CN103820515B - 制备抗体F(ab’)2片段的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使用胃蛋白酶及阳离子交换树脂制备与纯化抗体F(ab’)₂片段的方法。本发明还提供一种使用所述方法所制备的包含抗体F(ab’)₂片段的医药组合物，包含一或多种药学上可接受的载剂。

Description

制备抗体F(ab’)2片段的方法

技术领域

本发明关于一种制备抗体F(ab’)₂片段的方法，特别是一种使用阳离子交换树脂进行纯化，且无需使用硫酸铵或硫酸钠沉淀，以获得高回收率、高纯度的抗体F(ab’)₂片段的制备方法。

背景技术

由于抗体可专一性连结抗原的特性，目前已有许多抗体应用于治疗的用途，例如应用于对抗传染疾病（例如，细菌、病毒、寄生虫等感染）、癌症、药物或是其他异物的治疗。在抗体的结构中，以IgG为例，经由胃蛋白酶（Pepsin）的水解作用可将抗体分为F(ab’)₂及Fc两部分，F(ab’)₂以双硫键结合两个抗原结合部位，分子量约为110kDa。

由于F(ab’)₂片段移除Fc部分，故可免除抗体与细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、NK细胞和B细胞）的Fc受体的之间的非专一性结合且由于其分子较小，更能有效地渗透组织，此外，由于移除Fc部分，做为检测时可不受到抗Fc抗体引起的检测干扰，应用在检测上有更高的灵敏度，因此在安全性及效能上较IgG更好。

生产抗体F(ab’)₂片段用于治疗用途，往往涉及许多目的在保持其有效性的步骤，同时通过纯化以减少副作用的发生率和严重性。这些步骤包括硫酸铵或硫酸钠沉淀、酶消化、热凝、渗滤，近来更用到离子交换及亲和性管柱层析。其中，较精致的方法为自血清中纯化抗体，然后经蛋白酶水解产生F(ab’)₂片段，再经沉淀法及管柱层析法，将F(ab’)₂片段与Fc水解物及蛋白酶分离。也有自血清先以蛋白酶水解再以分段的硫酸铵或硫酸钠沉淀加上层析管柱分析。这些制备的步骤可得到有效及安全的F(ab’)₂产 品，但制备的成本相当高。此外，制备方法中如用到硫酸铵或硫酸钠沉淀的步骤，将相当费时且回收率损失相当高，造成制造成本大幅增加。为了达到避免硫酸铵沉淀步骤的目的，已有相关研究应用Q-Sepharose管柱加上切流过滤***（Tangential flow diafiltration）来纯化F(ab’)₂，可无需使用硫酸铵沉淀（Jones et al.,Journal of Immunological Methods(2003)275(1-2),239-250）。但此纯化方法实施时需监控水解的状态，使抗血清的水解产物除F(ab’)₂外，其他的成分都小于13kDa才能达到纯化的目的。此条件除了容易造成过度水解外，也可能只能在特定血清样品才能实施，其报告中所用的样品，IgG为其血清蛋白质的主要成分，含量大于其他蛋白质（含白蛋白）成分的总和。

因此，仍需要进一步改善制备抗体F(ab’)₂片段的方法，以缩短制备时间、降低制备成本及提高纯化回收率，以获得高纯度及质量的抗体F(ab’)₂片段。

发明内容

本发明提供制备与纯化抗体F(ab’)₂片段的方法，以及使用所述方法所制备的包含抗体F(ab’)₂片段的医药组合物。

在一方面，本发明提供一种制备抗体F(ab’)₂片段的方法，其包含下列步骤：（1）将抗体以胃蛋白酶（Pepsin）水解以获得抗体F(ab’)₂片段；（2）将抗体F(ab’)₂片段以过滤***进行浓缩并置换缓冲液，其中缓冲液的置换使抗体F(ab’)₂片段带有正电荷；以及（3）将抗体F(ab’)₂片段以阳离子交换管柱进行纯化，并以盐类水溶液置换经纯化的抗体F(ab’)₂片段。其中经纯化的抗体F(ab’)₂片段不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。

较佳地，将经纯化的抗体F(ab’)₂片段可以第二过滤***进行浓缩并根据使用需求置换第二缓冲液。

在本发明的具体实施例中，所述过滤***可为切向流过滤***（Tangential FlowFiltration System）。

在本发明的具体实施例中，所述缓冲液的pH值小于所述抗体F(ab’)₂ 片段的等电点（pI）值，例如，所述缓冲液可为pH 4.3的醋酸钠溶液。

在本发明的具体实施例中，所述盐类水溶液可为浓度约0.1M至约2M的氯化钠（NaCl）水溶液。

在本发明的具体实施例中，所述第二缓冲液可为生理食盐水。

在本发明的具体实施例中，所述第二过滤***可为切向流过滤***（TangentialFlow Filtration System）。

在本发明的具体实施例中，所述抗体可为免疫球蛋白（immunoglobulin），例如，IgG、IgA或IgM。

另一方面，本发明提供一种包含抗体F(ab’)₂片段的组合物，其中所述抗体F(ab’)₂片段是由本发明所述的方法所制得，且所述组合物不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。

又一方面，本发明还提供一种包含抗体F(ab’)₂片段的医药组合物，包含一或多种药学上可接受的载剂，其中所述抗体F(ab’)₂片段是由本发明所述的方法所制得，且所述医药组合物不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。

附图说明

前文的所述以及实施方式可通过说明书附图达到更好的说明效果。为了加强本发明的说明，将适当的实施例的附图列举于此。

图1显示以阳离子交换树脂进行抗体F(ab’)₂片段的分离与纯化的层析图，其中标示为unbound的波峰代表未与管柱结合的物质，而后分别以0.2M与1.0的NaCl，以及0.1MNaOH冲提管柱。

图2显示抗体F(ab’)₂片段制备过程中各阶段的产物以SDS-PAGE进行分析并以考马斯蓝（commassive brilliant blue）染色的结果图。M：分子量标记；1：未经水解与纯化的含有猪抗CDV抗体的血浆，其中PSA代表猪血清白蛋白，IgG抗体的分子量约为135kDa；2：前述血浆经胃蛋白酶水解后的产物；3：前述水解产物经50kDa超过滤膜进行透析、置换缓冲液的产物，相较于使用超过滤膜透析前，蛋白质组成分并无差异，显 示超过滤膜透析并无法获得分离纯化的效果；4：阳离子交换管柱的过滤液；5：阳离子交换管柱经0.2M NaCl冲提管柱的洗出物，可观察到经分离纯化的抗体F(ab’)₂片段。

图3显示以西方墨点分析确认抗体F(ab’)₂片段的存在与纯化程度。此处使用兔子抗猪只IgG F(ab’)₂片段的抗体（NOVUS）为初级抗体用以侦测。1：含有猪抗CDV抗体的血浆经胃蛋白酶水解的产物；2：前述经水解的血浆以阳离子交换树脂纯化后0.2M NaCl的冲提产物；3：前述经水解的血浆以阳离子交换树脂纯化后0.5M NaCl的冲提产物。

图4显示经CDV感染的不同批次猪只的血清样品分析结果，将总蛋白质含量相等的血清样品以SDS-PAGE进行分析并以考马斯蓝（commassive brilliant blue）染色。M：分子量标记；1、2、3：不同批次猪只的血清样品。

图5显示本发明的抗体F(ab’)₂片段制备方法可适用于高浓度IgG的血清样品。经免疫的猪只血清以及经纯化的产物以SDS-PAGE进行分析并以考马斯蓝（commassivebrilliant blue）染色。M：分子量标记；1：未经水解与纯化的含有猪抗CDV抗体的血浆，其中PSA代表猪血清白蛋白，IgG抗体的分子量约为135kDa；2：前述血浆经胃蛋白酶水解及阳离子交换树脂纯化后的产物。于高浓度IgG血清（血浆）样品中，抗体F(ab’)₂片段的回收率仍可大于90%。

具体实施方式

除非另外定义，本文中所用的所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常理解的相同意义。

当用于此处时，本文所使用冠词“一”或“该”意指该冠词文法上的受词为一或一以上（亦即至少为一）。举例而言，“一组件”代表一组件或多于一组件。

本文所用的术语“大约”、“约”、或“近似”一般而言应意谓指定数值或范围的20%以内，较佳者为10%以内，且更佳者为5%以内。本文所 给予的数量皆为近似值，意谓术语“大约”、“约”、或“近似”如未明确陈述亦可推论。

抗体，也称为免疫球蛋白，其存在于个体的血清中并为免疫***的一部分，通过与特定抗原的结合与中和，并诱导后续的免疫反应以达到保护个体免于外来物质，例如病原体，入侵的功能。由于抗原与抗体之间特异性结合的特性，目前在产业上已有各种应用，例如，检验、检测、预防及治疗疾病等。在目前已知的抗体中，例如，IgG、IgM、IgA、IgE，以IgG在血液中的含量最高，且由于IgG为成熟免疫反应的产物因此应用广泛。

当以酵素分解IgG时，依据使用的酵素可获得不同的产物，例如，当使用木瓜酵素（papain）时，IgG会分解成一个Fc片段（crystallizingfragment）及两个Fab片段（antigen-binding fragment），若使用胃蛋白酶（pepsin）时，则可获得一个F(ab’)₂片段及一个Fc片段。Fab片段及F(ab’)₂片段仍保留可特异性结合抗原的特性，而F(ab’)₂片段更具有沉淀抗原的功能。相对于此，Fc片段则扮演信号标记的角色，吸引并活化巨噬细胞、嗜中性白血球等而辨识并吞噬抗原抗体复合物。此外，当异种的抗体进入个体中时，Fc片段因其抗原决定部位的特定序列会被视为外来物质，故诱发严重免疫反应而造成副作用，因此目前在产业利用上多将抗体以酵素处理以去除Fc片段、保留Fab片段及F(ab’)₂片段，且由于Fab片段及F(ab’)₂片段的分子较小，更能进入有效地渗入组织提高功效。

目前产业上针对F(ab’)₂片段制备方法，大部分是先纯化抗体后再以蛋白酶水解将Fc切除，再以亲和性管柱或其他特性的层析法将产物分离。此类的方法操作的风险较低，但过程较长且花费惊人，一般只用在研究实验室的小量制备。而应用于大量制备的制程时，多以胃蛋白酶直水解血清或血浆，再以硫酸铵沉淀将F(ab’)₂片段和其他的水解产物做粗分离，但此步骤是个耗时的工作，一般沉淀、固液分离及沉淀物的再溶解透析，最少需2个工作日，再者固液分离在大量操作时需要的设备和滤膜耗材也是很大的花费。而且硫酸铵沉淀中F(ab’)₂片段的纯度和回收率是个两难的抉择，工业上常用的13%硫酸铵可得到较纯的F(ab’)₂片段但其回收率低于50%，45%硫酸铵可将F(ab’)₂片段几乎都沉淀下来但无法与其余蛋白 质分离。此外，以硫酸铵沉淀做粗分离，仍需要经阴离子交换树脂做进一步的纯化。

为了克服硫酸铵沉淀的两难困境，Jones和Landon已报导将血清或血浆中蛋白质水解为小分子胜肽，再以透析的方式分离F(ab’)₂片段（Joneset al.,Journal ofImmunological Methods(2003)275(1-2),239-250）。然在这个方法中，需要持续监控胃蛋白酶的水解反应，并具有两个反应终点要观察，其一为抗体需水解为F(ab’)₂，但过度的水解会使F(ab’)₂产率降低甚至失去活性；另一为需控制血清或血浆中的其他蛋白质都水解为小分子胜肽（13kDa），这两个反应终点很难同时达到，因此在产业上使用仍有其局限性。

有鉴于此，本发明提供一种制备抗体F(ab’)₂片段的方法，其包含下列步骤：（1）将抗体以胃蛋白酶（Pepsin）水解以获得抗体F(ab’)₂片段；（2）将抗体F(ab’)₂片段以过滤***进行浓缩并置换缓冲液，其中缓冲液的置换使抗体F(ab’)₂片段带有正电荷；以及（3）将抗体F(ab’)₂片段以阳离子交换管柱进行纯化，并以盐类水溶液置换经纯化的抗体F(ab’)₂片段。其中经纯化的抗体F(ab’)₂片段不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。较佳地，经纯化的抗体F(ab’)₂片段可以第二过滤***进行浓缩并根据使用需求置换第二缓冲液。如此，通过上述方法不但可克服硫酸铵沉淀步骤所造成的低回收率或低纯度，更可缩短制备时间、降低制备成本及提高纯化回收率，进而获得高纯度及品质的抗体F(ab’)₂片段。

本文所用的术语“抗体”是指完整抗体，“抗体片段”是指完整抗体中包含F(ab’)₂片段的抗原结合片段，其仍保有与抗原特异性结合的功能而可替代完整抗体的功能。在一实施例中，抗体与抗体片段可由重组DNA技术制得，在另一实施例中，抗体与抗体片段可由自然来源获得，其中抗体片段亦可由完整抗体经化学或酵素作用而获得。

使抗体水解而获得F(ab’)₂片段的胃蛋白酶有效量可由所属技术领域的技术人员依所需水解的抗体含量、胃蛋白酶的活性加以决定，在本发明 的具体实施例中，胃蛋白酶的最终浓度为0.05%（w/v）。

在本发明的具体实施例中，使抗体F(ab’)₂片段带有正电荷的缓冲液为酸性，例如，具有介于约2.0至6.0的pH值，较佳为介于3.0至5.0，所属技术领域的技术人员可理解任何可使抗体F(ab’)₂片段带有正电荷的缓冲***皆可应用，所述缓冲***包含但不限于，醋酸、柠檬酸、磷酸、2-吗啉乙烷磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid,MES）。

另一方面，本发明提供一种包含抗体F(ab’)₂片段的组合物，其中所述抗体F(ab’)₂片段是由本发明所述的方法所制得，且所述组合物不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。

其中所述组合物还可包含使抗体F(ab’)₂片段半衰期延长的载体，例如但不限于线型高分子聚合物（如，PEG）、支链高分子聚合物、脂质、胆固醇、醣类、寡糖、以及合成或自然生成的蛋白质、聚肽、胜肽。

又一方面，本发明还提供一种包含抗体F(ab’)₂片段的医药组合物，包含一或多种药学上可接受的载剂，其中所述抗体F(ab’)₂片段是由本发明所述的方法所制得，且所述医药组合物不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。

在预防及治疗的应用上，本发明的抗体F(ab’)₂片段或其衍生物可与药学上可接受的载剂调配成医药组合物。此处所使用的“药学上可接受”意指该载剂是与包含于该组合物中的活性成分兼容，能更好地稳定该活性成分而不会对投予该医药组合物的对象产生伤害。所述载剂可为该活性成分的稀释剂、载体、赋形剂或介质。适合载剂的实例包含生理兼容缓冲液，如汉克氏溶液、林格氏溶液、生理食盐水缓冲液、乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钙、海藻胶、黄耆胶、明胶、硅酸钙、微晶型纤维素、聚乙烯咯啶酮、纤维素、无菌水、糖浆及甲基纤维素。所述医药组合物可额外包含润滑剂，例如，滑石、硬脂酸镁及矿物油；润湿剂；乳化与悬浮剂；保存剂，例如，甲基-及丙基-羟基苯甲酸盐；甜味剂；以及调味剂。

根据本发明的医药组合物可为片状、药丸、粉末、锭剂、囊袋、药包、 药酒、悬浮液、乳化液、溶液、糖浆、软明胶胶囊与硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液及经包装的粉末形式。

本发明的医药组合物可经由任何生理可接受途径传送。此些途径包含但不限于非经口服投药、***性投药、口服投药、鼻腔投药、直肠投药、腹腔注射、血管注射、皮下注射、经皮投药、吸入投药及肌肉注射。

本发明是通过下列范例进一步说明，此仅提供而用于展现而非限制的目的。由于本发明，本领域的技术人员应可理解所公开的特定具体实施例，并对所述些具体实施例进行诸多修改而获得相似或类似的结果而仍未脱离本发明的精神与范畴。

实施例

材料及方法

抗体的制备

以犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）免疫猪只，并通过增强（boost）免疫提高猪只血液的中和抗体效价。采集猪只血液样品，若需求为血浆，将血液样品缓慢注入至含3.2%柠檬酸钠溶液的采血袋至最终体积比为9：1，轻摇数分钟使血液与抗凝血剂混合。若需求为血清，则将血液样品注入无菌试管内，倾斜放置10-30分钟，待血液凝固后收集以免溶血影响后续分析。将上述样品经离心以分离上清液与固形物，分别获得的上清液为血浆样品或血清样品。

F(ab’)₂片段的产制

胃蛋白酶（pepsin）处理

经由上述步骤所获得的含有抗CDV抗体的血清或血浆先于58℃加热30分钟以使病毒去活化，接着进行胃蛋白酶水解或-80℃冷冻保存备用。

于进行胃蛋白酶水解反应前，取1L含有抗CDV抗体的血清或血浆加入等体积的超纯水进行稀释，接着加入预先溶于0.1N HCl的10%胃蛋白酶（SIGMA-ALDRICH）至最终浓度为0.05%（w/v），随后以5N HCl缓缓注入上述溶液中以调整pH值至约pH 3.2±0.1。将含有胃蛋白酶的猪 血清（浆）溶液置于37℃下反应2小时进行水解反应，而后将溶液移置4℃冰箱中以中止反应待后续透析。

浓缩及缓冲液置换

经胃蛋白酶水解的猪血清（浆）溶液接着以切向流过滤***（TangentialFlowFiltration Systems）进行浓缩及缓冲液置换，切向流过滤***在此处使用孔径为50kD，膜面积为0.11m2的膜匣（GE Healthcare Life Sciences；Kvick Lab Cassette-UFELA0050010ST）。猪血清（浆）溶液经浓缩至50%体积后，继续以10倍体积的50mM醋酸钠溶液（pH4.3）进行透析，持续监控透析后的血清（浆）溶液样品，至导电度与50mM醋酸钠溶液相近（低于5ms/cm）后停止。收集的溶液接着以0.22μm滤膜进行无菌过滤。

以阳离子交换管柱纯化抗体F(ab’)₂片段

阳离子交换管柱SP-Sepharose FF（50x125mm）先以50mM醋酸钠溶液（pH 4.3）平衡，将前述经胃蛋白酶水解并经透析以浓缩与置换缓冲液的猪血清（浆）溶液通入管柱，继续以50mM醋酸钠溶液（pH4.3）冲洗管柱以洗出未结合物，持续监测洗出液于280nm的吸光值，待接近管柱平衡时的吸光值作为终止判定。再分别以含0.2M NaCl的50mM醋酸钠溶液（pH4.3）冲洗出所要的F(ab’)₂部分和以含1M NaCl的50mM醋酸钠溶液（pH4.3）冲洗出杂蛋白，管柱最终以0.1M的NaOH作在位清洗（CIP）以重复使用。

透析置换F(ab’)₂剂型缓冲液

收集阳离子交换管柱0.2M NaCl的洗出溶液，接着以切向流过滤***（TangentialFlow Filtration Systems）进行浓缩与置换缓冲液，切向流过滤***于此处使用孔径为50kD，膜面积为0.11m2的膜匣（GE HealthcareLife Sciences；Kvick Lab Cassette-UFELA0050010ST）。0.2M NaCl洗出液经浓缩至50%体积后，继续以10倍体积的注射用生理食盐水进行透析。收集的溶液接着以0.22μm滤膜进行无菌过滤。

抗体F(ab’)₂片段病毒中和抗体效价测试

为测定抗体F(ab’)₂片段中和病毒的效价，以50μl的CDV病毒（约200 TCID50）与50μl不同稀释倍数的样品混合反应1小时，再将混合液加入预先培养的B95-8细胞株，观察是否产生细胞病变（CPE），以不产生细胞病变的最高稀释倍数作为样品的中和抗体效价。样品为血清或血浆时需先置于56℃反应30分钟使补体去活化后再进行试验。

结果

实例1：经由阳离子交换树脂可获得纯度极高的抗体F(ab’)₂片段

将含有猪只抗CDV抗体经胃蛋白酶水解以获得F(ab’)₂片段，并经切向流过滤***透析以浓缩与置换缓冲液后，带正电的F(ab’)₂片段进一步以阳离子交换树脂进行分离与纯化，其分离纯化层析图如图1所示，其中标示为unbound的波峰代表未与管柱结合的物质，而后分别以0.2M与1.0的NaCl冲洗管柱以将结合管柱的物质置换洗出，最后以0.1M NaOH清洗管柱。

收集上述各阶段的洗出液并以SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE经考马斯蓝染色后的结果如图2所示，第1道显示未经水解与纯化的含有猪抗CDV抗体的血浆，其中PSA代表猪血清白蛋白，IgG抗体的分子量约为135kDa；第2道为前述血浆经胃蛋白酶水解后的产物，各蛋白质的分子量显著降低；第3道为前述水解产物经50kDa超过滤膜透析置换缓冲液的结果，相较于使用超过滤膜透析前，蛋白质组成分布与第2道并无差异，显示超过滤膜透析并无法获得分离纯化的效果；第4道则为阳离子交换管柱的过滤液；最后则为阳离子交换管柱经0.2M NaCl冲洗管柱的洗出物，可观察到经纯化的抗体F(ab’)₂片段，蛋白质纯化程度显著增加。

接着以西方墨点分析确认纯化物，此处使用兔子抗猪只IgG F(ab’)₂片段的抗体（购自NOVUS）侦测，其结果如图3所示，其中第1道为含有猪抗CDV抗体的血浆经胃蛋白酶水解的产物，第2道为前述经水解的血浆以阳离子交换树脂分离纯化后以0.2M NaCl冲提的产物，第3道则为以阳离子交换树脂分离纯化后以0.5M NaCl冲提的产物。三者均于100kDa处测得信号，与预期IgG抗体F(ab’)₂片段的分子量相当。

进一步计算F(ab’)₂片段产物的回收率，于纯化前以1000ml、中和效价为2700倍的血浆为原料，经上述F(ab’)₂片段产制过程后，可制得380ml、蛋白质浓度7.9mg/ml、中和效价大于6400倍的F(ab’)₂产物，以中和效价计算其回收率大于90%。

实例2：阳离子交换树脂纯化法适用于不同抗体浓度的样品

猪只因个体差异及饲养环境的不同，造成免疫反应亦不相同，以CDV感染猪只为例，将3批次免疫血清的样品以SDS-PAGE进行分析并以考马斯蓝（commassive brilliantblue）染色，其结果如图4所示。其中虽然注入分析的总蛋白质含量相等，但可观察到猪血清白蛋白（PSA）的含量差异不大，但抗体（IgG）的含量则有很大差异。然而，本发明的制备方法可适用于不同浓度的样品，如图5所示，经免疫的猪只血清以及经本发明的方法纯化的产物以SDS-PAGE进行分析并以考马斯蓝（commassivebrilliant blue）染色，其中第1道所示的IgG含量比例虽然远高于第2图的第1道所示的IgG含量比例，然而于高浓度IgG血清（血浆）样品中，抗体F(ab’)₂片段的回收率仍可大于90%。

实例3：中和抗体效价测试

F(ab’)₂片段产物经序列稀释后进行中和抗体效价测试，在稀释6400倍的样品中观察不到细胞病变，而在12800倍稀释的样品中观察到细胞病变，将此样品的中和抗体效价定为6400倍。

发明人相信本发明所属技术领域的技术人员基于本文的叙述，无须进一步的例示即可将本发明应用至其最广泛的范围。因此，应当了解此处所提供的叙述及权利要求是供例示目的而非以任何方式限制本发明的范畴。

Claims (9)

1.一种由血清或血浆制备抗体F(ab’)₂片段的方法，其特征在于，包含下列步骤：

将血清或血浆中的抗体以胃蛋白酶(Pepsin)水解以获得抗体F(ab’)₂片段；

将所述抗体F(ab’)₂片段以切向流过滤***(Tangential Flow Filtration System)进行浓缩并置换缓冲液，其中所述缓冲液的置换使所述抗体F(ab’)₂片段带有正电荷；以及

将所述抗体F(ab’)₂片段以阳离子交换管柱进行纯化，并以盐类水溶液置换经纯化的抗体F(ab’)₂片段，

其中所述经纯化的抗体F(ab’)₂片段不含有血清白蛋白、完整抗体分子及抗体Fc片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含将所述经纯化的抗体F(ab’)₂片段以第二过滤***进行浓缩并置换第二缓冲液的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值小于所述抗体F(ab’)₂片段的等电点(pI)值。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为pH 4.3的醋酸钠溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述盐类水溶液为浓度0.1M至2M的氯化钠(NaCl)水溶液。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二过滤***为切向流过滤***(Tangential Flow Filtration System)。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二缓冲液为生理食盐水。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体为免疫球蛋白(immunoglobulin)。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为IgG、IgA或IgM。