CN103819533B - 丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用。该制备方法包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法分离丹参酮类磺化液，高效液相反相色谱法的条件如下：流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%氨水、流动相B为甲醇；检测波长为271nm，保留时间为35～50min。本发明的制备方法制备能力强、制备量大、周期短、效率高，工艺操作连续性强易于进行质量控制和生产。本发明还可将丹参酸甲酯磺酸钠作为标准品，对丹参酮IIA磺酸钠原料药中的丹参酸甲酯磺酸钠的含量进行检测和控制。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用。
背景技术
丹参，又名血参、赤根、红根、血生根，为唇形科植物(Salvia miltiorrhza)的根茎，其入药始载于《神农本草经》。中医认为，其味苦微寒，具有活血痛经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，适用于治疗***、痛经、经闭、崩漏、带下、冠心病、动脉粥样硬化、高血脂、心绞痛、跌打淤血、失眠、神经衰弱、乙肝等疾病，为妇科、内科及外伤科证属血瘀兼热者常用。
现代药学研究表明，丹参中化学成分复杂，主要为水溶性丹参酚酸类和脂溶性二萜醌类丹参酮类化合物。其中，丹参酮类化合物主要包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、异丹参酮Ⅰ、异丹参酮ⅡA、隐丹参酮、异隐丹参酮、甲基丹参酮、羟基丹参酮等。
丹参酮ⅡA是重要的丹参有效成分。丹参酮ⅡA磺酸钠(SodiumTanshinoneⅡA Sulfonate,STS)，则是丹参酮ⅡA经磺化后得到的水溶性磺酸盐。由于磺酸基的引入，在治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞等疾病方面，丹参酮ⅡA磺酸钠相比丹参酮IIA具有更多的优越性，从而成为主要的心血管类丹参提取物中药。
丹参酮IIA是制备丹参酮IIA磺酸钠的原料，从丹参药材饮片提取，故难免混有少量、或极低含量其他结构较为相似的组分，如丹参酮ⅡB、丹参酮I、隐丹参酮、紫丹参甲素等。若要制备高纯度丹参酮IIA磺酸钠，则获得这些极低含量相关组分标准品、以及这些标准品在丹参酮IIA磺酸钠原料相关成分含量控制中的应用，具有重要意义。
但是，由于该类化合物结构复杂，化学全合成难度大，要获得高纯度对照品成为挑战。有研究报道从丹参酮ⅡA磺酸钠原料药中提取相关物质，由于其含量极低，HPLC纯度通常不到百分之一，采用高效液相法分离提取，工作量大、难度高。因此，丹参提取物中极低含量组分的高纯度标准品规模化制备，及其在丹参酮IIA磺酸钠原料药相关物质含量监控中的应用成为本领域长期以来难以解决的技术难题。
丹参酸甲酯也是丹参脂溶性二萜醌类化合物有效成分之一，并且尚未有技术大量制备丹参酸甲酯磺酸钠的报道。现有技术中专利CN200610039234.2“一组从丹参中提取的二萜醌类化合物的磺化物在医药中的应用”表明丹参酸甲酯磺酸钠可以应用于治疗冠心病（包括心绞痛，心肌梗死，心律失常，心肌血供应不足）和抗菌消炎等。因此，定量控制丹参酸甲酯磺酸钠，对丹参酮ⅡA磺酸钠原料的质量保证具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中丹参酸甲酯磺酸钠提纯困难、效率低、提取量低的缺陷，提供了丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用。本发明的制备方法的制备能力强、制备量大、周期短、纯度高、效率高，并且减少了有机溶剂的使用，工艺操作连续性强易于进行质量控制和生产。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明的丹参酸甲酯磺酸钠的结构如下式所示：
本发明提供了丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法分离丹参酮类磺化液，即可；
其中，高效液相反相色谱法的条件如下：
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%氨水、流动相B为甲醇；百分比为组分占流动相的体积百分比；检测波长为271nm，保留时间为35～50min。
其中，所述的高效液相反相色谱法较佳地包括富集纯化、中间纯化和精制纯化，其中，所述的富集纯化的条件优选如下：
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%氨水、流动相B为甲醇；流速为80～120mL/min（较佳地为100mL/min），检测波长为271nm；
将丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样25min，80%流动相A+20%流动相B（体积分数）平衡1min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，收集保留时间为42～50min的洗脱液得到富集纯化样品溶液；
采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱（内径50mm），装Varian公司的PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g（粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。
其中，所述的中间纯化的条件优选如下：
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%氨水、流动相B为甲醇；流速为80～120mL/min（较佳地为100mL/min），检测波长为271nm；
将上述富集纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B（体积分数）平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，收集保留时间为36～44min的洗脱液得到中间纯化样品溶液；
采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱（内径50mm），装Varian公司的PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g（粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。
其中，所述的精制纯化的条件优选如下：
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1%氨水、流动相B为甲醇；流速为20～30mL/min（较佳地为25mL/min），检测波长为271nm；
将上述中间纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B（体积分数）平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱30min：80%A+20%B→50%A+50%B，再以100%流动相B再生10min，收集保留时间为45～50min的洗脱液得到精制纯化样品溶液；
采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4001色谱柱（内径25mm），装瑞典Kromasil公司的反相C18硅胶填料100.0g（粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。
其中，所述的丹参酮类磺化液可为本领域常规的丹参进行磺化反应的反应液，较佳地通过下述步骤制得：
（1）将丹参提取物溶解于冰醋酸-乙酸酐的混合溶液中，再加入浓硫酸-冰醋酸的混合溶液，进行反应得到反应液；
（2）将石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液加入步骤（1）的反应液，再加入氯化钠溶液，抽滤，得到滤饼；
（3）用石油醚-二氯甲烷的混合溶液浸泡步骤（2）的滤饼，抽滤干燥得粗品；
（4）用甲醇溶解步骤（3）的粗品，活性炭过滤，滤液浓缩，冷却结晶过滤，滤液即为丹参酮类磺化液。
其中，所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液与所述的丹参提取物的体积质量比较佳地为7～9ml/g。
其中，所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液较佳地为冰醋酸与乙酸酐体积比为1：（2～3）的混合溶液。
其中，所述的浓硫酸-冰醋酸的混合溶液较佳地为浓硫酸与冰醋酸体积比为1:1的混合溶液，所述的浓硫酸的质量分数较佳地为98%。
其中，所述的石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液较佳地为石油醚、二氯甲烷和水的体积比为1:2:（2～2.5）的混合溶液。
其中，所述的石油醚-二氯甲烷的混合溶液较佳地为石油醚与二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液。
其中，所述的丹参提取物可为本领域常规方法得到的丹参提取物，较佳地通过下述步骤制得：将丹参用乙醇提取，过滤，滤液浓缩，干燥，即得。
本发明中，色谱柱的柱温较佳地为10～30℃。
本发明的制备方法中，所述的精致纯化结束后还可包括冻干过程。所述的冻干过程优选包括如下步骤：将所述的精制纯化样品溶液浓缩，冷冻干燥，即得纯净的丹参酸甲酯磺酸钠。所述的减压浓缩的压力较佳地为-0.08MPa～-0.1MPa，所述的减压浓缩的温度较佳地为30～40℃，所述的真空冷冻干燥较佳地采用上海东富龙科技股份有限公司的LYO-1真空冷冻干燥机进行。
本发明中0.1%三乙胺-水是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺水溶液，0.1%三乙胺-甲醇是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺甲醇溶液，0.1%二乙胺-水是指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺水溶液，0.1%二乙胺-甲醇是指指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺甲醇溶液，0.1%氨水是指氨的体积分数为0.1%的氨水溶液。
本发明还提供了上述丹参酸甲酯磺酸钠作为标准品在检测药品中丹参酸甲酯磺酸钠含量的应用。
其中，所述的药品较佳地为丹参酮IIA磺酸钠原料药。
其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液和丹参酸甲酯磺酸钠标准品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据丹参酸甲酯磺酸钠标准品色谱图的保留时间确定丹参酮IIA磺酸钠原料药色谱图中相关物质的峰，并根据峰面积计算丹参酮IIA磺酸钠原料药中丹参酸甲酯磺酸钠的含量。
其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相为甲醇：20mmol/L磷酸氢二钠溶液=65：35（体积比），pH为6.0，柱温为25℃，检测波长为271nm，流速为1.0mL/min，进样量20μL，丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液的浓度为0.2mg/mL，丹参酸甲酯磺酸钠标准品溶液的浓度为0.2mg/mL；记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍；控制丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液中丹参酸甲酯磺酸钠单个最大杂质峰面积不得大于丹参酸甲酯磺酸钠标准品溶液峰面积3倍（单个杂质含量不超过2.0%），总杂质峰面积之和不得大于丹参酸甲酯磺酸钠标准品溶液峰面积8倍（总杂质含量不超过5.0%）。
其中，所述的丹参酸甲酯磺酸钠标准品溶液较佳地为丹参酸甲酯磺酸钠与流动相混合所形成的溶液。
其中，所述的丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液较佳地为丹参酮IIA磺酸钠原料药与流动相混合所形成的溶液。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
（1）本发明运用制备高效液相反相色谱分离技术进行纯化丹参酸甲酯磺酸钠，流速高上样量大，自动化程度高，先磺化后反相纯化，所得产品纯度高，制备能力强、制备量大、周期短、效率高并且减少了有机溶液的使用，工艺操作连续性强，易于进行质量控制和生产。
（2）本发明还公开了一种检测方法，可将丹参酸甲酯磺酸钠作为标准品，对丹参酮IIA磺酸钠原料药中的丹参酸甲酯磺酸钠的含量进行检测和控制。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的室温是指25℃。0.1%三乙胺-水是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺水溶液，0.1%三乙胺-甲醇是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺甲醇溶液，0.1%二乙胺-水是指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺水溶液，0.1%二乙胺-甲醇是指指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺甲醇溶液，0.1%氨水是指氨的体积分数为0.1%的氨水溶液。
实施例1
丹参酮类化合物的提取
称取粉碎的丹参药材（产地：云南、甘孜、阿坝地区）3kg，加入质量分数为90%的乙醇14L，40℃水浴提取2小时。分别用350目滤布和滤纸过滤除去药材渣和泥土，将滤液浓缩至1.4L，4℃静置24小时，静置后的滤液滤纸过滤，过滤所得固体40℃真空干燥，得丹参酮类化合物红色固体粉末66.0g。
实施例2
丹参酮类化合物的磺化反应及后处理
取实施例1中的60g丹参酮类化合物，加入140mL冰醋酸和360mL乙酸酐，搅拌冷却混悬液至0℃。在搅拌状态下，向60mL冰醋酸中加入60mL98%浓硫酸，配制成混酸溶液并静置冷却至室温。滴加混酸溶液，维持反应温度10℃，继续保温反应90min。按300mL石油醚+600mL二氯甲烷+650mL纯化水配制稀释用液，搅拌冷却至4℃。在搅拌状态下，向稀释用液中缓慢加入上述反应液，并强化冷却效果，保证体系温度低于25℃。在2L纯化水中加入700g氯化钠，充分搅拌配制饱和食盐水。将已稀释的反应液加入到饱和食盐水中，温度控制在25℃，继续搅拌25min后静置30min，真空抽滤得到滤饼。在300mL石油醚和900mL二氯甲烷组成的混合溶液中，分散滤饼并常温搅拌20min，浸泡12小时，再次真空抽滤并干燥得丹参酮类磺酸钠粗品。在5L的反应瓶中投入甲醇3.8L和上述丹参酮类磺酸钠粗品，搅拌加热，溶清后加入16g的针用活性炭，加热至回流并保持此状态50min，温度控制在64±1℃，趁热抽滤，滤液在-0.09MPa下通过旋转蒸发仪减压蒸馏，待蒸出约75%体积的甲醇后将料液4℃冷却结晶12小时，再将料液抽滤分离得滤液，旋蒸浓缩两倍后，经0.22μm有机相微孔滤膜进行过滤澄清，得1L滤液，即丹参酮类磺化液。
实施例3
丹参酸甲酯磺酸钠的制备纯化
（1）富集纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱(内径50mm)，自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。富集纯化条件为：流动相A为0.1%三乙胺-水，流动相B为0.1%三乙胺-甲醇，流速为100mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样25min，80%流动相A+20%流动相B平衡1min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，根据紫外检测结果按峰收集保留时间42-48min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：丹参酮类磺化液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为5.70%，保留时间为15.60min。富集纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为66.00%，保留时间为15.34min。
（2）中间纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱(内径50mm)，自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为：流动相A为0.1%三乙胺-水，流动相B为0.1%三乙胺-甲醇，流速为100mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将上述富集纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，根据紫外检测结果按峰收集保留时间36-41min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：中间纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为81.08%，保留时间为15.29min。
（3）精制纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4001色谱柱（内径25mm），自装填料为瑞典Kromasil公司的反相C18硅胶填料100.0g（粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为：流动相A为0.1%三乙胺-水，流动相B为0.1%三乙胺-甲醇，流速为25mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将上述中间纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱30min：80%A+20%B→50%A+50%B，再以100%流动相B再生10min，收集保留时间为45～48min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：精制纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为99.54%，保留时间为15.27min。
（4）冻干：将上述精制样品溶液3L于旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司R1002B）、在温度30℃～40℃、压力-0.08MPa～-0.1MPa的条件下，浓缩除甲醇至2L；分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司LYO-1）按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，得到丹参酸甲酯磺酸钠无定形红棕色粉末2.0g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为99.24%，保留时间为15.20min。
质谱鉴定：采用美国Waters公司单重四级杆质谱仪Micromass ZQESI-MS对上述精制样品进行质谱鉴定，测得其分子离子峰C20H17O8S－（[M-Na]－）质荷比(m/z)为417.31，符合丹参酸甲酯磺酸钠质谱理论相对分子量440.40，其分子式为C20H17O8SNa。
核磁共振鉴定：采用德国Bruker公司Avance III400MHz核磁共振波谱仪对上述粉末产物进行测定，丹参酸甲酯磺酸钠的碳编号如下所示：
1H-NMR(D2O,400MHz,ppm)数据表明，两个苯氢化学位移信δH7.13(1H,d,J=8.0Hz,H-6)，和δH7.34(1H,d,J=8.0Hz,H-7)，以及三个亚甲基氢化学位移信号δH2.71(2H,m,H-1),δH1.62(2H,m,H-2)和δH1.62(1H,m,H-3α)，δH2.06(1H,m,H-3β)，说明其具有萘醌并呋喃环结构骨架；信号δH3.64(3H,s,H-20)说明该化合物有一个连氧的甲基；C-15上的氢信号消失，表明该化合物被磺化成功；结合13Ｃ-NMR(D2O,100MHz,ppm)数据δC：26.5(C-1)，10.5(C-2)，33.5(C-3)，47.3(C-4)，143.8(C-5)，135.9(C-6)，121.5(C-7)，126.6(C-8)，125.5(C-9)，145.1(C-10)，181.3(C-11)，174.7(C-12)，119.5(C-13)，160.0(C-14)，120.7(C-15)，119.5(C-16)，8.7(C-17)，18.3(C-18)，179.5(C-19)，53.0(C-20)，确定其为一个含甲酯的萘醌并呋喃环类化合物；δH2.06(1H,m,H-3β)的化学位移比丹参酮ⅡA低，因此推知该甲酯连在C-19上。综上，结果表明该化合物为丹参酸甲酯磺酸钠。
实施例4
丹参酸甲酯磺酸钠的制备纯化
（1）富集纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱(内径50mm)，自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。富集纯化条件为：流动相A为0.1%二乙胺-水，流动相B为0.1%二乙胺-甲醇，流速为100mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样25min，80%流动相A+20%流动相B平衡1min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，根据紫外检测结果按峰收集保留时间42-49min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：丹参酮类磺化液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为5.70%，保留时间为15.60min。富集纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为65.70%，保留时间为15.37min。
（2）中间纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱(内径50mm)，自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为：流动相A为0.1%二乙胺-水，流动相B为0.1%二乙胺-甲醇，流速为100mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将上述富集纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，根据紫外检测结果按峰收集保留时间36-42min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：中间纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为80.78%，保留时间为15.27min。
（3）精制纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4001色谱柱（内径25mm），自装填料为瑞典Kromasil公司的反相C18硅胶填料100.0g（粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为：流动相A为0.1%二乙胺-水，流动相B为0.1%二乙胺-甲醇，流速为25mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将上述中间纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱30min：80%A+20%B→50%A+50%B，再以100%流动相B再生10min，收集保留时间为45～49min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：精制纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为98.74%，保留时间为15.23min。
（4）冻干：将上述精制样品溶液3L于旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司R1002B）、在温度30℃～40℃、压力-0.08MPa～-0.1MPa的条件下，浓缩除甲醇至2L；分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司LYO-1）按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，得到丹参酸甲酯磺酸钠无定形红棕色粉末2.0g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为98.54%，保留时间为15.21min。
同样进行质谱鉴定与核磁鉴定，结果表明该物质为丹参酸甲酯磺酸钠。
实施例5
丹参酸甲酯磺酸钠的制备纯化
（1）富集纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱(内径50mm)，自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。富集纯化条件为：流动相A为0.1%氨水，流动相B为甲醇，流速为100mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样25min，80%流动相A+20%流动相B平衡1min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，根据紫外检测结果按峰收集保留时间42-50min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：丹参酮类磺化液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为5.70%，保留时间为15.60min。富集纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为65.30%，保留时间为15.32min。
（2）中间纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱(内径50mm)，自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为：流动相A为0.1%氨水，流动相B为甲醇，流速为100mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将上述富集纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80%A+20%B→40%A+60%B，再以100%流动相B再生10min，根据紫外检测结果按峰收集保留时间36-44min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：中间纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为80.58%，保留时间为15.25min。
（3）精制纯化：采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备***和L&L4001色谱柱（内径25mm），自装填料为瑞典Kromasil公司的反相C18硅胶填料100.0g（粒径10μm，孔径10nm)，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为：流动相A为0.1%氨水，流动相B为甲醇，流速为25mL/min，检测波长为271nm，柱温为室温，将上述中间纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80%流动相A+20%流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱30min：80%A+20%B→50%A+50%B，再以100%流动相B再生10min，收集保留时间为45～50min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示：精制纯化样品溶液中丹参酸甲酯磺酸钠的HPLC纯度为98.64%，保留时间为15.22min。
（4）冻干：将上述精制样品溶液3L于旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司R1002B）、在温度30℃～40℃、压力-0.08MPa～-0.1MPa的条件下，浓缩除甲醇至2L；分装入不锈钢托盘中，液面高度控制在0.5～1.0cm，盖上纱布送入真空冷冻干燥机（上海东富龙科技股份有限公司LYO-1）按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥，得到丹参酸甲酯磺酸钠无定形红棕色粉末2.0g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下：
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***，色谱柱：Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm，流动相：A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇，柱温25℃，流速1mL/min，检测波长271nm，上样量20μL，自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为98.24%，保留时间为15.19min。
同样进行质谱鉴定与核磁鉴定，结果表明该物质为丹参酸甲酯磺酸钠。
实施例6
丹参酸甲酯磺酸钠作为标准品检测丹参酮ⅡA磺酸钠原料药中的相关物质
美国Waters公司的2695-2489高效液相***和色谱柱Diamonsil C18(4.6×250mm，5μm)；流动相为甲醇︰20mM磷酸氢二钠溶液=65︰35（体积比），稀磷酸调节pH至6.0；柱温为25℃，检测波长为271nm，流速为1.0mL/min；进样量20μL，取丹参酮ⅡA磺酸钠原料药和丹参酸甲酯磺酸钠标准品适量，加流动相配制成各含10μg/mL的溶液，为***预试验溶液；丹参酮ⅡA磺酸钠和丹参酸甲酯磺酸钠及其他杂质峰的分离度应符合规定，理论塔板数按丹参酮ⅡA磺酸钠计算应不低于2000。
取丹参酮ⅡA磺酸钠原料药（批号见下表）2mg，置10mL量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取丹参酸甲酯磺酸钠20mg，置100mL量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液；照色谱条件，取标准品溶液20μL注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的10-25%，再分别取标准品溶液、供试液各20μL注入色谱仪，记录色谱图至供试液主成分峰保留时间的3倍；检测丹参酸甲酯磺酸钠含量：控制丹参酸甲酯磺酸钠单个最大杂质峰面积不得大于标准品溶液峰面积3倍（单个杂质含量不超过2.0%），总杂质峰面积之和不得大于标准品溶液的峰面积8倍（总杂质含量不超过5.0%）。结果见下表。
实施例7
丹参酸甲酯磺酸钠作为标准品检测丹参酮ⅡA磺酸钠注射液中的相关物质
仪器：美国Waters公司2695-2489高效液相***；色谱柱：DiamonsilC18(4.6×250mm,5μm)；流动相为甲醇︰20mM磷酸氢二钠溶液（65︰35），稀磷酸调节pH至6.0；柱温为25℃，检测波长为271nm，流速为1.0mL/min；进样量20μL，取丹参酮ⅡA磺酸钠对照品和丹参酸甲酯磺酸钠标准品适量，加流动相配制成各含10μg/mL的溶液，为***预试验溶液，丹参酮ⅡA磺酸钠和丹参酸甲酯磺酸钠及其他杂质峰的分离度应符合规定，理论塔板数按丹参酮ⅡA磺酸钠计算应不低于2000。
精密量取含丹参酮ⅡA磺酸钠2mg的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（批号见下），置10mL量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取丹参酸甲酯磺酸钠20mg，置100mL量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液；照色谱条件，取标准品溶液20μL注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高为满量程的10-25%，再分别取标准品溶液、供试品溶液各20μL注入色谱仪，记录色谱图至供试液主成分峰保留时间的3倍；检测丹参酸甲酯磺酸钠含量：控制丹参酸甲酯磺酸钠单个最大杂质峰面积不得大于对照品溶液峰面积3倍（单个杂质含量不超过2.0%），总杂质峰面积之和不得大于对照品溶液的峰面积8倍（总杂质含量不超过5.0%）。结果见下表。
Claims (6)
1.一种丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法分离丹参酮类磺化液，即可；
其中，高效液相反相色谱法的条件如下：
流动相A为0.1％三乙胺-水、流动相B为0.1％三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％二乙胺-水、流动相B为0.1％二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％氨水、流动相B为甲醇；百分比为组分占流动相的体积百分比；检测波长为271nm，保留时间为35～50min。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的高效液相反相色谱法包括富集纯化、中间纯化和精制纯化，其中，所述的富集纯化的条件如下：
流动相A为0.1％三乙胺-水、流动相B为0.1％三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％二乙胺-水、流动相B为0.1％二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％氨水、流动相B为甲醇；流速为80～120mL/min，检测波长为271nm；
将丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样25min，80％流动相A+20％流动相B平衡1min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80％A+20％B→40％A+60％B，再以100％流动相B再生10min，收集保留时间为42～50min的洗脱液得到富集纯化样品溶液；
所述的中间纯化的条件如下：
流动相A为0.1％三乙胺-水、流动相B为0.1％三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％二乙胺-水、流动相B为0.1％二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％氨水、流动相B为甲醇；流速为80～120mL/min，检测波长为271nm；
将所述的富集纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80％流动相A+20％流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min：80％A+20％B→40％A+60％B，再以100％流动相B再生10min，收集保留时间为36～44min的洗脱液得到中间纯化样品溶液；
所述的精制纯化的条件如下：
流动相A为0.1％三乙胺-水、流动相B为0.1％三乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％二乙胺-水、流动相B为0.1％二乙胺-甲醇；或，流动相A为0.1％氨水、流动相B为甲醇；流速为20～30mL/min，检测波长为271nm；
将所述的中间纯化样品溶液与水按体积比为1:1的混合物上样10min，80％流动相A+20％流动相B平衡10min，以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱30min：80％A+20％B→50％A+50％B，再以100％流动相B再生10min，收集保留时间为45～50min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的富集纯化采用的装置如下：采用PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱，装PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm；柱温为10～30℃；
和/或，所述的中间纯化采用的装置如下：采用PrepStar SD-1制备***和L&L4002色谱柱，装PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm；柱温为10～30℃；
和/或，所述的精制纯化采用的装置如下：采用PrepStar SD-1制备***和L&L4001色谱柱，装反相C18硅胶填料100.0g，动态轴向压缩***装填至压力650psi，静态锁紧至柱床高度25cm；柱温为10～30℃。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的富集纯化中，所述的流速为100mL/min；
和/或，所述的中间纯化中，所述的流速为100mL/min；
和/或，所述的精制纯化中，所述的流速为25mL/min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的丹参酮类磺化液通过下述步骤制得：
(1)将丹参提取物溶解于冰醋酸-乙酸酐的混合溶液中，再加入浓硫酸-冰醋酸的混合溶液，进行反应得到反应液；
(2)将石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液加入步骤(1)的反应液，再加入氯化钠溶液，抽滤，得到滤饼；
(3)用石油醚-二氯甲烷的混合溶液浸泡步骤(2)的滤饼，抽滤干燥得粗品；
(4)用甲醇溶解步骤(3)的粗品，活性炭过滤，滤液浓缩，冷却结晶过滤，滤液即为丹参酮类磺化液；
其中，所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液与所述的丹参提取物的体积质量比为7～9ml/g；
所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液为冰醋酸与乙酸酐体积比为1：(2～3)的混合溶液；
所述的浓硫酸-冰醋酸的混合溶液为浓硫酸与冰醋酸体积比为1:1的混合溶液；
所述的石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液为石油醚、二氯甲烷和水的体积比为1:2:(2～2.5)的混合溶液；
所述的石油醚-二氯甲烷的混合溶液为石油醚与二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液；
所述的丹参提取物通过下述步骤制得：将丹参用乙醇提取，过滤，滤液浓缩，干燥，即得。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的精致纯化结束后还包括冻干过程；所述的冻干过程包括如下步骤：将所述的精制纯化样品溶液浓缩，冷冻干燥，即可；所述的浓缩的压力为-0.08MPa～-0.1MPa，所述的浓缩的温度为30～40℃。
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