CN103828710B

CN103828710B - 一种高效率菊花杂交育种效率的方法

Info

Publication number: CN103828710B
Application number: CN201410100386.3A
Authority: CN
Inventors: 房伟民; 金诗媛; 陈发棣; 管志勇; 陈素梅; 蒋甲福; 滕年军; 方庚
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2016-03-23
Anticipated expiration: 2034-03-18
Also published as: CN103828710A

Abstract

本发明为一种高效率菊花杂交育种的方法，属于生物技术育种领域，本发明选择杂交后代种子，经75%乙醇消毒1min及5%次氯酸钠消毒50min后，播种于含15g·L^-1蔗糖的MS培养基上，并结合组织培养技术，进一步扩繁和继代培养，获得大量的无菌苗。本方法切实提高了杂交种子发芽率和成苗率，并且对于部分存在杂交不亲和性的菊花品种，可将由少量的杂交后代种子获得的无菌苗于当年进行继代扩繁，以获得较大群体的株系，从而缩短育种周期，并进一步丰富了菊花育种手段。

Description

一种高效率菊花杂交育种效率的方法

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种高效率菊花杂交育种的方法。

背景技术

菊花是原产我国的十大传统名花，也是世界上最重要的花卉之一，距今已有1600多年的栽培历史，由毛华菊、野菊和紫花野菊等天然杂交并经人工长期选育而成。唐朝时期，中国菊花经朝鲜传入日本，17世纪中叶始，中国菊花传入荷兰、法国、英国等国家，现已成为世界四大切花之一。目前，我国选育的菊花品种约有4000多个，全球品种总数在2万之上，是世界上商品产值最高的花卉之一。菊花不仅在切花和盆花中具有十分重要的地位，而且在园林应用中也发挥了极大的作用，因此加强菊花育种具有很高的经济和社会效益。

菊花是典型的多起源杂种，实生后代极易产生花色、花型等性状的分离，因此利用杂交或开放授粉获得的实生苗后代进行菊花新品种选育是目前菊花育种的主要手段。但由于不同品种的结实率差异极大，部分品种尤其是瓣性较高的蜂窝型、莲座型等花型的品种结实率低，种子少，饱满度低，田间播种的发芽率和成苗率也较低，较难获得大量播种苗后代，极大地影响了育种效率。此外，田间播种后播种苗生长较慢，当年难以获得较大群体的株系，需要当年初选后，于第二、三年复选和优选，也延长了育种周期。鉴于此，针对部分结实率低、种子饱满度差的杂交后代组合，采用无菌播种方法，一方面可以克服不良环境的影响，提高发芽率和成苗率，同时可在可控环境下利用无菌播种获得的种苗进行继代扩繁，于当年获得较大群体的株系，可大幅度缩短育种周期，提高育种效率。

发明内容

发明的目的是针对目前菊花育种上部分杂交组合后代种子少、饱满度低、常规田间播种的发芽率和成苗率也较低这一现状，通过种子消毒、无菌播种和继代扩繁，提供一套简单易操作的方法，以提高菊花杂交种子的发芽率、成苗率，并于当年形成杂交后代的无性株系，从而缩短育种周期，提高育种效率，实用性和科学性突出。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种高效率菊花杂交育种的方法，该方法包括以下步骤：

1）杂交种子的消毒：

将杂交种子用自来水冲洗15～20min后，经无菌水浸泡24～26h，然后在再用体积百分比75%乙醇消毒1min，再用质量百分比5%次氯酸钠消毒50min后，用无菌水冲洗3～4次；

2）无菌播种：

消毒完的种子接种于含15g·L^-1蔗糖的MS培养基中，15d后，将发芽的种子转入MS培养基；

3）杂种株系的获得：

MS培养基培养10～15d后，将幼苗茎段切割3～5段，分别转入继代培养基中进行继代扩繁培养，当幼苗长至2～3cm时，将其移至生根培养基上进行生根培养；40d后炼苗移植。

上述方法中杂交种子采收后阴干，置于牛皮纸袋中，4℃冰箱保存。次氯酸钠溶液中可添加次氯酸钠溶液体积0.3%的表面活性剂TritonX-100。

继代和生根培养的温度均为25±2℃，光照14h，光强1500～2000lx。继代培养时可以根据需要确定继代数，从而使每粒种子获得数个至数十个不等个体的株系。继代扩繁培养采用的培养基可为MS+6-BA0.2mg·L^-1的培养基，生根培养采用的培养基可以为添加生长素NAA0.1mg·L^-1的1/2MS培养基。

上述方法具体包括以下步骤：

1）杂交种子的保存与消毒

将菊花杂交种子采收后阴干，4℃冰箱保存；种子用自来水冲洗15min后，经无菌水浸泡24h。然后用体积百分比75%乙醇消毒1min，再用质量百分比5%次氯酸钠消毒50min后用无菌水冲洗3次。

2）无菌播种

消毒完的种子接种于含15g·L^-1蔗糖的MS培养基，每个培养皿接种20粒种子，15d后，将发芽的种子转入MS培养基培养。

3）杂种后代株系的获得

MS培养基培养10～15d后，将幼苗茎段切割3～5段，分别转入MS+6-BA0.2mg·L^-1的培养基中进行继代扩繁培养，并根据需要确定继代数，从而使每粒种子获得数个至数十个不等个体的株系。当幼苗长至2～3cm时，移至添加NAA0.1mg·L^-1的1/2MS培养基上壮苗并生根，约40d后炼苗移植，即可获得杂种株系。无菌播种、继代和生根培养的温度均为25±2℃，光照14h，光强1500～2000lx。

无菌播种技术及无菌播种体系在本发明前在菊花育种实践中并未见报道。在本技术的摸索过程中，综合比较了不同消毒剂(H₂O₂、次氯酸钠）、消毒时间、培养基类型（MS、B5、N6）、无机盐浓度（1/4MS、1/2MS、MS）、蔗糖浓度（15g·L^-1、30g·L^-1、45g·L^-1）等因素对种子的消毒和培养效果的影响，通过设计正交实验，筛选出最佳种子预处理方法、消毒方法和萌发培养基，从而建立起一整套的菊花无菌播种体系。其中，针对消毒时间这一重要变量，分别设置消毒时间5min、10min，15min，等每间隔5min，直到1h，仔细比较播种过程中的出苗率、污染率及幼苗的生长状态，最终确定最适宜的消毒时间，既保证污染率为0，又保证种子发芽率较高（＞50%）。因此，本发明为一种提高菊花杂交育种效率的方法，将无菌播种技术与组培快繁技术结合，运用于杂交育种实践中，既可提高杂交种子发芽率和成苗率，又可于当年获得杂交后代株系，便于较大群体观察比较杂交后代的性状，从而缩短育种周期，提高育种效率。

本发明提供的菊花无菌播种和继代扩繁的方法，与现有田间播种技术相比具有如下积极效果：

1）与常规播种方法相比，本发明方法针对结实率低、种子少、饱满度低的杂交组合后代，利用可控环境下的无菌播种方法，可提高种子发芽率20.8％以上，且成苗率达到100%，从而扩大了选种后代规模。针对结实率较低、后代种子较少的优异亲本杂交组合，是一种有效的育种辅助手段和技术。

2）通过将无菌播种技术获得的无菌苗进一步利用组培快繁技术进行继代扩繁，可以使每粒杂种种子在当年根据需要获得数株乃至数十株不等的较大群体的株系，在当年完成初选的同时，为优选株系第二年开展生产中试奠定了基础，可缩短育种年限一年以上。

3）本发明方法简单易行、成本低廉，结果准确可靠。

附图说明

图1为无菌播种和继代扩繁获得杂交后代株系的各步骤植株显示图

（材料：利用切花菊品种‘Feelinggreendark’和‘玛丽’，以‘玛丽’为父本经杂交获得的种子）。其中：

A：消毒完的杂交种子接种于含15g·L^-1蔗糖的MS培养基，标尺=1cm；

B：无菌播种7d后，种子发芽，标尺=1cm；

C：15d后，发芽的种子转入MS培养基，标尺=0.5cm；

D.10～15d后，幼苗茎段转入MS+6-BA0.2mg·L^-1的培养基，继代扩繁，标尺=1cm；

E.10d后，茎段移至1/2MS+NAA0.1mg·L^-1的培养基上生根，标尺=1cm；

F.40d后，炼苗，标尺=1cm。

具体实施方式

本发明所提供的通过无菌播种及继代扩繁提高菊花杂交育种效率的方法，其实施方式如下：

实施例1

1）种子的保存与消毒

将菊花杂交种子采收后阴干，置于牛皮纸袋中，4℃冰箱保存。

种子用自来水冲洗15min后，经无菌水浸泡24h。然后在超净工作台上用体积百分比75%乙醇消毒1min，再用质量百分比5%次氯酸钠消毒50min。其中，次氯酸钠溶液中需添加次氯酸钠溶液体积0.3%的表面活性剂TritonX-100。最后用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间约为2min。

2）无菌播种

消毒完的种子接种于培养皿中，皿内装有含15g·L^-1蔗糖的MS培养基，每个培养皿接种20粒种子。15d后，将发芽的种子转入MS培养基。

3）杂种后代株系的获得

MS培养基培养10～15d后，将幼苗茎段切割3～5段，分别转入MS+细胞***素6-BA0.2mg·L^-1的培养基中进行继代扩繁培养，继代数1～3次。当幼苗长至2～3cm时，将其移至添加生长素NAA0.1mg·L^-1的1/2MS培养基上生根。约40d后炼苗，无菌苗移植于由营养土、蛭石、珍珠岩按照体积比2:2:1混合而成的基质中培养，两周后，即可定植于田间，获得杂种株系。

继代和生根培养的温度均为25±2℃，光照14h，光强1500～2000lx。

实施例2：

将盆栽小菊品种‘钟山早白’、‘金陵阳光’开放授粉获得的种子采收后阴干，置于牛皮纸袋中，4℃冰箱保存。

消毒时，种子先用自来水冲洗15min后，经无菌水浸泡24h。然后在超净工作台上用体积百分比75%乙醇消毒1min，再用质量百分比5%次氯酸钠消毒50min。其中，次氯酸钠溶液中需添加次氯酸钠溶液体积0.3%的表面活性剂TritonX-100。最后用无菌水冲洗3次，每次冲洗时间约为2min。

将消毒完的种子接种于培养皿中，皿内装有含15g·L^-1蔗糖的MS培养基，每个培养皿接种20粒种子。15d后，将发芽的种子转入MS培养基。

以常规播种为对照，即将阴干的种子播在72孔穴盘中，每个穴盘播一粒种子，穴盘基质是用营养土、蛭石、珍珠岩（2:2:1）混合而成。

将播好的种子放在24～26℃的光照培养室按照实施例1“杂种后代株系的获得”步骤进行，其中，继代数1次，每日浇两次水。分别于5月6日和7月8日统计发芽率和成苗率。结果表明，‘钟山早白’、‘金陵阳光’无菌播种的发芽率较常规播种分别提高了29.1%和20.8％，同时，成苗率分别提高了29.2%和14.6％。证明利用本发明方法，能切实提高种子发芽率和成苗率。

表1无菌播种和常规播种的发芽率和成苗率比较

实施例3：

2012年11月份以栽培菊品种‘Feelinggreendark’为母本，‘玛丽’为父本进行常规人工杂交，由于母本结实率低，且父本为蜂窝型，瓣性高、花粉少，导致杂交后代结实率极低，人工授粉的428个花序仅得到18粒杂交种子，其中饱满种子12粒，另6粒未充分成熟饱满。为保证种子的萌发率、成苗率，并于当年获得杂交后代的株系群体，采取了本发明实施例1所述的“种子的保存与消毒”及“无菌播种”步骤，18粒种子均萌发成功，发芽率100％；再进行实施例1所述的“杂种后代株系的获得”步骤，继代数2～3次，得到了17个后代株系，成苗率94.44％，并获得共120个单株，每个单株形成5～15株不等的株系。于2013年7月，将后代株系群体移植于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”，当年秋季获得花色为绿色的优选株系11个，为进一步获得绿色品种奠定了良好基础。

本发明方法切实提高了杂交种子发芽率和成苗率，并且对于部分存在杂交不亲和性的菊花品种，可将由少量的杂交后代种子获得的无菌苗于当年进行继代扩繁，获得较大群体的株系，从而缩短育种周期，并进一步丰富了菊花育种手段。

本发明所使用的材料或品种来源或渠道如下：

Claims

1.一种高效率菊花杂交育种的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1）杂交种子的消毒：

将杂交种子用自来水冲洗15～20min后，经无菌水浸泡24～26h，然后在再用体积百分比75%乙醇消毒1min，再用质量百分比5%次氯酸钠消毒50min后，用无菌水冲洗3～4次；次氯酸钠溶液中添加次氯酸钠溶液体积0.3%的表面活性剂TritonX-100；

2）无菌播种：

3）杂种株系的获得：

MS培养基培养10~15d后，将幼苗茎段切割3～5段，分别转入继代培养基中进行继代扩繁培养，当幼苗长至2~3cm时，将其移至生根培养基上进行生根培养；40d后炼苗移植。

2.根据权利要求1所述的菊花杂交育种的方法，其特征在于该方法中杂交种子采收后阴干，置于牛皮纸袋中，4℃冰箱保存。

3.根据权利要求1所述的菊花杂交育种的方法，其特征在于继代和生根培养的温度均为25±2℃，光照14h，光强1500~2000lx。

4.根据权利要求1所述的菊花杂交育种的方法，其特征在于继代培养时根据需要确定继代数，从而使每粒种子获得数个至数十个不等个体的株系。

5.根据权利要求1所述的菊花杂交育种的方法，其特征在于继代扩繁培养采用的培养基为MS+6-BA0.2mg·L^-1的培养基。

6.根据权利要求1所述的菊花杂交育种的方法，其特征在于生根培养采用的培养基为添加生长素NAA0.1mg·L^-1的1/2MS培养基。