mM）的转化效率显然高于含240mM Na+的培养基预培养所获的裂壶藻转化效率；而钠的来源是Na2SO4还是NaCl关系不大，因为FJS和Cl获得差不多高的转化效率，而YPD与LS获得差不多低的转化效率。
实施例四
使用实施例二的方法，用农杆菌ABH03转化FJS培养基培养得到的裂壶藻，并在含有50μg/ml zeocin的选择平板上筛选，转化效率约每106个细胞得到700个抗性菌落，按照如实施例二的方法准备菌落PCR的模板，并使用zeocin抗性基因对应的引物进行PCR，引物序列为
ZEOU：AAAACTCGAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC（SEQ ID NO:6）；
ZEOD：AAAACTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA（SEQ ID NO:7）。
PCR程序为95℃5min；10循环降落PCR 95℃50s，62℃(每循环降温1℃)50s，72℃90s；15循环95℃50s，53℃90s；72℃10min。菌落PCR显示阳性率100%（图2）。
从胶中任意挖3个疑似条带，以ZEOU为测序引物，3个条带测序结果均为zeocin抗性基因（图3），因测序引物后10-30个碱基一般无法准确读出，图3中3个检测样品开始部分的序列跟zeocin不一致是本专业从业人员可以理解的。根据转化结果估算转化效率为7000/107个细胞。
比较例：对照试验
1、CN102220359A未指定对数期的详细参数，本实验按照US2010/0266564A1第37页所指出的OD600 1.5-2.5之间，实际培养到OD600 1.5，细胞密度约600×106个/ml；
2、按CN102220359A的方法使用纤维素酶、蜗牛酶（购自上海生工）裂解细胞，收集原生质体。
3、按CN102220359A的方法培养农杆菌AB1301-9，到OD600约0.8，然后在含250μM乙酰丁香酮的IM中预诱导4h后与裂壶藻原生质体混合，28℃100rpm水浴摇床中诱导16h。
4、离心并用IM重悬到5ml后，吸取50μl涂布在选择平板上，涂布细胞理论值为3×108个。28℃培养箱培养2-3天后，平板上有菌落约600个，因此每107个细胞可以获得阳性克隆约20个。按照实施例1的方法进行菌落PCR，结果见图1，阳性率50%。因此原生质体转化Schizochytrium ATCC20888效率为1/106个细胞，远低于完整细胞转化法的效率。
实施例五
发明人又按实施例一和二的方法，使用农杆菌LBA4404、AGL-1转化完整的裂壶藻细胞Schizochytrium sp.ATCC 20888，使用农杆菌EHA105、LBA4404转化裂壶藻Schizochytrium SR21、Schizochytrium sp.ATCC 20889、Schizochytrium sp.NBRC102615及Schizochytrium sp.ATCC 28209，并检测了其转化的效率，并以相应的原生质体转化作为对照。
结果显示，使用上述农杆菌转化完整的裂壶藻细胞，其转化的效率可达到300个/106个细胞，也远高于使用相应原生质体转化的效率。
尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
Claims (16)
1.一种制备转基因裂壶藻的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有目标基因的重组农杆菌转化完整的裂壶藻细胞。
2.一种将目标基因转入裂壶藻的方法，其特征在于，所述方法包括使用含有所述目标基因的重组农杆菌转化完整的裂壶藻细胞。
3.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述裂壶藻选自Schizochytrium sp.ATCC 20888、Schizochytrium S8（ATCC 20889）、Schizochytrium ATCC 28209、Schizochytrium SR21（ATCC MYA-1381）、Schizochytrium sp.NBRC102615、Schizochytrium sp.NBRC 102617、Schizochytrium sp.BAFCcult 3502、Schizochytrium sp.BAFCcult 3511、Schizochytrium sp.BL4、Schizochytrium sp.BR2.1.2、Schizochytrium sp.BUCAAA 032、Schizochytrium sp.BUCAAA 093、Schizochytrium sp.BUCACD152、Schizochytrium sp.BUCARA 021、Schizochytrium sp.BUCHAO 113、Schizochytrium sp.BURABQ 133、Schizochytrium sp.BURARM 801、Schizochytrium sp.BURARM 802、Schizochytrium sp.FJU-512、Schizochytrium sp.KH105、Schizochytrium sp.KR-5、Schizochytrium sp.KRT1、Schizochytrium sp.KRT2、Schizochytrium sp.PJ10.4、Schizochytriumsp.SBL1、Schizochytrium sp.SBL2、Schizochytrium sp.SBL3、Schizochytrium sp.SEK 210、Schizochytrium sp.SEK 345、Schizochytriumsp.SEK 346、Schizochytrium sp.SKA10、Schizochytrium sp.SKA6、Schizochytrium sp.SR21和Schizochytrium sp.TIO01。
4.如权利要求1－3中任一项所述的方法，其特征在于，所述农杆菌选自根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），优选选自根癌农杆菌EHA105、EHA101、LBA4404、AGL-0、AGL-1、NT1、C58-Z707和GV3101::pMP90。
5.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述转化包括将对数期的裂壶藻细胞与对数期的农杆菌混合共培养的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过使用钠离子浓度为0.240摩尔/升以上的裂壶藻培养基培养裂壶藻细胞，获得所述对数期的裂壶藻细胞，优选的，所述钠离子浓度为0.300-1摩尔/升。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对数期的裂壶藻细胞培养物的OD600为1.0-1.5。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对数期的农杆菌培养物的OD600为0.3-1.5。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述共培养在含有盐储液、甘油、水、琼脂、2-吗啉乙磺酸和葡萄糖的诱导培养基中进行。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述共培养包括在28℃左右培养箱中培养对数期的裂壶藻细胞与对数期的农杆菌的混合物15-30小时。
11.如权利要求1－5和10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在含30-80μg/ml重组农杆菌载体所携带的抗生素标记及100-300μg/ml头孢噻肟的裂壶藻培养基中选择转入了所述基因的裂壶藻细胞的步骤。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，对数期的农杆菌培养物的OD600为0.3-0.6，诱导培养基中不含有乙酰丁香酮。
13.一种裂壶藻培养基，其特征在于，所述培养基含有：葡萄糖、酵母粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、痕量盐储液、维生素储液以及用于提供钠离子的钠盐，pH6.5～7.5，其中，钠离子浓度为0.240摩尔/升以上。
14.如权利要求13所述的裂壶藻培养基，其特征在于，所述能提供钠离子的钠盐选自：Na2SO4、L-谷氨酸单钠和NaCl。
15.如权利要求19或20所述的裂壶藻培养基，其特征在于，所述培养基含有：葡萄糖20-40g/L；L-谷氨酸单钠15-25g/L；酵母粉0.1-0.5g/L；磷酸氢二钾0.3-0.7g/L；硫酸钠10-15g/L，或能提供相同的钠离子量的氯化钠；硫酸镁1.0-1.5g/L；氯化钾0.1-0.5g/L；氯化钙0.03-0.07g/L；碳酸氢钠0.05-0.20g/L；痕量盐储液0.5-2ml/L，其中EDTA二钠3-9g/L、氯化铁0.1-0.4g/L、硼酸5-8g/L、氯化锰0.5-1.2g/L、氯化锌0.03-0.09g/L、硫酸镍0.01-0.05g/L、硫酸铜0.001-0.003g/L和锰酸钠0.002-0.008g/L；和维生素储液0.5-2ml/L，其中VB150-200mg/L、生物素0.3-0.8mg/L和VB120.3-0.8mg/L。
16.一种裂壶藻培养基，其特征在于，所述培养基含有：酵母粉5-20g/L，蛋白胨10-30g/L，葡萄糖10-30g/L，30%-70%海水，pH6.2-6.8。
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2012
- 2012-11-22 CN CN201210480448.9A patent/CN103834680A/zh active Pending
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