CN103827302A

CN103827302A - 筛选方法及其应用

Info

Publication number: CN103827302A
Application number: CN201280046053.6A
Authority: CN
Inventors: 比约恩·弗伦多斯; 詹妮·马特森
Original assignee: Bioinvent International AB
Current assignee: Bioinvent International AB
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-05-28
Also published as: KR20140080504A; DK2758532T3; HK1200486A1; HUE040567T2; US10191049B2; ES2690783T3; KR102024125B1; JP2015501289A; WO2013041643A1; AU2012311542A1; IN2014DN01795A; SI2758532T1; CA2848932A1; RU2014115956A; PT2758532T; EP2758532A1; CA2848932C; AU2012311542B2; JP6370220B2; CN107663238A

Abstract

本发明涉及改善的筛选方法以及，具体地，涉及鉴定特异性针对差异的和/或不经常表达的配体的抗配体的筛选抗配体文库的方法。

Description

筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及改进的筛选方法以及，具体地，涉及筛选抗配体文库的方法，以鉴定对差异化表达的和/或不经常表达的配体特异的抗配体。

背景技术

基于蛋白质或多肽的文库经常用于对某些配体具有特异性的抗配体分子的选择。

此类文库的构造使蛋白质分子以某种方式物理地连接到（physically linked to）编码特定蛋白质分子的遗传信息。因此，该蛋白分子与其基因一起被展示。

常用的展示形式依赖于细胞或病毒宿主颗粒来提呈所述蛋白分子；并且包括细菌展示（Francisco等，1993）和噬菌体展示（Smith，1985；Smith和Scott，1993；Winter等，1994）。这些***在宿主颗粒的表面展示潜在的抗配体分子，同时所展示分子的遗传信息藏于颗粒内部并且所述方法已被成功应用于基于特异性蛋白质的抗配体的筛选。

存在依赖于体外翻译的其他展示形式；包括各种形式的依赖于遗传信息与蛋白质分子的非共价连接的核糖体展示（Mattheakis等，1994；Hanes和Pluckthun，1997；He和Taussig，1997）；并且其他展示形式也依赖于体外翻译，借此，在遗传信息和潜在抗配体蛋白质分子之间存在共价连接，例如Profusion（Weng等，2002）或共价展示技术（Gao等，1997）。

所展示的肽或蛋白质类抗配体库可以是完全随机化的，例如，当使用肽文库时，或它们可以基于***赋予变异性的其他结构的恒定区的支架结构（constant region scaffoldstructure）。

通常使用的支架结构基于抗体重链和轻链可变结构域（McCafferty等，1990），但还可以基于其它支架例如纤维连接蛋白（fibronectin）（Jacobsson和Frykberg，1995；Koide等，1998）、蛋白A结构域（Stahl等，1989）或小的稳定蛋白结构域，例如BPTI（Markland等，1991）。

从展示文库选择显示一定的结合特异性的抗配体通常通过使用所谓“生物淘选（biopanning）”的方法来进行。

靶配体可以固定于固相表面并且文库的特异性抗配体成员暴露给固定的靶配体以使感兴趣的抗配体与靶配体结合。未结合的文库成员随后被洗去并且感兴趣的抗配体被回收并扩增。

除了抗配体文库成员之外的蛋白质类颗粒，例如表达抗体片段的噬菌体，可能是“粘性的（sticky）”，导致一些非靶特异性分子的结合与分离。非特异性结合可以通过以下方式最小化：加入某些化合物至抗配体展示构建体/配体混合物中以用作阻断剂从而减少非特异性抗配体的背景结合，例如牛奶、牛血清白蛋白、血清（人/胎牛）、明胶以及对于某些（非细胞）应用，去污剂（detergent）。

许多洗涤程序已经被设计用来减少文库成员与细胞的非特异性结合，并帮助细胞从污染和/或非特异性结合的文库成员上分离。

此类方法包括洗涤通过磁力固定于柱子上的细胞（Siegel等，1997），以最小化剪切力并允许解离的噬菌体的重新结合。洗涤细胞的另一个方法是在更高密度介质例如Ficoll或Percoll中离心，以选择性去除非特异性和低亲和力抗配体，并且进一步在空间上从游离抗配体和非特异性结合的抗配体中分离细胞和细胞结合的抗配体（Carlsson等，1988；Williams和Sharon，2002）。

取决于筛选方法（selection process）的有效性，可能需要几轮淘选来去除或至少充分减少非特异性抗配体至期望的水平（Dower等，1991）。

在另一个筛选方法（selection method）中，靶配体结合同处于溶液中的特异性抗配体文库成员。然后结合的抗配体通过采用例如可回收的标签而分离，所述标签附加至靶配体。最常使用的标签是生物素，其允许靶分子和所展示的特异性文库成员之间的复合体（complex）通过采用结合至固相支持物例如珠子上的亲和素而得到回收（Siegel等，1997）。

当靶配体是公知的且以纯化的形式提供时采用这些方法。一次针对一个单独靶配体的筛选是常规的。针对几种限定的靶配体的筛选可同时进行。靶配体可以是一种或更多种的小的半抗原、蛋白质、碳水化合物、DNA和脂类。

对于许多应用，针对差异表达的配体的特异性抗配体是感兴趣的。例如，当与那些健康对照相比，蛋白质可在源自患有疾病的患者的细胞和组织上差异表达。这些疾病包括微生物、病毒或寄生虫感染，哮喘，慢性炎症和自身免疫性疾病，癌症，神经、心血管或胃肠道疾病。相似的，体液的蛋白质组成，例如，血浆、脑脊液、尿液、***、唾液和粘液，可能在健康对照和患有疾病的患者之间存在差异。

因此，除了它们作为鉴定差异表达的配体的研究工具的常规应用，特异性针对差异表达的配体的抗配体可以用作诊断、预防和/或治疗疾病的工具。

基因组学和蛋白质组学领域中的最新进展已经表明了许多至今尚未确定为差异表达的分子的存在，强调了用于针对这些潜在的靶配体产生特异性的抗配体的方法的重要性。

许多这些差异表达的分子被期望着表达在细胞表面上，借此组成采用例如特异性抗体的靶向治疗的潜在靶标，所述特异性抗体可以偶联至生物活性（例如细胞毒性）试剂上。

巨大并且高度多样性的抗配体展示文库提供特异性针对碳水化合物、蛋白质、脂类或其组合作用的未知细胞配体的抗配体的分离方法。

原则上，当前可用的生物淘选过程包括基于全细胞、细胞部分和细胞膜的方法，其允许显示特异性针对天然构型的细胞膜配体的抗配体的展示构建体的分离。

人类和人源化的治疗性抗体日益被用于治疗各种疾病，包括急性和慢性炎症性疾病、免疫和中枢神经***疾病以及癌症。人类治疗性抗体被认为是治疗人类疾病最吸引人的方式，这是由于它们完全的人类来源以及相关的免疫原性的缺乏，参与抗体Fc依赖的宿主免疫效应机制的优化能力，以及它们与其鼠源、嵌合和人源化的相似抗体相比优异的体内半衰期。现在人类抗体通常通过不同的技术产生，包括人源化小鼠和高度多样性的噬菌体抗体文库。

大的（>10⁵独特的（unique）抗体克隆）人类抗体文库足够多样性，包含特异性针对显著数量的抗原的高亲和力抗体，所述抗原包括几乎所有种类的自体抗原。在自体免疫疾病中，自体抗原是除了作为正常组织成分之外还是体液或细胞介导的免疫反应的靶标，代表了突出的治疗意义上的抗原种类。

人类抗体文库还被认为与携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠相比，当选择结合人类和小鼠之间结构上保守的受体表位的抗体时，提供了优势，因为这类抗体在体内是通过自身耐受机制负向选择的。这些保守的区域尤其具有治疗意义，因为保守区域经常是功能相关的（例如结合所必须的配体结合结构域并且赋予配体/受体诱导的细胞反应），并且靶向这些保守表位的抗体可被筛选为协同实验疾病模型***内的体内治疗活性。

特异性针对几乎所有种类人类可溶性抗原（例如细胞因子、趋化因子、生长因子、脂类、碳水化合物和缀合分子等），以及细胞表面受体（例如1TM、4TM、7TM和多TM跨膜受体等）的高亲和力抗体已经成功从高度多样性人类抗体文库中分离出来。

细胞表面受体组成了一类具有突出的治疗意义的靶标，并且结合不同癌症细胞相关受体的几种抗体已被证实用于癌症治疗，包括利妥昔单抗（rituximab）（抗CD20）、曲妥珠单抗（trastuzumab）（抗Her2）和西妥昔单抗（cetuximab）（抗EGFR）。

但是，从抗体受体特异性并不能很容易地预测治疗的有效性；针对相同靶受体的抗体可能在治疗有效性上差别很大，不依赖于它们的结合亲和力（Beers等，2008；Cragg和Glennie，2004），并且针对替代的分子靶标的抗体可能显示是有希望的，并且有时是意想不到的治疗潜力（Beck等，2010；Cheson和Leonard，2008）。例如，不同CD20特异性抗体克隆与CD20抗原具有相似的结合亲和力并携带相同的小鼠IgG2a恒定区，但在体内消耗B细胞的能力根本上不同（Beers等，2008；Cragg和Glennie，2004），并且针对其他不是CD20的肿瘤相关细胞表面受体的抗体可能具有针对B细胞癌症的显著抗肿瘤活性（综述请参见Cheson和Leonard，2008）。

因此，在高度多样性的抗体文库中，对任何给定类型的癌症最具治疗有效性的、强力的和最耐受的抗体很可能是特异性针对几种不同受体的任何一种，并且在高度多样性的文库中鉴定治疗性优化的抗体克隆需要对多个并且理想状况下所有的特异性针对不同疾病细胞相关的受体的文库成员进行功能筛选。

申请人之前已经开发了能够从人类噬菌体抗体文库回收结合至不同表面受体的抗体克隆的筛选技术（生物淘选方法），与其他细胞群体（非靶细胞）相比所述受体在一种细胞群体（靶细胞）上差异表达（WO2004/023140，Fransson等，2006；Frendéus，2006）（在下文中被称为差异生物淘选）。WO2004/023140的公开内容（和其所有国家阶段递交的衍生内容）全文作为参考引入本发明。

这个筛选方法实质上包括六个步骤，如图1所示。重要的是，这个方法包括以下顺序的筛选步骤：

1)差异生物淘选，然后

2)筛选靶标对非靶标的特异性，然后

3)更小量的克隆通过Sanger技术进行常规测序

采用这个技术，使得产生显示针对差异表达表面受体的靶细胞对非靶细胞的高特异性的抗体池成为可能。

Sanger测序是当前用于在“低通量”方式下鉴定独特结合物的技术的一个例子。其他例子包括在限制性酶消化之前和之后跑抗体基因DNA的胶，并通过对不同的限制性酶（间接地，不同的序列）不同的敏感性揭示独特大小。

当用于分离靶向癌症B细胞（靶标）对T细胞（非靶标）差异表达的表面受体的抗体时（“B非T”（BnonT）差异淘选），该方法鉴定了针对不同靶细胞差异表达的表面受体的抗体，包括HLA-DR、表面Ig和ICAM-1（表1）。

表1.通过现有筛选方法分离的抗体的频率和特异性，例如连续差异生物淘选、结合筛选和Sanger测序，靶向癌症B细胞对T细胞差异表达的表面受体（“B非T”差异淘选）

抗体序号	克隆数（检测81个）	特异性
			#1	71	sIgM
#2	4	HLA-DR
			#3	1	ICAM-1
#4	1	sIgM
			#5	1	sIgM
#6	1	sIgM
			#7	1	sIgM
#8	1	未确定

然而，靶受体均相对高表达（每个细胞50,000–400,000个受体），并且通过该方法所鉴定的独特抗体序列的数量有限（筛选81个得到8个）。

尽管仅有限数量的针对靶细胞差异表达的表面受体的克隆被测序，一个抗体克隆的高频率意味着在所回收的“B非T”抗体池中有限的抗体多样性。因此，尽管该技术提供与之前的基于细胞的淘选技术相比显著的进步，某种意义上说，具有针对几种不同差异表达的受体的治疗潜力的抗体是通过有限的筛选工作鉴定出来的（Fransson等，2006），这一观察表明需要进行进一步的改进，因为，按照当前普遍看法，淘选仅仅产生了有限多样性并由针对相对高表达和强烈差异表达的表面受体的抗体构成的抗体池（Hoogenboom，2002）（Liu等，2004；Mutuberria等，1999；Osbourn等，1998）。

早先的生物淘选方法（WO2004/023140和Frendéus，2006）中所教导而进行的通过计算机的计算表明，差异筛选出的“B非T”抗体池应当含有更大量的针对多个差异表达的表面受体的每一个的抗体（图2）。

当时的测序能力使得对该池中显著更大量的抗体克隆的测序变得极度困难（几乎不可行），因此，采用间接的方法，对认为差异筛选出的抗体池应当比通过最初的筛选方法获得的抗体池更加多样性的假设进行了测试。因此，采用偶联重组ICAM-1蛋白（ICAM-1是表1的差异筛选的抗体池中从最初81个测序的克隆中通过单个抗体克隆靶向的细胞表面受体）的免疫珠子，所差异筛选的“B非T”抗体池在额外的ICAM-1特异性抗体克隆存在下被淘选。筛选1260个抗体克隆，针对重组ICAM-1的差异筛选的抗体池的淘选后回收，鉴定出二十一（21）个其他的ICAM-1特异性抗体序列/克隆。

这些观察结果证实原差异生物淘选方法能够鉴定针对差异表达的抗原的抗体克隆，但是所差异筛选的抗体池比这些最初筛选的明显更多样性得多，并且显著比常规筛选方法确定的多

发明内容

现在申请人已经设计了改善用于检测针对感兴趣的配体的多个不同抗配体的差异生物淘选方法的精确性的方法。因此，本发明公开了能够从人类抗体文库（和其他分子文库）回收高亲和力抗配体库的方法，例如与其他细胞群相比，特异性针对以其天然细胞表面构型、在靶细胞群体中从低到高水平差异表达的不同配体（例如受体）的人类抗体。

本发明在几个方面与之前设计的筛选方法不同（图8）。首先，通过将独一无二的强大的差异生物淘选方法与下一代深入测序技术和随后的特异性针对靶细胞差异表达的表面受体的抗体的验证筛选-“反向筛选”组合，本发明使得1）定性和2）定量独特的抗体池的产生成为可能。

重要的是，通过该方法鉴定的抗配体，例如抗体克隆，可以都具有治疗潜力，因为基于以下原因：首先，它们与受体高亲和力结合，所述受体是a）在靶细胞对非靶细胞上差异表达的，以及b）在靶细胞上以其天然细胞表面构型表达；其次，文献记载了在相关体外和体内实验疾病模型***中具有这些性质的抗体介导治疗作用的能力（Beck等，2010；Fransson等，2006）。

因此，总之，本发明使以下内容成为可能：

1.通过差异生物淘选产生抗体池使含有特异性针对以高、中和低水平表达的差异表达的表面受体的抗体

2.存在测序抗体克隆数量的更低阈值，为了鉴定特异性针对中和低表达的表面受体的抗体其必须被超过

3.在该更低的阈值之上，越来越多数目的抗体克隆的测序提高了所鉴定的特异性针对中和低表达的表面受体的抗体的数量

4.在差异表达的抗体池中的特异性针对中和低表达的表面受体的抗体的广泛鉴定需要深度测序

因此，本发明的第一方面提供一种分离针对至少一种差异表达的靶配体的至少一种抗配体的方法，包括以下步骤：

(a)对抗配体的文库进行差异生物淘选以分离至少一种抗配体；以及

(b)对步骤（a）中分离的抗配体进行高通量测序。

所述方法还可以包括以下步骤：

(c)对特异性针对差异表达的配体的抗体进行验证筛选

本发明方法的差异生物淘选步骤可以包括以下子步骤：

(i)提供抗配体的文库；

(ii)提供含有固定至或整合入减法（subtractor）配体构建体的配体的第一配体群；

(iii)提供含有与步骤（ii）的配体相同并固定至或整合入靶配体构建体的配体的第二配体群；

(iv)采用从质量作用的普遍规律得出的一个或多个方程确定所述群中所述减法配体构建体和所述靶配体构建体的量：

\frac{{[C]}^{c} {[d]}^{d}}{{[A]}^{a} {[B]}^{b}} = K_{eq},

其中：

A,B,C&D=在该反应中的参与者（反应物和产物）

a,b,c,&d=平衡化学方程所需的系数

从而允许针对差异表达的靶配体的抗配体的分离；

(v)提供步骤（iv）中确定的减法配体构建体的量；

(vi)提供步骤（iv）中确定的靶配体构建体的量；

(vii)提供从结合至减法配体构建体的抗配体中分离结合至靶配体构建体的抗配体的分离装置（means）；

(viii)将（i）的文库暴露给由（v）和（vi）提供的配体构建体以允许抗配体与配体的结合；以及

(ix)采用所述分离装置分离结合固定至或整合入靶配体构建体的配体的抗配体。

本发明的步骤并不意味着一定要以任何特定的顺序执行。

“提供确定的量”是指提供已知的配体的量，使得本发明的方程已被用于验证提供的已知量适于分离所期望的抗配体。

用于给定筛选方法的反应参数可以根据本发明进行优化，通过应用质量作用定律和由其衍生的方程的计算，并考虑如下参数，例如分子文库多样性、抗配体拷贝数、期望的上调的检测限、期望的抗配体亲和力以及配体浓度。

第一方面的所述方法的高通量测序步骤可以通过454测序、Illumina、SOLiD方法、Helicos***或那些来自Complete Genomics和Pacific Biosciences的***进行。

下一代测序的出现使得大量（1,000s至1,000,000s）候选基因以高通量方式进行测序成为可能（从这里开始被称为“深度测序”）。

454测序由Margulies等（2005）公开（并作为参考引入本发明）。在454方法中，要测序的DNA是任意分级的并带有接头（adaptor）或DNA的片段能被使用含有所述接头的引物进行PCR扩增。所述接头是25-mers的核苷酸，其是结合至DNA捕获珠子并退火PCR扩增引物和测序引物乳液所需的。所述DNA片段制备为单链并以仅允许一个DNA片段被附加到一个珠子的方式附加到DNA捕获珠子上。接下来，含有DNA的珠子在油包水混合物中乳化得到仅含有一个珠子的微反应器。

在微反应器里，所述片段被PCR扩增，每个珠子得到几百万拷贝数。PCR后，破乳，珠子被加载到微微滴定板（a pico titer plate）上。微微滴定板的每个孔可以仅含有一个珠子。测序酶加到孔里，核苷酸以固定的顺序流过孔。核苷酸的掺入导致焦磷酸盐的释放，其催化反应带来化学发光信号。该信号由CCD相机记录，使用软件将该信号翻译成DNA序列。

在Illumina方法中（Bentley（2008）），单链、带有接头的片段附加至光学透明表面并进行“桥式扩增”。这个过程结果带来几百万簇，每个均包含一个独特的DNA片段的拷贝。加入DNA聚合酶、引物和四个标记的可逆终止核苷酸并且表面通过激光荧光成像以确定标记的位置和性质。然后去除保护基团并且该过程重复几个循环。

SOLiD方法（Shendure（2005））与454测序类似，在珠子的表面扩增DNA片段。测序包括连接和标记探针的检测的循环。

目前正在开发几种其它用于高通量测序的技术。此类技术的例子有Helicos***（Harris（2008））、Complete Genomics（Drmanac（2010））和Pacific Biosciences（Lundquist（2008））。由于这是一个极其快速发展的技术领域，适用于本发明的高通量测序方法对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

尽管能够对长片段DNA，例如那些编码抗体可变结构域（Fv）、scFv或Fab序列的DNA测序的仪器只处于原型阶段，当前可用的仪器确实使较短DNA片段，例如编码并跨越scFv CDRH1至CDRH3结构域的序列的测序成为可能。但是，当测序技术得以改进以允许长片段DNA测序时，这些技术也将在本发明的方法中工作良好。

本发明方法的验证筛选步骤可以通过检查所分离的抗配体池和/或个体抗配体克隆与靶构建体对减法构建体的特异性配体结合而完成，可以采用任何能够检查配体/抗配体结合的方法，例如流式细胞术、FAMT（Fluorescent Microvolumetric AssayTechnology，荧光微体积测定技术）、ELISA（酶联免疫吸附法）、MSD（Meso ScaleDiscovery，中尺度发现）和CBA（Cytometric Bead Array，流式微珠阵列）。

在一个实施方案中，方法的配体不表达于无论是靶构建体或减法构建体之一之上，即，它仅表达于靶构建体或减法构建体的一个之上。

在另一个实施方案中，方法的配体以较高水平表达于无论是靶构建体或减法构建体的一个之上。

差异生物淘选方法可以进一步包括从配体释放抗配体的子步骤。

优选地，差异生物淘选步骤的步骤（ii）至（ix）平行进行，以分离多个抗配体至多个不同配体。

差异生物淘选步骤的步骤（ii）至（ix）重复一次或多次。

优选地，减法构建体或靶构建体之一的差异生物淘选步骤中的量以过量于减法构建体或靶构建体的另一个的方式提供。配体过量可以是在10和100倍之间，但也还可以是在2和10倍或1000和100,000倍之间。

减法配体群过量的幅度决定了能够检测的最高可能的“分辨率”（即能在特异性针对低上调、中上调、高上调或独特表达的配体的抗配体之间分辨得如何好），以及能在不同表达的配体之间分辨得如何好。例如，如果使用具有100个靶配体特异性的抗配体的文库并且加入足够大浓度的阳性配体以使得所有抗配体都结合配体达到平衡状态，然后10倍过量的减法配体群将会允许降低90%特异性针对常规表达的配体的抗配体的频率，而200倍过量（抗配体特异性结合物数量的两倍）将会允许去除常规结合物（参见WO2004/023140，图5以及实施例4的最后一段的数据显示了这一点）。

在一个实施方案中，差异生物淘选步骤的步骤（iv）的方程是：

bA = \frac{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}{2} - \sqrt{\frac{{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}^{2}}{4} - AxT}

其中

bA=结合的抗配体

A=抗配体的总数

T=配体的总数

C=阿伏伽德罗常数(6.022x10²³颗粒/摩尔)

V=反应体积(升)

K_d=平衡解离常数

在一个可选实施方案中，差异生物淘选步骤的步骤（iv）的方程是：

bA = {\frac{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}{2} - \sqrt{\frac{{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}^{2}}{4} - AxT}} x {\frac{T_{p} x C_{p}}{((T_{p} x C_{p}) + (T_{s} x C_{s}))}}

其中

bA_p=结合的抗配体

T_p=C_p上的配体数量

T_s=C_s上的配体数量

C_p=靶配体构建体的数量

C_s=减法配体构建体的数量

A=抗配体的总数

T=配体的总数

C=阿伏伽德罗常数(6.022x10²³颗粒/摩尔)

V=反应体积(升)

K_d=平衡解离常数

差异生物淘选步骤的分离装置可以选自至少一种固相支持、细胞膜和/或其部分、合成膜、珠子、化学标签和自由配体。减法和靶构建体的分离装置可以具有不同的密度。减法构建体的分离装置可以优选膜囊或全细胞膜。

差异生物淘选方法的步骤（ix）可以通过至少一种分离方法进行，所述分离方法是密度离心（Williams和Sharon，2002）、固相支持封存（solid support sequestration）、磁珠封存（Siegel等，1997）、化学标签结合（chemical tag binding）和水相分割（aqueousphase partitioning）之一。

更优选地，分离方法是密度梯度例如Ficoll、Percoll、碘化密度介质上进行的密度离心，其中在离心过程中，第一和第二靶配体通过Ficoll梯度移动至不同程度，借此第一和第二靶配体可以从它们不同的终点分离。

最优选地，分离方法采用蔗糖聚合物梯度，例如Ficoll。

步骤（a）的文库优选包含多个展示抗配体的文库成员的展示文库。此类文库的例子是噬菌体展示文库，其中抗配体展示于噬菌体的表面。

在噬菌体（phage）表面的融合至噬菌体外壳蛋白之一的蛋白质和多肽的展示提供了选择特异性配体的强大工具。该“噬菌体展示”技术最初是由Smith在1985年使用，为了创建大的抗体文库已筛选对特定抗原具有高亲和力的抗体。最近，为了鉴定具有期望性质的配体，该方法已被用于在噬菌体表面提呈肽、蛋白结构域和完整蛋白。

噬菌体展示技术背后的原理如下：

(i)编码用于展示的蛋白或多肽的核酸被克隆入噬菌体；

(ii)所克隆的核酸表达融合至噬菌体外壳蛋白之一的外壳锚定部分（在丝状噬菌体的情况下，通常为p3或p8外壳蛋白），这样外源蛋白或多肽被展示在噬菌体的表面上；

(iii)然后，筛选出展示具有期望性质的蛋白或多肽的噬菌体（例如通过亲和层析），从而提供可被测序、扩增并转移到其他表达***的基因型（连接到表型）。

另外，外源蛋白或多肽可以采用可包装成噬菌体外壳中的单链核酸的噬菌粒载体（即含有源自噬菌体和质粒的复制起点的载体）表达。当采用噬菌粒载体时，“辅助噬菌体”用于提供噬菌粒核酸的复制和包装功能。所得到的噬菌体会同时表达野生型外壳蛋白（由辅助噬菌体编码）和修改过的外壳蛋白（由噬菌粒编码），而当使用噬菌体载体时仅修改过的外壳蛋白表达。

采用噬菌体展示分离结合生物相关分子的配体已被综述在Felici等（1995）、Katz（1997）和Hoogenboom等（1998）。已经建成多个随机组合肽文库以筛选结合不同靶标（例如细胞表面受体或DNA）的多肽（Kay和Paul，（1996））。

蛋白质和多聚体蛋白已成功通过噬菌体展示为功能性分子（参见Chiswell和McCafferty，（1992））。此外，功能性抗体片段（例如Fab、单链Fv[scFv]）已被表达（McCafferty等(1990）；Barbas等（1991）；Clackson等，（1991）），并且某些人单克隆抗体技术的缺点已被取代，因为人高亲和性抗体片段已被分离（Marks等，（1991）以及Hoogenboom和Winter（1992））。

关于噬菌体展示的原理和实践的进一步信息提供在Phage display of peptides andproteins:a laboratory manual Ed Kay,Winter和McCafferty（1996），其内容通过引用并入本文。

抗配体文库可构建自至少以下一种：抗体和抗原结合变体、其衍生物或其片段；具有工程化的可变表面的支架分子（scaffold molecule）；受体和酶。

差异表达的配体可以至少是以下一种：抗原；受体配体；以及含有来自碳水化合物；蛋白质；肽；脂类；多核苷酸；无机分子和缀合分子（conjugated molecule）的至少一种的酶靶标。

本发明的方法还可以包括暴露配体和它的分离装置（从差异生物淘选步骤）至影响在所述配体构建体上的靶配体的表达的刺激物（stimulus）的其他步骤。

本发明鉴定的所选的抗配体可以随后用于制备用于疾病的治疗、成像、诊断或预后医学的药物组合物。基于抗体及最重要的人类抗体的抗配体具有很大的治疗潜力。

因此，本发明的第二个方面提供制备药物组合物的方法，其包括，在通过根据前述任一权利要求所述的方法鉴定具有期望性质的抗配体后，将所述抗配体加至药学上可接受的载体。

本发明的第三个方面提供由第二方面的方法制备得到的药物组合物，其用于医学。该药物组合物还可以用于制备用于疾病的预防、治疗、成像、诊断或预后的药物。

定义

“生物淘选”是指从期望的抗配体-配体结合对基于其以高亲和力结合另一个成员的能力筛选一个成员的方法。

“差异生物淘选”是指从期望的抗配体-配体结合对基于其以高亲和力结合另一个成员的能力筛选一个成员的生物淘选方法，所述抗配体-配体结合对在两种不同来源（例如减法/对照和靶标）之中或之上以不同量表达。

“高通量测序”是指大量序列平行测序（高达数百万），使得大量分子的测序速度是切实可行的并且变得显著更快和更便宜。

“验证筛选”是指检测所分离的抗配体池和/或个体抗配体克隆与靶构建体对减法构建体的特异性配体结合，可以采用任何能够检查配体/抗配体结合的方法，例如流式细胞术、FAMT、ELISA、MSD和CBA。该术语还指，一旦抗配体被鉴定为结合至差异表达的配体，配体的性质和特性以及抗配体与配体之间的结合相互作用就被研究。

“配体”是指配体/抗配体结合对的一个成员。配体可以例如是互补的、杂交的核酸双螺旋结合对中的一条核酸链；效应子/受体结合对中的效应子分子；或抗原/抗体或抗原/抗体片段结合对中的抗原。

“抗配体”是指配体/抗配体结合对的另一个成员。抗配体可以分别是互补的、杂交的核酸双螺旋结合对中的另一条核酸链；效应子/受体结合对中的受体分子；或抗原/抗体或抗原/抗体片段结合对中的抗体或抗体片段分子。

“抗原”是指一种分子或化合物，其能够与抗体相互作用但不必然产生免疫反应。这些抗原包括，但不限于，蛋白、肽、核苷酸、碳水化合物、脂类或其缀合物的分子。

“差异表达的配体”是指在靶和减法来源之间以不同水平表达的配体，包括那些仅在某种条件/位置而不在其他条件/位置表达的；或其中靶标或减法配体是来自靶标和减法配体的另一个的修改过的版本。例如，某些抗原在疾病细胞（例如癌症细胞）的细胞表面高表达而在相应的健康细胞（例如非癌性细胞）上低水平表达或根本不表达。

“低表达配体”是指那些以低水平表达的配体，即每个细胞低于20,000拷贝，例如在5,000和20,000（这包括大多数野生型表达的细胞表面受体）之间，或发生频率小于在阳性配体群样品中的任何其他、更高表达的配体的1%的配体。

“配体构建体”是指包括与分离装置相连的靶标和/或减法配体的***。

术语“抗体变体”应当被用来指任何合成抗体、重组抗体或抗体杂交体，例如，但不限于，免疫球蛋白轻和/或重链可变和/或恒定区的噬菌体展示制得的单链抗体分子，或是能够与本领域技术人员已知的免疫分析形式中的抗原结合的其他免疫相互作用分子。

术语“抗体衍生物”是指任何修改过的抗体分子，其能够以本领域技术人员已知的免疫分析形式与抗原结合，例如抗体的片段（例如Fab或Fv片段），或是通过***一个或多个氨基酸或其他分子以促进抗体偶联至另一肽或多肽、至大的载体蛋白或至固相支持物（例如氨基酸酪氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸及其衍生物，NH₂-乙酰基团或COOH-端酰胺基团以及其他分子）而修改的抗体分子。

“密度离心”是指物品例如细胞、细胞器和大分子根据它们的密度的不同的分离。该分离通过采用合适溶液的密度梯度离心获得，通过该分离方式，被分离的物品基于它们的密度而移动。

“质量作用定律”是在任何情况下均适用的自然界的普遍定律。该定律指出，对于反应：

aA+bB→cC+dD

并且如果该***处于给定温度的平衡状态，那么以下比率是一个常数：

\frac{{[C]}^{c} {[d]}^{d}}{{[A]}^{a} {[B]}^{b}} = K_{eq},

其中：

A,B,C&D=在该反应中的参与者（反应物和产物）

a,b,c,&d=平衡的化学方程所需的系数

并且其中常数是以浓度（由[]表示）计算的并且K的单位为M^c+d-(a+b)。

附图说明

现在将描述实施本发明的某些方面的实施例，参考以下附图，其中：

图1Fransson等Int J Canc2006所描述的差异生物淘选方法的示意图。箭头下面的数字表示噬菌体-abs或在五个筛选步骤（1-5）和随后的两个合成和鉴定步骤（6）和（7）的每一个之后的筛选过程中留下的抗体克隆的数量。步骤是：（1）差异生物淘选，（2）scFv转换的克隆的集落挑取，（3）单克隆水平的scFv克隆的表达，（4）特异性针对靶细胞差异表达的表面受体的scFv克隆的筛选，（5）独特抗体序列的ID的测序，（6）IgG合成，以及（7）体外/体内功能测试

图2计算机计算显示，源自癌症B细胞对Jurkat T细胞（“B非T”）的差异生物淘选的抗体池应包含与采用常规方法实验性鉴定的相比多得多的针对几种差异表达的表面受体的每一个的抗体。

(1)表示计算按照WO2004/023140所教导的进行

图3源自DU-145***癌对Jurkat T细胞（“D非T”）的差异生物淘选的噬菌体-抗体池对靶细胞（DU-145）群高度特异。

A)该图显示，如通过FACS分析的，噬菌体池与靶DU145细胞的剂量依赖特异性结合，其在两轮差异生物淘选后获得。需要注意的是，没有结合到非靶标Jurkat细胞的可检测到的信号。

B)该图显示，如通过FMAT分析的，在DU145细胞对Jurkat细胞的两轮差异生物淘选后获得的池的1408个单独的、随机筛选的克隆的每一个特异性结合。

图4靶DU-145细胞表达几种表面受体，其基于它们绝对靶细胞表达水平和它们在靶对非靶细胞表面上的相对表达水平可被分类为“高差异表达的”、“中差异表达的”或“低差异表达的”。

靶（DU145）和非靶（Jurkat）细胞利用流式细胞术通过使用Zenon Alexa Fluor647标记的抗体筛选三个抗原：HER2、CD24和CD130的表达。

A)该图显示用zenon标记的抗体染色的靶和非靶细胞的平均荧光强度。

B)该图显示表达HER2、CD24和CD130的细胞的百分比。

图5Scatchard曲线分析（Scatchard plot analyses）显示由差异生物淘选分离的抗体靶向的差异表达的表面受体的表达水平以及每个细胞深度测序范围从6,000-400,000受体。

A.饱和曲线

B.Rosenthal曲线（Rosenthal plots）。抗CD130抗体的亲和力（KD）被估计为0.8nM并且CD130表面受体的数量为6.300/细胞。抗CD24抗体的亲和力被估计为5.6nM并且表位的数量为8.400/细胞。抗HER2的亲和力被估计为47nM并且表位的数量为110,000/细胞。评估由¹²⁵I标记的抗体结合至INF-γ刺激的DU145细胞的Rosenthal曲线来完成。

图6源自DU-145***癌对Jurkat T细胞（“D非T”）的差异生物淘选的抗体池含有特异性针对高表达、中表达和低表达的差异表达的表面受体的抗体克隆。

基于scatchard和FACS分析（图4和5），HER2、CD24和CD130被定性为以不同水平表达的受体。

A)该图显示，如通过ELISA分析的，特异性针对所有抗原的抗体克隆存在于DU-145对Jurkat细胞的两轮差异生物淘选产生的抗体池中。

B)该图显示，当选中A中靶特异性克隆并重新检测结合时，大多数克隆仍然对靶抗原是阳性的。回收的靶表面受体特异性抗体克隆的测序证实（至少）12个独特抗体存在于差异筛选的抗体池中；八（8）个抗HER2，一（1）个抗CD24以及三（3）个抗CD130的抗体

图7越来越多的差异筛选的抗体克隆的测序导致鉴定出越来越多的特异性针对低表达的靶细胞差异表达的表面受体的抗体克隆。

确定了在三个随机选择的规模越来越大的（分别为91克隆、255克隆和813克隆）结合物池中的抗体克隆序列。此后，在所有三个池中均发现的克隆（“富克隆”）、仅在两个较大池中发现的克隆（“较低频克隆”）或仅在最大的池中发现的克隆（“稀有克隆”）通过FACS分析其与DU145细胞的结合并比较了富、较低频和稀有克隆的平均荧光强度。

数据清楚地表明平均受体表达水平：富克隆>中频克隆>稀有克隆。因此，越来越多的差异筛选的抗体克隆的测序导致鉴定出越来越多的特异性针对低表达的靶细胞差异表达的表面受体的抗体克隆。

A)该图显示用各个抗体克隆染色的DU-145细胞的平均荧光密度。

B)该图显示个体抗体克隆结合其上的靶细胞的百分比。

由于克隆是随机选择的，它们中的一些是非结合物并且这些在分析之前去除（结合物定义为在％的阳性染色细胞和几何平均值上均给出至少两倍于阴性对照的信号的克隆，或，另外可选的，三倍于几何平均值的高信号的克隆）。

*=p<0,05，**=p<0,01如利用ANOVA采用用于多重分析的Bonferroni校正所计算的。

图8该示意图描绘了之前描述的差异生物淘选筛选方法（A.，上图）和新的增强方法（B.，下图）的筛选步骤的对比

这两个方法在几个方面不同：第一，在反向筛选方法中，WO2004/023140差异生物淘选的结合特异性步骤的噬菌体-ab至scFv的转换、scFv的表达和scFv的筛选已经被省略了。第二，在反向筛选方法中，差异生物淘选后面直接跟着（深度）测序，而在WO2004/023140的筛选方法中，池中抗体克隆的测序前面是针对靶细胞差异表达的表面受体特异性的个体scFv克隆的筛选。第三以及最重要的是，采用反向筛选方法所获得的抗体克隆的数量（数万）和抗体克隆的质量（包括大量产生的特异性针对低表达的差异表达受体的抗体）实际上不能采用A的之前描述的差异生物淘选方法获得。

步骤是：（1）差异生物淘选，（2）scFv转换的克隆的集落挑取，（3）单克隆水平的scFv克隆的表达，（4）特异性针对靶细胞差异表达的表面受体的scFv克隆的筛选，（5）独特抗体序列的ID的测序，（6）IgG合成，以及（7）体外/体内功能测试，

（2’）下一代深度测序，（3’）HT IgG合成，（4’）特异性针对靶细胞差异表达的表面受体的IgG克隆的筛选，（5’）体外/体内功能测试

图9源自DU-145***癌症对Jurkat T细胞的两轮差异生物淘选的回收的噬菌体-抗体池的计算机计算。

具体实施方式

实施例1–差异生物淘选结合随后的高通量测序产生数量空前的特异性针对差异表达的靶细胞表面受体的独特抗体克隆

通过癌症B细胞对Jurkat T细胞（“B非T”）的差异生物淘选产生抗体池

在该实验中，来自含有大约10¹⁰基因型独特的结合物的高多样性的n-CoDeR文库的2x10¹³噬菌体颗粒与全B淋巴瘤细胞系Ramos细胞（阳性筛选）以及来自T白血病细胞系Jurkat的质膜或粗膜囊（阴性筛选）混合。与T细胞白血病细胞系Jurkat相比，特异性针对独特表达于B淋巴瘤细胞系Ramos的抗原的结合物被选择性分离。

用于筛选的阳性和阴性细胞数目的计算

用于不同筛选轮次的细胞数量按照WO2004/023140中教导的进行计算。计算所用的反应参数如图2所示。

选定阳性和阴性细胞数量，以使三轮筛选后，对B细胞上独特表达的抗原具有特异性的结合物能与B和T细胞上以同等密度表达的抗原相比富集10,000倍。

特异性针对在第2和3轮筛选中不同种类抗原（阳性细胞富集的、阳性细胞独特的或阳性/阴性细胞常规表达的抗原）的噬菌体结合物的输入数量通过用放大因子（amplificationfactor，AF）乘以洗脱的噬菌体（特异性针对第1和2轮筛选后的不同种类抗原）的计算的数来计算。

放大因子是用相关筛选轮后得到的洗脱的噬菌体的总数除以相同筛选轮后扩增的噬菌体的总数获得。

实验方法

细胞培养

Jurkat T细胞系、克隆E6-1和Ramos B淋巴瘤细胞系，于37℃湿润的空气中，用补充了10%FCS（仅对Ramos细胞使用热灭活的）、10mM HEPES和1mM丙酮酸钠的RPMI1640中培养。细胞以1-2x10⁶细胞/ml保持（Jurkat为<1x10⁶细胞/ml）。

Jurkat T细胞质膜的制备

Jurkat细胞培养

Jurkat E6-1细胞，于37℃湿润的5%CO2空气中，保持在补充10%胎牛血清（Gibco，批号1128016）、1mM丙酮酸钠（Gibco）和10mM Hepes缓冲液（Gibco）的带有GlutamaxI（Gibco,#61870-010）的RPMI1640中，并且细胞密度在1x10⁵至1x10⁶细胞/ml之间。在最后一次的传代中，细胞被允许达到最大密度2x10⁶，在该点收集细胞。

细胞破碎

1.细胞在置于试管适配器的500ml离心管中以1500rpm，15min4℃离心从培养基中收集。

2.弃去上清并用0.145M NaCl洗涤。合并细胞悬液，细胞计数（总共5x10⁹细胞）并且重复离心。

3.细胞在1mM NaHCO₃、1.5mM MgAc pH7.4在冰上通过低渗透压休克10-30min并且随后于0℃在Yeda压力、40bar（4000kPa）进行氮空化15min而破碎。细胞浓度不超过5x10⁷细胞/ml。

4.破碎之后向匀浆悬液中加入150μl0.5M EDTA得到最终的EDTA浓度为1mM（加入EDTA防止膜囊的聚集）。

5.A)粗膜分离：匀浆（50ml）1900g（SS34转子4000rpm）离心10min以去除未破碎细胞和细胞核，并收集上清。洗涤并避免重新离心沉淀，因为脆弱的细胞核倾向于破碎，引起DNA泄漏和聚集；或

B)质膜分离：10ml的37.2%的蔗糖铺（was layered）在6x38.5ml贝克曼超速离心管的底部，并且将第2步所得的6x27ml细胞匀浆小心铺在顶部。离心管在旋出式SW28转子（标称容量6x39ml）中27000rpm、4℃离心2h45min。从离心管中在蔗糖层和样品相之间相界面的白带分离质膜，并且合并PM，分装至4x35ml试管并稀释于TE缓冲液（1mM Tris/0.25M蔗糖/0.25M EDTA缓冲液）至总体积为35ml。

6.在贝克曼45.Ti型转子（标称容量6x94ml Nalgene管）4℃、40,000rpm（大约200,000xg）超速离心1h。

7.弃去上清并采用1ml Finn移液器去除任何残留的缓冲液。用金属棒从离心管底部刮出质膜沉淀，并转到小杜恩斯匀浆器。沉淀的膜以总体积2.5ml的含有10mM Hepes的TE缓冲液（10mM Hepes/1mM Tris/0.25M蔗糖/0.25M EDTA缓冲液）用松散的配合的杜恩斯玻璃活塞匀浆5-10下重悬。大致上，来自大约2x10⁹个Jurkat细胞的膜可被重悬至每ml的重悬（TE）缓冲液。

蛋白浓度测定

蛋白浓度测定采用BCA试剂盒根据制造商的说明书进行。简要地，双BSA标准通过PBS中的2mg/ml BSA储液2倍稀释（10μl样品+10μl缓冲液）制备。产生标准曲线并用于测定膜样品的总蛋白浓度。

质膜活性（通过碱性磷酸酶分析）

碱性磷酸酶溶液

底物溶液：

每10ml硼酸盐缓冲液1片p-NPP（终浓度1.5mg/ml），于50mM硼酸钠缓冲液（pH9.8），1.0mM MgCl₂

通过将50μl样品转到50μl稀释缓冲液（50mM硼酸钠缓冲液（pH9.8），1.0mM MgCl₂）中，一式三份的样品稀释于硼酸盐/MgCl2缓冲液中。对于每个稀释，200μl底物溶液（每10ml硼酸盐缓冲液1片p-NPP至终浓度1.5mg/ml，于50mM硼酸钠缓冲液，pH9.8，1.0mMMgCl₂）加到三个样品的两个中。然后，样品在37℃孵育60+分钟。在410nm检测上清的吸光度，并减去来自未添加底物的合适对照孔（例如总氮空化的细胞匀浆，排除的细胞核和重的线粒体）的值。将结果作图并分析。

筛选程序：差异生物淘选方案（protocol）

反应参数

第一轮筛选

包含10¹⁰基因型独特噬菌粒颗粒（Amp^r）的n-CoDeR Lib2000噬菌体原液扩增至在1.6ml2%牛奶-PBS（有钙和镁）中的2x10¹³总pfu。

总反应体积2.5ml

阳性-5x10⁷个Ramos B细胞淋巴瘤细胞

阴性-来自2x10⁹个细胞的Jurkat T细胞粗膜

第二轮筛选

从前一轮筛选洗脱1.5x10¹²个噬菌体并然后扩增、沉淀并重悬于100μl2%牛奶-PBS（有钙和镁）中。

总反应体积0.5ml

阳性-5x10⁶个Ramos B细胞淋巴瘤细胞

阴性-来自1x10⁹个细胞的Jurkat T细胞粗膜囊

第三轮筛选

从前一轮筛选洗脱和扩增的1x10¹²个噬菌体重悬于100μl2%牛奶-PBS（有钙和镁）中。

总反应体积0.5ml

阳性-5x10⁶个Ramos B细胞淋巴瘤细胞

阴性-来自1x10⁹个细胞的Jurkat T细胞粗膜囊

方法

噬菌体原液37℃预热15min并间歇性涡旋。噬菌体原液在Eppendorf离心机中全速离心15min。但凡沉淀已经形成，将上清液转移到一个新的eppendorf管中并重悬在脱脂牛奶中至终浓度2%。

来源于2x10⁹个细胞（第二和三轮生物淘选的1x10⁹个细胞）的对照Jurkat细胞质膜制剂在冰上解冻。（还保存10μl用于蛋白浓度测定）解冻的质膜制剂通过加入噬菌体原液和用移液器（pipette）混合进行重悬，随后冰上孵育15分钟。

5x10⁷（第二和三轮的5x10⁶个细胞的生物淘选）个Ramos细胞4℃、1200rpm离心6min。

弃去上清，Ramos细胞重悬于不含牛奶-噬菌体的细胞膜储液中并于10℃孵育并进行慢（末端至末端）旋转4小时。

细胞/细胞膜/噬菌体孵育液转到底部含有1ml100%（台盼蓝染色的）的Ficoll以及覆盖9ml2%的BSA/PBS（有钙和镁）中的40%Ficoll-Paque Plus的15ml Falcon离心管中。离心管4℃、1500rpm离心10min，旋转180°并再离心1分钟以使细胞从管壁上移去（dislodge）。

用注射器和较高计量注射针（例如Microlance3-19GA11/21,1x40TW PM）小心地吸出含有全Ramos细胞和结合的噬菌体的界面。注射针刚刚***含有细胞的界面之下而注射针的斜切端朝上。收集细胞层（大约150μl）并且注射针以与入口相对的方向穿出离心管的塑料。注射器的内容物排出到一个新的试管中，并通过往注射针吸入新鲜的PBS洗涤两次（仍位于穿出管）。收集的细胞悬液用500μl PBS-2%BSA重悬并再次洗涤，保存上清液进行滴定。

细胞重悬于1ml PBS并转到新的15ml Eppendorf管并4℃、1260rpm离心10min。用移液器移出上清，保存上清液进行滴定。

通过加入150μl PBS中的76mM的柠檬酸（pH2.5）然后在室温孵育5min从细胞洗脱噬菌体。通过加入200μl1M Tris-HCl、pH7.4来中和混合物。然后离心细胞并保存洗脱的噬菌体。

细胞重悬于1ml胰蛋白酶并转到新试管孵育10min，然后用40μl1mg/ml抑肽酶（aprotinin）灭活。离心细胞，保存上清液进行滴定。

第1和2轮筛选后大平板上的扩增

1.10ml大肠杆菌HB101F′培养物培养（一个用于待扩增的每个筛选+一个用于OD600检测）2.5-3h，然后加入50μl过夜培养物至10ml含有15μg/ml四环素的LB（溶源性肉汤，lysogeny broth）。大约2.5h后检查一个培养物的OD。

2.OD₆₀₀=0.5时，试管用半数洗脱的噬菌体感染。

3.试管37℃、50rpm孵育30分钟，对于适当的表型于37℃、200rpm额外孵育30min。

4.以2060×g（3000rpm贝克曼GS-6）将细菌（10ml）离心10分钟以浓缩。

5.细菌重悬于部分上清（大约3ml）并铺在含有100μg/ml氨苄青霉素+15μg/ml四环素+1%葡萄糖的大的500cm²的LA（Luria琼脂）平板上。

6.平板于30℃过夜孵育。

7.通过每平板加入5ml含有100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml四环素的LB并刮板从平板上收集细菌。将平板倾斜并将溶液吸出。

8.用另外的3ml如上的LB培养基洗涤平板并与第一细菌悬液合并至50ml Falcon管中。

9.以2100×g/3000rpm贝克曼GS-6于室温将细菌离心10分钟来浓缩并重悬于1ml含有100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml四环素的LB中。

10.1ml细菌悬液中加入500μl50%甘油并且甘油原液冻存于-80℃。

11.2x10ml含有100μg/ml氨苄青霉素和15μg/ml四环素的LB用步骤10的2.5μl（5μl）甘油原液感染，并培养直到OD600=0.5。

12.每ml培养物加入6x10⁹PFU的R408辅助噬菌体，培养物37℃、50rpm孵育30分钟。

13.加入IPTG溶液至终浓度100μM（即每10ml培养物2μl的0.5M原液），该培养物25℃、175rpm过夜孵育。

扩增的噬菌体原液的收获和沉淀

1.细菌在室温、2100×g（3000rpm，在贝克曼GS-6中）沉淀10分钟，上清通过0.2μm无菌滤器无菌过滤。

2.收集来自同一筛选的试管，通过加入1/4体积噬菌体沉淀缓冲液沉淀噬菌体，4℃孵育至少4小时。

3.试管4℃、13000×g离心30分钟。

4.沉淀于4℃过夜并完全重悬于100μl PBS。

甘油原液在平板上扩增，并且过夜培养物用于微量制备（接着的第3轮筛选）。

1.10ml大肠杆菌HB101F′培养物培养（一个用于待扩增的每个筛选+一个用于OD600检测）2.5-3h，然后加入50μl过夜培养物至10ml含有15μg/m四环素的LB。大约2.5h后检查一个培养物的OD。

2.OD₆₀₀=0.5时，试管用半数洗脱的噬菌体感染。

4.加入10ml含有200μg/ml氨苄青霉素的温LB培养基，感染的细菌分成2份，每个10ml。

5.两个管中的一个里的细菌（10ml）以2100×g/3000rpm贝克曼GS-6室温离心10分钟来浓缩，重悬于小体积并铺在500cm²LA板（100μg/ml氨苄青霉素+15μg/ml四环素+1%葡萄糖）上并30℃过夜孵育。

6.微量制备：另外10ml快速离心并重悬于6ml含有1%葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的LB并30℃、175rpm过夜孵育。

10.1ml细菌悬液中加入500μl50%甘油并且甘油原液冻存于-80℃。

11.根据试剂盒制造商（BioRad）的规程，通过从3ml培养物制备Minipreps获得纯化的噬菌体-抗体DNA。

为了直接评估通过B非T差异生物淘选产生的池的抗体多样性，采用4-5-4技术（Margulies等，2005）并通过确定差异筛选的抗体池中独特CDRH3变体的数量来评估抗体多样性。

对三轮差异生物淘选（“B非T”）后获得的纯化的噬菌体-抗体DNA进行4-5-4技术的深度测序，鉴定出总共22,497个独特序列（表2）。与之相比，对从相同B非T差异生物淘选获得的噬菌体-抗体DNA应用使用Sanger测序的常规筛选仅鉴定了八个独特抗体克隆（表1）。

表2.下一代深度测序揭示了靶对非靶细胞的差异生物淘选产生的抗体池中令人惊讶的巨大抗体序列多样性。

该观察结果与我们之前报道的发现（Fransson等，2006）（B非T差异筛选的克隆的绝大多数（>99%）对癌症B细胞差异表达的表面受体是特异的）共同证实了

a)差异筛选的抗体池实际上是高度多样性的，以及

b)通过组合差异生物淘选和高通量测序，可鉴定的特异性针对差异表达的表面受体的独特抗体克隆的数量大于通过常规筛选方法获得的数量好几个数量级。

为了证实差异生物淘选及随后的高通量测序能够可重复地用来产生大量的特异性针对各种类型靶细胞中差异表达的各种表面受体的抗体，进行新的差异生物淘选/深度测序反应-这次在淘选反应“D非T”中采用***癌DU-145细胞作为靶细胞而T细胞作为非靶细胞。

再一次地，差异生物淘选产生高靶细胞特异的抗体池（图3）。对两轮（DU-145对T）差异生物淘选后获得的纯化的噬菌体-抗体DNA进行4-5-4技术的深度测序，分别鉴定出总共68,060个独特序列（表2）。

这些抗体序列的绝大多数很可能是特异性针对靶细胞差异表达的抗原，如通过>1400个随机选取的抗体克隆结合至DU-145对T细胞（图3B）的筛选和计算机计算（图9）所显示的。

得出结论：将a）应用差异生物淘选至高多样性人类抗体文库接着应用b）差异生物淘选产生的抗体池的深度测序相组合可重复产生比通过常规筛选方法可能产生的多得多的特异性针对靶细胞差异表达的表面受体的抗体克隆。

实施例2-组合差异生物淘选合随后的高通量测序产生一个定性的独特抗体克隆池-包括那些特异性针对较低表达的差异表达的表面受体的

按WO2004/023140和Frendéus，（2006）所述进行的计算机计算并应用质量作用定律教导了：当如本申请一样应用差异生物淘选时（如实施例1所例证的采用癌症B细胞或***癌细胞作为靶标），在所筛选的抗体池中回收的抗体克隆的频率将会是以下因素的直接函数：a）它们靶向的受体在靶细胞对非靶细胞表面上的绝对和相对表达以及b）它们各自对靶向的表面受体的亲和力。

这些计算进一步确定，与现行普遍的看法（Hoogenboom，2002）（Liu等，2004；Mutuberria等，1999；Osbourn等，1998）相反，特异性针对较低表达的表面受体（例如每个细胞少于20,000个）以及那些特异性针对中表达的表面受体（例如每个细胞表达20,000-50,000个受体）的抗体克隆能够并将通过本发明所述的差异生物淘选进行筛选，并将存在于所洗脱的抗体池中，尽管与特异性针对高表达的差异表达的表面受体的抗体克隆相比处于显著较低的频率（图2和9）。

几种方法目前已用于证明通过连续的差异生物淘选和深度测序产生的抗体池是独特的，因为它含有特异性针对以低和中水平表达的差异表达的表面受体的抗体克隆，并且测序深度的增加（即分析的抗体克隆序列的数量）导致特异性针对靶（对非靶）细胞上以减少（decreasing）（低）水平表达的差异表达的表面受体的抗体的鉴定。

首先，证实了通过差异生物淘选筛选的抗体池确实含有特异性针对低和中差异表达的表面受体的抗体克隆（图4、5和6）。

通过将差异筛选的抗体池进行用已被证实为靶细胞对非靶细胞差异表达并且已被通过scatchard曲线和FACS分析证实为以低至中水平在靶细胞上表达的表面受体的胞外结构域（extracellular domains，ECD）进行的一个另外的筛选（图4和5TBG），从包括特异性针对CD24、CD130和HER2表面受体的差异表达的抗体池分离了一些（十二个）特异性针对不同低和中表达的表面受体的抗体克隆（图6）。

针对每个受体的一个分离的抗体转换成IgG形式并用于scatchard和FACS分析，显示表达水平为6,000–100,000个受体/细胞（表3，图4和5）。

表3.DU145细胞与抗三个表面受体的抗体的Scatchard分析显示表达水平为6,000–100,000个受体/细胞。

受体	抗体KD(nM)	表型/细胞
			CD130	0.8	6,300
CD24	5.6	8,400
			HER-2	47	110,000

实验方法

表面受体的胞外结构域的筛选

反应参数

两轮差异生物淘选（DU-145对T，“D非T”）后洗脱和扩增的噬菌体被沉淀并重悬于PBS。100μl（对应于2.4x10¹¹个噬菌体）用于第三轮筛选。

总反应体积1.0ml

在该筛选中，噬菌体被富集针对三个表面-定位的蛋白：CD24、CD130和HER2的结合剂。

方法-ECD筛选

50皮摩尔的每种蛋白（见上文）用于在1ml0.1M碳酸钠缓冲液、pH9.5的反应体积中包被4个聚苯乙烯球（Polysciences，目录号17175-100）。包被在eppendorf管中以末端至末端旋转的方式于室温进行1小时，随后4℃不旋转孵育过夜。

包被的球用1ml TPBSB-3%（含有3%BSA、0.05%Tween-20和0.02%NaN₃的PBS）洗涤一次，用1ml TPBSB-5%（含有5%BSA、0.05%Tween-20和0.02%NaN₃的PBS）于室温以末端至末端旋转的方式孵育1h的步骤封闭1h。用1ml TPBSB-3%洗涤后，球转到新eppendorf管，加入噬菌体至封闭好的球（在总体积1ml的TPBSB-3%中）。混合物于4℃以末端至末端旋转的方式过夜孵育。

为了去除未结合的噬菌体，球用1ml TPBSB-3%洗涤三次，接着用10ml TPBS（含有0.05%Tween-20和0.02%NaN₃的PBS）洗涤三次并用10ml PBS洗涤三次。在TPBS洗涤之前，采用滤网（strainer）收集球并转到新的50ml试管，在其中进行所有随后的洗涤步骤。为了加速洗涤过程，每个洗涤步骤之后进行三分钟末端至末端旋转的室温孵育步骤。

采用滤网收集洗涤好的球并转到新的eppendorf管。结合的噬菌体通过将球与400μl0.5%胰蛋白酶以末端至末端旋转的方式于室温孵育30分钟洗脱，接着加入40μl抑肽酶（2mg/ml)）来灭活胰蛋白酶。含有洗脱的噬菌体的胰蛋白酶/抑肽酶混合物转到eppendorf管并且球用200μl PBS洗涤，随后将其与洗脱的噬菌体合并，得到总体积640μl。

甘油原液于平板上扩增，并且过夜培养物用于微量制备

该方法的这些方面都如实施例1中所述进行。

从噬菌体结合的向可溶性scFv形式的转变

这是一种转变方法，其中从噬菌粒（Amp^R）限制性消化scFv片段并***载体pKscFv-3×FH，其携带编码卡那霉素抗性的基因。

材料：

AvrII(4U/μl,New England Biolabs目录号R0174)

10×NEBuffer2(New England Biolabs目录号B7002S)

MQ水

SfiI(20U/μl,New England Biolabs目录号R0123)

10×BSA(100×BSA New England Biolabs目录号B9001S于MQ水中稀释10×)

QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen目录号28104)

SfiI/AvrII消化的pKscFv3xFH

T4DNA连接酶(1U/μl,Invitrogen目录号15224-017)

5×T4DNA连接酶缓冲液(Invitrogen,目录号P/N Y90001)

噬菌粒DNA的消化

·采用噬菌粒微制备物准备消化反应：

2μg 噬菌粒微制备物

AvrII

2 μl &DoubleRightArrow; 1 \times 10 \times NEBuffer 2

MQ水至总体积20μl

·37℃孵育2小时。

·用SfiI进行消化。对来自上面的消化混合物添加：

1 μl &DoubleRightArrow; 1 \times 10 \times NEBuffer 2

3 μl &DoubleRightArrow; 1 \times 10 \times BSA

SfiI

5μl MQ水

总体积30μl

·50℃孵育2小时。

采用QIAquick PCR纯化试剂盒、根据厂商说明书纯化消化的DNA。使用50μl水洗脱。大约50μl总浓度40ng/μl会被回收（假定100%回收）。

连接

·配制如下连接混合物：:

SfiI/AvrII消化的pKscFv3xFH

SfiI/AvrII消化的/纯化的噬菌粒微制备物

T4DNA连接酶

12.4μl MQ水

总体积25μl

·16℃过夜孵育。

·储存在-20℃，直到使用。

转化

上面生产的连接体转化入大肠杆菌TOP10。

一个试管（100μl/试管）/连接体的化学感受态TOP10细胞冰上解冻。10ng连接体加入至每个试管并且试管在冰上孵育30min。

然后将试管42℃孵育90s，并进一步冰上孵育5min。

每个试管加入900μl LB，试管于37℃、200rpm孵育1h。

每个试管的内容物铺在一个500cm²LA平板（100μg/m卡那霉素+1%葡萄糖）上并37℃过夜孵育。

集落挑取

通过采用Genetix“Q-bot”集落挑取***从大LA平板的每个筛选（CD24、CD130和HER2）总共挑取1152个克隆至3x384孔微孔板/筛选（总共9个板）。

1.混合LB培养基、20μg/ml卡那霉素和葡萄糖1%。

2.用培养基铺板（Greiner Flat384孔781101），60μl/孔。

3.根据规程（protocol）用Q-Bot挑取集落。

以384孔模式表达克隆

1.用含有20μg/ml卡那霉素的培养基铺表达平板（Greiner Flat384孔781101），50μl/孔。

2.从主平板接种表达平板，5μl/孔。

3.37℃、600rpm孵育表达平板3.5h。

4.用含有20μg/ml卡那霉素和2.5mM IPTG的培养基诱导scFv的产生，10μl/孔。

5.37℃、600rpm孵育表达平板10h。

6.储存表达平板于+4℃。

384孔克隆的筛选

材料：

CD24-GST(0.11mg/ml),Abnova目录号H00000943-H01

HER-2-Fc(0.1mg/ml in PBS),R&D Systems目录号1129-ER

CD130(0.2mg/ml),R&D Systems目录号228-GP

人IgG(6.2mg/ml),Sigma目录号I2511

抗His-HRP,R&D Systems目录号MAB050H

抗FLAG-AP,Sigma目录号A9469

鱼明胶,Sigma目录号G7765

Supersignal ELISA Pico,Thermo Scientific目录号37069

Tropix CDP Star Emerald II,Applied Biosystems目录号T2388C

程序：

第一天包被

1.用下述成分包被平板（Greiner384孔平板白HB781074)：

CD240.4皮摩尔/孔

HER20.8皮摩尔/孔

CD1300.9皮摩尔/孔

hIgG(非-靶)1皮摩尔/孔

稀释于0.1M碳酸钠，pH9.5，50μl/孔。+4℃过夜孵育平板。

第二天

2.用1xPBS,0.05%(v/v)Tween-20洗涤平板三次。

3.加入PBS+0.05%Tween-20+0.45%鱼明胶，40μl/孔。

4.加入表达的scFv，10μl/孔并室温孵育平板1小时。

5.如上洗涤平板。

6.加入稀释于PBS+0.05%Tween-20+0.45%鱼明胶的二抗；1:4000稀释的α-HIS-HRP至包被CD24,CD130和hIgG的平板，1:25000稀释的α-FLAG-AP至包被HER2和hIgG的平板，50μl/孔并室温孵育平板1小时。注意：hIgG为两个平板。

7.如上洗涤平板。用20mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，pH9.8洗涤平板三次。

8.加入底物；

对于抗His-HRP的平板，加入用20mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,pH9.81:20稀释的Pierce Supersignal ELISA Pico，50μl/孔，室温孵育平板10min。

对于抗Flag的平板，加入用20mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,pH9.81:20稀释的TropixCDP Star Emerald II，50μl/孔，室温孵育平板30min。

9.读板。

IFN-γ刺激后DU145受体表达的FACS分析

材料

Jurkat细胞

DU145细胞

胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen目录号25300-054)

rh-IFN-γ(R&D Systems目录号285-IF)

小鼠IgG Block(Jackson Immunoresearch目录号015-000-002)

FACS缓冲液(Gibco目录号14040PBS w/o Ca和Mg+0,5%BSA)

Zenon Alexa Fluor647人IgG标记试剂盒(Invitrogen目录号Z25408)

INF-γ刺激

DU145细胞用250IE INF-γ刺激24h。用细胞解离缓冲液收获细胞。

流式细胞术方法

细胞在FACS缓冲液中洗涤一次，采用FACS缓冲液中50μg/ml的小鼠IgG冰上封闭10分钟。同时，根据制造商的说明书用Zenon AF647标记抗体。

50μl细胞悬液（大约500,000个细胞）转到FACS管并加入50μl标记的抗体，然后冰上孵育1h。

然后，FACS缓冲液用于洗涤细胞并且所得的悬液用流式细胞仪（BD Bioscience,FACSCalibur）分析。

IFN-γ刺激后DU145受体表达的Scatchard分析

INF-γ刺激

DU145细胞用250IE INF-γ刺激24h。用细胞解离缓冲液收获细胞。

Scatchard分析

抗体采用游离碘和用氧化剂非水溶性碘化试剂（Iodogen）（1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基氨基醚（1,3,4,6-tetrachloro-3α,6α-diphenylglycoluri）,Thermo scientific）预包被的试管根据制造商的说明进行¹²⁵I标记。简要地，200μg抗体在PBS中标记10分钟，用小的一次性脱盐柱（NAP5，GE Healthcare Life science）去除游离碘。标记的抗体具有大约2.5μCi/μg抗体的特定活性，用纸层析估算包含少于1%游离碘。

0.5x10⁶个细胞与不同浓度的¹²⁵I标记的抗体孵育2.5h（冰浴上）。游离的未结合抗体（F）通过40%Ficoll垫（Ficoll-cushion）离心从细胞结合的抗体（B）分离，样品在γ计数器中进行分析。

表4（与图6相关）特异性针对低和中表达的表面受体的抗体的大量鉴定需要差异筛选的抗体池的深度测序。

该表显示特异性针对每个表达的表面受体的回收的抗体克隆的数量是测序的抗体克隆的数量的函数（function）。个体抗体克隆的受体特异性如图6所述的确定。

来源于差异筛选的抗体池的96个克隆的类似筛选鉴定了47条特异性针对高表达的表面受体ICAM-1的序列（表4）。

接下来的疑问是，特异性针对分别以高、中和低水平表达的表面受体的抗体（序列），是否是通过测序91、255或813或随机选取的抗体克隆或按照～290,000随机挑取的抗体克隆的深度测序鉴定的。

CD54通过scatchard分析鉴定为250,000拷贝/细胞的高表达的表面受体（数据未显示）。来源于差异筛选的抗体池“D非T”的96个克隆的筛选鉴定了特异性针对CD54的47个克隆（表4）。100,000拷贝/细胞的HER2代表高表达的表面受体，8,000拷贝/细胞的CD24以及6,000拷贝/细胞的CD130代表低表达的表面受体（图4和5）。

特异性针对高表达的表面受体ICAM-1的抗体（序列）通过所有筛选方法均得到鉴定（表4和数据未显示）。相反，多至813随机挑取的克隆的常规筛选没有鉴定出特异性针对低表达的表面受体的抗体（表4）。引人注目并形成鲜明的对比的是，通过深度测序鉴定出特异性针对低表达的CD24和CD130表面受体的抗体。

特异性针对高、中和低表达的差异表达的表面受体的回收抗体的增加的测序深度的效果按如下方法进行检查：

确定了在三个随机选择的规模越来越大的（分别为91个克隆、255个克隆和813个克隆）的结合物池的抗体克隆序列。此后，在所有三个池中均发现的克隆（“富克隆”）、仅在两个较大池中发现的克隆（“较低频克隆”）或仅在最大的池中发现的克隆（“稀有克隆”）通过FACS分析其与DU145细胞的结合。

由富克隆、较低频克隆和稀有克隆靶向的受体的平均靶表达水平随着其在差异筛选的抗体池中越来越少（decreasing prevalence）而降低，证实增加（increasing）的测序深度导致特异性针对靶（对非靶）细胞上以降低（decreasing）（较低）水平表达的差异表达的表面受体的抗体的鉴定。

实施例3-推导差异生物淘选方程

通过应用质量作用的普遍规律（LMA），可以计算从高多样性的展示文库分离针对低表达配体和/或差异表达的配体的抗配体所需的配体数量。

LMA表明，抗配体A和它的靶配体T以及它们的复合体AT之间的非共价的（氢键、静电、范德华力或疏水作用力）、可逆的结合由平衡相互作用A+T

AT以平衡解离常数或亲和力K_d=[A][T]/[AT]给出。

具有相同的针对靶配体（T）的特异性的抗配体之间的平衡相互作用可以描述为

结合的A(bA)

游离的A(fA)+游离的T(fT)

以

Kd = [fA] x \frac{[fT]}{[bA]} - - - (I)

已知总A或T是游离的和结合的A或T的总和

即，[A](总A)=[fA]+[bA]，以及[T](总T)=[fT]+[bA]

因此，在(I)中，用[A]-[bA]代替[fA]，以及用[T]-[bA]代替[fT]

K_{d} = ([A] - [bA]) x \frac{[T] - [bA]}{[bA]} - - - (II)

重新排列形成

(K_dx[bA])=([A][T]-[A][bA])-([T][bA]-[bA]²)

0=[bA]²-([A]+[T]+K_d)[bA]+[A][T]

此联立方程式的解为

[bA] = \frac{([A] + [T] + K_{d})}{2} &PlusMinus; \sqrt{\frac{{([A] + [T] + K_{d})}^{2}}{4} - [A] [T]}

其中负根是相关的一个：

[bA] = \frac{([A] + [T] + K_{d})}{2} - &PlusMinus; \sqrt{\frac{{([A] + [T] + K_{d})}^{2}}{4} - [A] [T]}

把浓度用颗粒数/每摩尔的颗粒数（C）/体积单位（V）带入得到

\frac{bA}{(CxV)} = \frac{(\frac{A}{CxV} + \frac{T}{(CxV)} + K_{d})}{2} - \sqrt{\frac{{(\frac{A}{(CxV)} + \frac{T}{(CxV)} + K_{d})}^{2}}{2} - \frac{AT}{{(CxV)}^{2}}}

并简化为

bA = \frac{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}{2} - \sqrt{\frac{{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}^{2}}{4} - AT} - - - (III)

其中A=抗配体A的总数

T=配体T的总数

V=反应体积(升)

C=阿伏伽德罗常数(6.022x10²³颗粒/摩尔)

只要LMA应用于具有给定的针对它们各自靶配体的亲和力和特异性的不同抗配体之间的每个反应，那么就可以通过应用LMA和方程（III）计算筛选方法后结合至配体的抗配体的数量。

此外，如果在与减法或靶配体的群相关的抗配体之间没有质的差别，即，在方法过程中配体的理化性质没有改变，那么已经平衡结合到靶配体的抗配体的数量将会等于结合的抗配体的总数（其已经乘以靶配体构建体上靶配体对总配体（减法和靶配体）的比）：

介绍（Introducing）

Cp=靶配体构建体的数量

C_S=减法配体构建体的数量

T_P=C_p上的T配体数量

T_S=C_s上的T配体数量

如果混合靶和减法构建体，那么配体的总数将会是：

T_Tot=(T_P x C_P+T_S x C_S)

并且平衡结合至阳性构建体（bA_P）的抗配体的数量（A）由下式给出：

{bA}_{p} = bAx \frac{(T_{p} x C_{p})}{T_{Tot}} - - - (IV)

此外，方程（III）和（IV）的组合得到

{bA}_{p} = {\frac{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}{2} - \sqrt{\frac{{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}^{2}}{4} - AxT}} x {\frac{(T_{p} x C_{p})}{((T_{p} x C_{p}) + (T_{s} x C_{s}))}} - - - (V)

实施例4-优化配体浓度

实施例1例证的方程显示，第一减法配体和第二靶配体二者的高浓度运用有助于特异性针对低表达和差异表达的配体的抗配体的有效回收，以及降低特异性针对常规表达的配体的抗配体。

配体浓度可以通过几种方式提高。在所有的情况下，从配体二维结合（结合至二维固相）变为使用在悬液或溶液中的游离配体（三维）均可以提高配体浓度。

当结合依赖于以其天然构型使用的配体时，例如对于细胞表面配体，那么通过增加配体构建体表面积对配体构建体体积的比可以使得配体浓度最大化。

例如，细胞表面抗原可以以悬液中小的游离质膜囊的形式使用，与采用固定于2维表面的全细胞相反。这具有额外的提高配体在悬液或溶液中的稳定性的好处，从而促进配体-抗配体的平衡相互作用。

如果配体源为球形（或大致上球状），这在数学上描述为以下方程：

Ap/Vp=(4πr²)/(4πr³/3)=π/3r

其中Ap=球面积

Vp=球体积

即球的半径越小，配体/体积的比越大并且更多的颗粒状（悬浮状）配体。

实施例5-优选实施方案

在优选的方面，本发明用来分离特异性针对以其天然构型存在并独立于其性质的细胞表面抗原（蛋白质、碳水化合物、脂类、复合体）的抗配体。此外，被结合的抗原是那些与另一细胞类型（如转化的癌细胞、病毒/微生物/寄生虫/真菌感染的细胞或其他激动剂刺激的或感染激活的细胞对对照细胞）相比上调或独特表达于一种细胞类型上的。

当运用于抗体来源的抗配体（例如，编码scFv-、Fab-或Fv-的抗配体）的筛选时，该方法，同时以筛选过程，产生治疗性候选抗体，其以其天然构型在细胞膜上与靶抗原发生作用。

因为需要这种大浓度的抗原，抗原以不损害平衡反应的形式使用。因此，抗原以占用最小空间并且很少增加粘度和剪切力的形式使用。

例如，当寻求针对细胞表面抗原的抗配体时，利用靶标全细胞和与高多样性分子抗配体文库成员混合的过量减法细胞膜的竞争性生物淘选方法可被使用，然后是Ficoll或Percoll/牛血清白蛋白梯度上的密度分离和靶细胞以及特异性针对靶细胞上调的和独特抗原的靶细胞和抗配体的选择性分离。

在这种方法中，靶配体（抗原）群是以全细胞（高密度）的形式，减法配体（抗原）是以质膜囊或去核细胞（低密度）的形式。

靶和减法抗原群与高多样性分子文库以基于本发明方程的受控方式混合。

例如，5x10⁷个靶全细胞与1x10¹⁰个减法细胞的细胞膜囊混合，并与来自高多样性文库的成员以抗配体特异性拷贝数200（当在纯抗原上筛选时通常产生抗配体的Kd=10^-8M）进行混合，可以预期分离特异性针对10倍或更上调的抗原（包括那些以10,000每靶细胞的低密度表达的）的抗配体。

孵育反应以达到平衡。在竞争性生物淘选后，结合至靶群的文库成员通过密度离心分离从未结合的抗配体和那些结合至对照减法抗原的抗配体分离，导致特异性针对在所研究的群中存在的高表达抗原的噬菌体的富集。

当期望的靶抗原表达在减法群中更高时，该方法是反向的，以使减法配体群成为靶配体群，反之亦然。

除了产生特异性针对差异表达和独特配体的抗配体，使用基于密度梯度的不同密度分离装置提供几种好处，包括：

·在物理上和空间上从未结合的抗配体和特异性针对发现于对照群中的配体的抗配体分离络合至阳性配体的抗配体。

·Ficoll洗涤提高剪切力。因此，这种洗涤更有效以及需要更少的重复洗涤（淘洗轮）；并且，感兴趣的抗配体的特异性结合有最小的解离（更高亲和力）。

·不需要可能改变细胞表面配体构型/构像和/或组成的标签或细胞的化学修饰（与基于FACS（荧光激活的细胞分选）或MACS（磁性激活的细胞分选）的竞争性生物淘选相比）。

实施例6-作为分离装置的所有膜囊

全细胞可由在更高密度介质中产生的膜囊代替，允许使用甚至更高浓度的配体而不损害平衡反应。

实施例7-测试刺激对配体上调/下调的作用

本发明的进一步的实施方案可以用于分离特异性针对细胞配体的抗配体，所述细胞配体以非常低密度、仅在所研究的细胞群里的少量细胞中表达。

例如，某种刺激可能怀疑引发存在于血液中存在的未知细胞亚群上的细胞表面抗原的上调或下调。

源自全血的、暴露于该刺激的细胞可能在暴露于该刺激之前与源自全血的质膜混合，并且竞争性生物淘选反应类似于上述的那些。

实施例8-该筛选方法的诊断用途

本发明的另一个实施例允许针对在生物样品（例如血浆、尿液、脑脊髓液）中以不同丰度存在的配体的抗配体被从高度多样性的分子文库中分离。此类抗配体可以随后用于例如蛋白表达分析和潜在生物标记的鉴定。

如果使用足够高浓度的配体，当比较在两种不同样品中的蛋白质组合物时，本发明的方法允许针对上调或独特配体的抗配体的选择性分离。这最终允许特异性针对与另一个群相比，在一个群中更丰富的配体的抗配体的分离，以独立于在阳性配体群里的相对配体浓度的方式。

归因于完成后者需要的配体的极端浓度，优选使用悬液或溶液中的配体。例如，靶群配体可被分开并在几个不同位置作标记以最大限度地减少相关配体的破坏和消灭，而减法群配体可以无标签的或模拟处理的方式使用。阳性配体群的标记提供随后回收阳性群配体和结合至阳性群配体的结合物的方式，仅通过使用络合至例如反向标记的磁珠的标记配体即可。

应用该方法将会从患有某种疾病的患者群合并血浆样品并与来自对照群的血浆样品比较。在该种情况下，患者血浆样品将会被分开并作好标记，而对照群将会是未作标记的。

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Claims

1.一种分离针对至少一种差异表达的靶配体的至少一种抗配体的方法，包括以下步骤：

（a）对抗配体的文库进行差异生物淘选以分离至少一种抗配体；以及

（b）对步骤（a）中分离的抗配体进行高通量测序。

2.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

（c）对特异性针对差异表达的配体的抗体进行验证筛选。

3.如前述权利要求任一项所述的方法，其中差异生物淘选步骤包括以下子步骤：

（i）提供抗配体的文库；

（ii）提供含有固定至或整合入减法配体构建体的配体的第一配体群；

（iii）提供含有固定至或整合入靶配体构建体的、与步骤（ii）的配体相同的配体的第二配体群；

（iv）通过使用从质量作用的普遍规律得出的一个或多个方程确定群中减法配体构建体和靶配体构建体的量：

\frac{{[C]}^{c} {[d]}^{d}}{{[A]}^{a} {[B]}^{b}} = K_{eq},

其中：

A,B,C&D=在该反应中的参与者（反应物和产物），

a,b,c,&d=平衡的化学方程所需的系数，

从而允许针对差异表达的靶配体的抗配体的分离；

（v）提供步骤（iv）中确定的减法配体构建体的量；

（vi）提供步骤（iv）中确定的靶配体构建体的量；

（vii）提供从结合至减法配体构建体的抗配体中分离结合至靶配体构建体的抗配体的分离装置；

（viii）将（i）的文库暴露于由（v）和（vi）提供的配体构建体以使抗配体与配体结合；以及

（ix）使用分离装置分离与固定至或整合入靶配体构建体的配体结合的抗配体。

4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中高通量测序步骤利用454测序、Illumina、SOLiD方法或Helicos***进行。

5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中验证筛选步骤利用流式细胞术、FMAT、ELISA、MSD或CBA进行。

6.如权利要求3所述的方法，其中配体不表达于靶构建体或减法构建体之一。

7.如权利要求3或6所述的方法，包括从配体释放抗配体的进一步步骤。

8.如权利要求3或6或7所述的方法，其中步骤（ii）至（ix）平行进行，以分离针对多个不同配体的多个抗配体。

9.如权利要求3或6-8所述的方法，其中步骤（ii）至（ix）重复一次或多次。

10.如权利要求3或6-9所述的方法，其中减法构建体或靶构建体之一的量以过量于减法构建体或靶构建体另一个的方式提供。

11.如权利要求10所述的方法，其中配体的过量在10和1000倍之间或在2和10倍之间或1000和1,000,000倍之间。

12.如权利要求3或6-11所述的方法，其中步骤（iv）的方程是：

bA = \frac{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}{2} - \sqrt{\frac{{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}^{2}}{4} - AxT}

其中

bA=结合的抗配体

A=抗配体的总数

T=配体的总数

C=阿伏伽德罗常数(6.022x10²³颗粒/摩尔)

V=反应体积(升)

K_d=平衡解离常数；

或是

bA = {\frac{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}{2} - \sqrt{\frac{{(A + T + (K_{d}) x (CxV))}^{2}}{4} - AxT}} x {\frac{T_{p} x C_{p}}{((T_{p} x C_{p}) + (T_{s} x C_{s}))}}

其中

bA_p=结合的抗配体

T_p=C_p上的配体数量

T_s=C_s上的配体数量

C_p=靶配体构建体的数量

C_s=减法配体构建体的数量

A=抗配体的总数

T=配体的总数

C=阿伏伽德罗常数(6.022x10²³颗粒/摩尔)

V=反应体积(升)

K_d=平衡解离常数。

13.如权利要求3或6-12所述的方法，其中分离装置选自固相支持物、细胞膜和/或其部分、合成膜、珠子、化学标签和自由配体的至少一种。

14.如权利要求3或6-13所述的方法，其中减法构建体和靶构建体的分离装置具有不同的密度。

15.如权利要求3或6-14所述的方法，其中减法构建体的分离装置为膜囊或整个细胞膜。

16.如权利要求3或6-15所述的方法，其中步骤（ix）利用密度离心、固相支持封存、磁珠封存、化学标签结合和水相分配的至少一种进行。

17.如前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤（a）的文库是包含多个展示抗配体的文库成员的展示文库。

18.如前述权利要求任一项所述的方法，其中文库是噬菌体展示文库。

19.如前述权利要求任一项所述的方法，其中配体是抗原；受体配体；以及含有碳水化合物、蛋白质、肽、脂类、多核苷酸、无机分子和缀合分子的至少一种的酶靶标的至少一种。

20.如前述权利要求任一项所述的方法，其中抗配体文库可通过抗体和抗原结合性变体、其衍生物或其片段；具有工程化的可变表面的支架分子；受体；和酶的至少一种进行构建。

21.如权利要求3或6-20所述的方法，其还包括暴露配体及其分离装置至影响靶配体在所述配体构建体上的表达的刺激物的进一步步骤。

22.一种制备药物组合物的方法，其包括，在通过前述权利要求任一项所述的方法鉴定具有期望性质的抗配体后，将所述抗配体加至药学上可接受的载体。

23.由权利要求22的方法制备的药物组合物，其用于医药中。

24.权利要求23的药物组合物在制备用于预防、治疗、成像、诊断或预后疾病的药物中的用途。

25.实质上如本发明实施例和附图所述的方法。