CN103805662A - 一种缢蛏酶解多肽的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种缢蛏酶解多肽的制备方法及应用，其特征在于步骤为：将缢蛏去壳、洗净绞碎，按料液质量比1：3~5加水匀浆，调节pH值至5.5~6.5；加入蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.2%~0.3%，酶解温度为60~70℃，酶解时间1.5~2.5小时；酶解后灭酶处理，再离心取上清液即为酶解液；将酶解液经超滤、G-25凝胶色谱柱层析、反相高效液相色谱洗脱得到所需的缢蛏酶解多肽。本发明制备工艺简单，制得的缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，MTT检测对DU-145和PC-3细胞的增殖有显著抑制作用，可用于体外抗***癌，本发明对于进一步研究与开发以缢蛏酶解多肽为基础的功能性食品和药物，提高缢蛏的经济价值具有重大意义。

Description

一种缢蛏酶解多肽的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种缢蛏酶解多肽的制备方法及其在抗***癌的应用。

背景技术

海洋贝类资源丰富且富含许多生理活性物质，因而逐渐被广泛研究和应用。缢蛏（Sinonovacula constricta）俗名蛏子，属瓣鳃纲、异齿亚纲、帘蛤目、灯塔蛤科、缢蛏属，在我国沿海均有分布，产量较大，为我国四大养殖贝类之一[安贤惠，李联泰。缢蛏研究现状及发展前景[J].科学养鱼，2005(1):4-6.]，缢蛏肉味鲜美，营养丰富，富含人体生命活动所需的各种必需氨基酸、不饱和脂肪酸等营养物质[李太武，林叶，苏秀榕，不同群体缢蛏营养成分的多元性分析[J]，食品科学，2008，29(11):548-551；Remacha，Trivino A，Anadon.Reproductive cycle of the razor clam Solen marginat us(Pulteney 1799)inSpain：acomparative study in three different locations[J]，Journal of shellfish research，2006，25(3)：869-876；安贤惠，几种缢蛏的营养性和健康性分析评价[J]，海洋湖沼通报，2005(4)：99-103；李太武，林叶，苏秀榕，不同群体缢蛏营养成分的多元性分析[J]，食品科学，2008，29(11)：548-551；林叶，苏秀榕，孙蓓等，不同种群缢蛏氨基酸及脂肪酸比较研究[J]，食品科学，2006，27(12)：675-678]。

缢蛏性寒、可补阴去邪热，治烦闷、冷痢、热痢、妇人产后虚损、虚热等症，具有较高的药用食用价值[蒋忠妙，郑国平，陈木森.舟山群岛海洋药用动物资源及民间应用的调查[J].中国海洋药物，2002，85(1):35.；苏晶，苏明翥编著，水产品药用巧治百病[M].沈阳：辽宁科学技术出版社，2000，187.]；缢蛏的活性成分还具有较高的研究价值，如雷晓凌等[雷晓凌，吴红棉，范秀萍等，缢蛏糖胺聚糖的提取分离及其体外抗肿瘤活性的初步研究[J]，药物生物技术，2004，11(3)：146-149]，对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强。张永娟等[张永娟，郑惠珍，缢蛏多肽的免疫调节及抗氧化作用[J]，时珍国医国药，2011，22(5)：1076-1077]，提取缢蛏多肽能促进小鼠胸腺和脾脏发育及迟发型***反应的发生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD还能提高血清SOD、GSH-Px水平，降低血清MDA含量。

活性多肽由于具有敏感性高、稳定性好及副作用少等优点，已被用作抗肿瘤药物开发的一个重要来源。研究已经证实，食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽[郑惠娜，章超桦，曹文红.海洋蛋白酶解制备生物活性肽的研究进展[J].水产科学，2008，27(7)：370.]。对于缢蛏，在抗肿瘤方面的研究还很少，特别是利用酶解技术提取多肽在抗肿瘤方面的研究并未见报道。

本研究通过正交实验确定木瓜蛋白酶水解缢蛏的最佳酶解条件，并研究酶解多肽的体外抗肿瘤活性，为该领域的进一步研究提供科学依据，并且对于进一步研究与开发以缢蛏酶解多肽为基础的功能性食品和药物，提高缢蛏的经济价值具有重大意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种缢蛏酶解多肽的制备方法，通过酶解，再结合超滤、G-25凝胶色谱柱层析、反相高效液相色谱提纯分离得到缢蛏酶解多肽，具有制备工艺简单、易操作等特点。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种缢蛏酶解多肽的应用，缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，具有体外抗肿瘤的作用。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种缢蛏酶解多肽的制备方法，其特征在于步骤为：

1）前处理：将缢蛏去壳、洗净绞碎，按料液质量比1：3~5加水匀浆，调节pH值至5.5~6.5；

2）酶解：加入蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.2%~0.3%，酶解温度为60~70℃，酶解时间1.5~2.5小时；

3）酶解后灭酶处理，再离心取上清液即为酶解液；

4）将酶解液经超滤、G-25凝胶色谱柱层析后收集的各个洗脱峰浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；

5）最后，采用反相高效液相色谱进行洗脱纯化得到所需的缢蛏酶解多肽。

作为优选，所述步骤1）的料液质量比1：4，pH值为6。

作为优选，所述步骤1）的蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.25%，酶解温度为65℃，酶解时间2小时。

再优选，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。

作为改进，所述步骤3）的灭酶处理是在85~95℃，加热8~12min，离心是在4000~6000r/min 下离心8~12min。

再改进，所述步骤4）的超滤是将酶解液加入超滤杯，用10KD的超滤膜进行超滤，收集10KD分子量以上的酶解液，进行冷冻干燥；

G-25凝胶色谱柱层析的具体步骤为：采用湿法装柱，柱高为80cm，直径为2.6cm，装柱完毕后用去离子水进行平衡，样品的浓度为200mg/mL，每次上样量为3mL，洗脱液为去离子水，洗脱速度为2.3mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；

最后，所述步骤5）的反相高效液相色谱洗脱纯化的具体工艺参数为：色谱条件:C18反相柱；柱型:10×250mm；乙腈/水为流动相，流速为0.8mL/min，上样体积为20μL，检测波长220nm；洗脱条件:乙腈浓度为15%，洗脱20min。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种根据上述制备方法得到的缢蛏酶解多肽在体外抗***癌的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过正交实验确定最佳酶解条件，通过对DU-145细胞的增殖抑制作用来检测各酶解物的抗肿瘤活性，经超滤、G-25、反相高效液相色谱C18分离制备缢蛏酶解多肽，经MTT检测缢蛏酶解多肽对DU-145和PC-3细胞的增殖抑制作用。本发明制备工艺简单，制得的缢蛏酶解多肽敏感性高、稳定性好及副作用少，在体外有显著的抗肿瘤作用，可用体外抗***癌，对于进一步研究与开发以缢蛏酶解多肽为基础的功能性食品和药物，提高缢蛏的经济价值具有重大意义。

附图说明

图1是4种蛋白酶对DU-145细胞增殖抑制率的影响；

图2是Sephadex G25凝胶色谱柱峰谱图；

图3是高效液相检测缢蛏酶解多肽纯度；

图4-1-4-6是峰1活性给分液质联用法鉴定得到的抗肿瘤肽的质谱图；

图5是缢蛏酶解多肽对DU-145肿瘤细胞的增殖抑制率（MTT）；

图6是缢蛏酶解多肽对PC-3肿瘤细胞的增殖抑制率（MTT）；

图7A-1,图7A-2,图7A-3,图7A-4是缢蛏酶解多肽对DU-145细胞凋亡率的影响；

图8B-1,图8B-2,图8B-3,图8B-4是缢蛏酶解多肽对PC-3细胞凋亡率的影响。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

1.材料与仪器

1.1主要材料与试剂

缢蛏购自浙江省舟山市南珍市场；

胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物制品有限公司；

HamF12培养基，Gibco公司；

胰蛋白酶，美国SIGMA公司；

青霉素、链霉素，山东鲁抗医药股份有限公司；

葡聚糖凝胶Sephadex G-25，北京亚太恒信生物科技有限公司；

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶，亚太恒信生物科技有限公司；

MTT购自美国Sigma公司；

二甲基亚砜（DMSO）购自美国AMRESCO公司；

其余试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂；

BSA124S型电子天平，德国Sartorius AG公司；

SSW型微电脑电热恒温槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

超滤杯、超滤膜，上海摩速科学器材有限公司；

BSW-100-ZCD自动部分收集器，上海琪特分析仪器有限公司；

BT1-100恒流泵，上海琪特分析仪器有限公司；

PHS-250pH计，上海理达仪器厂；

CF16RXII高速冷冻离心机，日本HITACHI公司；

ZHJH-C1209C型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；

Forma 3111型CO2培养箱，美国Thermo公司；

酶标仪，美国Bio-Rad公司；

752FC紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；

LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；

高效液相色谱仪（P1201依利特），大连依利特分析仪器有限公司；

微量震荡器，上海精密仪器有限公司；

电泳仪(BIO-RAD，041BR)，杭州宝城生物科技有限公司；

FACS Calbur流式细胞仪，BD公司。

2．实验方法

2.1最佳酶种的选择

利用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶在最佳酶解条件下进行酶解，然后用MTT法根据DU-145细胞增殖抑制率筛选酶抗肿瘤活性最强的蛋白酶，从而确定最佳酶种。水解工艺如下：缢蛏→去壳→洗净绞碎→取50g加水匀浆→调pH值→加酶酶解→沸水浴灭酶（90℃，加热10min）→5000r/min离心10min→取离心上清液→冷冻干燥→酶解液→DU-145细胞增殖抑制率（MTT）→确定最佳酶种。

2.2酶解条件的优化

选用木瓜蛋白酶，以A（温度）、B（pH）、C（加酶量）、D（料液比）和E（时间）5个因素，选4个水平进行L₁₆(4⁵)的正交实验，筛选在不同酶解条件下的酶解液的对***癌细胞增殖抑制率最高的酶解条件，从而确定最佳水解条件，并进行大量酶解。

2.3细胞培养

选取人***癌细胞DU-145和PC-3激素非依赖型细胞（原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存）。DU-145和PC-3用含10%胎牛血清的F12培养基于37℃，5%CO₂培养箱中培养至对数生长期。

2.4超滤与Sephadex G-25凝胶层析

超滤：将样品加入超滤杯，用10KD的超滤膜进行超滤，收集10KD分子量以上的酶解液，进行冷冻干燥。将Sephadex G-25凝胶颗粒采用湿法装柱，柱高为80cm，直径为2.6cm，装柱完毕后用去离子水进行平衡。样品的浓度为200mg/mL，每次上样量为3mL，洗脱液为去离子水，洗脱速度为2.3mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥。将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥。

2.5反相高效液相色谱(RT-HPLC)

RT-HPLC进行纯化。色谱条件：C18反相柱；柱型：10×250mm；乙腈/水为流动相，流速为0.8mL/min，上样体积为20μL，检测波长220nm。洗脱条件：乙腈浓度为15%，洗脱20min，重复上样。

2.6抗肿瘤肽结构的液质联用（LC-MS/MS）鉴定

样品由北京华大蛋白进行检测。

2.7细胞增殖抑制率的测定

取对数生长期的细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5%CO₂，37℃条件下贴壁24h，然后分别加入5、10、15、20、25、30mg/mL的酶解多肽溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设置加PBS的对照组，放在5%CO₂，37℃培养箱中分别孵育24h，培养结束后，加PBS洗2遍，然后加MTT继续培养4h，吸弃MTT，加DMSO充分震荡后置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，计算细胞增殖抑制率（IR），按下列公式计算：IR=[(对照组-给药组)/（对照组-空白组）]×100%

2.8流式细胞测早期凋亡率

将每个25mL的培养瓶中接种1×10⁵个左右的肿瘤细胞，24h后加入浓度为5，10，15mg/mL的缢蛏酶解多肽，培养24h，同时设立空白对照组。细胞凋亡检测方法参照试剂盒中的操作方法进行。首先将培养结束的细胞用0.25%的胰蛋白酶液进行消化，然后用PBS将其从瓶壁吹打下来。将所得到的细胞悬液移入离心管，1000r/min离心5min。吸去上清液，加试剂盒专用缓冲液400μL，吹打成细胞悬液。向细胞悬液中加入5μLAnnexin V-FI TC混匀后再加入10μL的PI，室温下放入暗室静置5min后上机分析。

3结果与分析

3.1酶种的确定

根据四种酶的酶解液对DU-145细胞增殖抵制率的影响，从图1，可以发现木瓜蛋白酶缢蛏酶解液对DU-145细胞的增殖抵制率最高，故选择木瓜蛋白酶对缢蛏进行酶解以及条件优化。

3.2酶解条件的确定

从表1可以看出，以IR为指标，酶解温度对其影响最大且具有显著性差异（P＜0.05），各因子对肽键含量的影响依次为温度＞料液比＞加酶量＞pH＞时间，最佳酶解工艺为A4B2C4D3E3。即温度：65°C；PH：6.0；酶量：0.12g；料水比：1：4；时间：2h作为酶解条件，得到的酶解物作为下一步实验用样品。

表1木瓜蛋白酶对缢蛏酶解工艺条件的正交试验结果

Table 1.Result of L₁₆(4⁵)orthogonal test of Papain

3.3Sephadex G25凝胶色谱柱

将在最佳酶解条件下获得的木瓜蛋白酶酶解液，过G-25凝胶色谱柱，发现有3个洗脱峰。经体外抗癌活性筛选，发现峰Ⅱ抗肿瘤瘤活性最高，收集峰Ⅱ，进一步分离纯化。

3.4RT-HPLC洗脱结果

将峰II经反相高效液相色谱柱洗脱(图3)，出现一主峰(峰1)，收集该峰，冷冻干燥后得到0.27g样品，得率为0.1%。

3.5抗肿瘤肽的鉴定

将由HPLC收集的峰1用LC-MS/MS进行抗肿瘤肽的纯化鉴定。得到的结果用Masslynx软件处理扣，用Masslynx软件进行分析，得到氧化肽见表2。由鉴定结果可知，峰1的分子量为66149KDa。

表2峰1活性给分液质联用法鉴定得到的抗肿瘤肽

3.4缢蛏酶解多肽的抗肿瘤活性

采用MTT法检测上述水解条件下得到的酶解多肽对DU-145和PC-3作用24h后的增殖抑制率，结果见图5、6。缢蛏酶解多肽对DU-145细胞的增殖抑制作用明显大于PC-3细胞。当浓度为5mg/mL时，对DU-145与PC-3抑制率较低。但是随着缢蛏酶解多肽浓度和作用时间的增加，其对DU-145与PC-3的增殖抑制作用呈明显的浓度和时间依赖性。

3.5缢蛏酶解多肽对肿瘤细胞早期凋亡影响

Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、坏死和凋亡细胞等分开。如图7、8所示，细胞分为四个区：左下象限Annexin V-FITC^-/PI^-，代表正常细胞；左上象限AnnexinV-FITC^-/PI⁺，代表机械损伤细胞；右下象限Annexin V-FITC⁺/PI^-，为早期凋亡细胞；右上象限Annexin V-FITC⁺/PI⁺凋亡晚期或坏死细胞。对照组和不同药物浓度组的DU-145细胞均有Annexin V-FITC^-PI⁺、Annexin V-FITC⁺/PI^-、Annexin V-FITC⁺/PI⁺。如图6、7所示，对照组的DU-145和PC-3细胞多位于左下象限，凋亡细胞极少。经过缢蛏酶解多肽对DU-145细胞作用24h后，凋亡细胞的百分比分别达为10.25%、20.52%、12.30%，明显高于对照组。缢蛏酶解多肽对PC-3细胞作用24h后，凋亡细胞的百分比分别达为2.64%、7.54%、15.15%，明显高于对照组。

结论：木瓜蛋白酶酶解获得的缢蛏多肽对DU-145细胞的增殖抑制作用最强，MTT实验结果显示，缢蛏酶解多肽作用于DU-145和PC-3细胞后，呈现出增殖抑制的现象，且随着药物浓度的增加，细胞抑制率明显增加。故认为缢蛏酶解多肽对DU-145和PC-3有直接的杀伤作用，其作用呈剂量和时间依赖性。从Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术发现DU-145和PC-3细胞也存在少量的早期凋亡和坏死细胞。经缢蛏酶解多肽作用24h后，凋亡细胞和坏死细胞增多，随着药物浓度的增加，凋亡细胞逐渐增加。由此说明缢蛏多肽抑制DU-145和PC-3细胞增殖，其机制与诱导DU-145和PC-3细胞凋亡有关。因此本发明制备的缢蛏酶解多肽在体外有显著的抗肿瘤作用，可用于***癌治疗。

Claims (9)

1.一种缢蛏酶解多肽的制备方法，其特征在于步骤为：

1）前处理：将缢蛏去壳、洗净绞碎，按料液质量比1：3~5加水匀浆，调节pH值至5.5~6.5；

2）酶解：加入蛋白酶进行酶解，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.2%~0.3%，酶解温度为60~70℃，酶解时间1.5~2.5小时；

3）酶解后灭酶处理，再离心取上清液即为酶解液；

4）将酶解液经超滤、G-25凝胶色谱柱层析后收集的各个洗脱峰浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；

5）最后，采用反相高效液相色谱进行洗脱纯化得到所需的缢蛏酶解多肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）的料液质量比1：4，pH值为6。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）的蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶，蛋白酶的加入量为缢蛏质量的0.25%，酶解温度为65℃，酶解时间2小时。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述蛋白酶为木瓜蛋白酶。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的灭酶处理是在温度85~95℃下加热8~12min，离心是在4000~6000r/min下离心8~12min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4）的超滤是将酶解液加入超滤杯，用10KD的超滤膜进行超滤，收集10KD分子量以上的酶解液，进行冷冻干燥。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4）的G-25凝胶色谱柱层析的具体步骤为：采用湿法装柱，柱高为80cm，直径为2.6cm，装柱完毕后用去离子水进行平衡，样品的浓度为200mg/mL，每次上样量为3mL，洗脱液为去离子水，洗脱速度为2.3mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤5）的反相高效液相色谱洗脱的具体工艺参数为：色谱条件:C18反相柱；柱型:10×250mm；乙腈/水为流动相，流速为0.8mL/min，上样体积为20μL，检测波长220nm；洗脱条件:乙腈浓度为15%，洗脱20min。

9.一种根据权利要求1所述的制备方法得到的缢蛏酶解多肽在体外抗***癌的应用。

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