CN103804500B - 用于治疗慢性疼痛的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于治疗慢性疼痛的多肽，多肽的基序为<b>ASADPGH</b>，基序通过可选的连接基团偶联有跨膜转运信号段。本发明的多肽，既可以抑制神经元内Fyn调节的NR2磷酸化，又不影响Fyn活性，可以很好地治疗慢性疼痛。

Description

用于治疗慢性疼痛的多肽

技术领域

本发明涉及一种多肽，特别涉及一种用于治疗慢性疼痛的多肽。

背景技术

慢性疼痛（主要分为炎性痛、神经病理性疼痛）的特征是痛觉过敏（hyperalgesia）、异常性疼痛（allodynia）、自发性疼痛（spontaneouspain）等，其发生都涉及到神经突触可塑性变化导致的中枢致敏（centralsensitization），对于疼痛的发生而言，脊髓背角（spinalcorddorsalhorn，SCDH）被誉为疼痛之旅的起点，SCDH的突触信号传递能够接受复杂的、两相的、且是活性依赖的神经调节，在这种调节之下，从周围神经***的感觉传入被精确地编码并被传入大脑。当外周伤害性刺激通过初级传入神经元的整合调节（包括免疫细胞、胶质细胞等与神经元的对话等）激活了脊髓背角（spinalcorddorsalhorn，SCDH）的感觉神经元后，将引起突触后神经元末梢的去极化，激活末梢上NR。研究表明，NR的过度激活是慢性疼痛中枢致敏发生的不可或缺的重要环节。

NR是谷氨酸受体的离子型受体，由功能亚基（NMDAreceptor1，NR1）和调节亚基(NMDAreceptor2，NR2)组成，NR2又分NR2A、NR2B、NR2C及NR2D。NR1和一种NR2可能还有NR3组成完整的NR离子通道。生理情况下，配体与NR结合后，NR通道（存在于功能亚基）开放，阳离子内流，尤其是Ca²⁺的内流，这种基本的电活动（基础活性）是NR相关的生理功能赖以存在的基础。如前所述，NR的过度活化在慢性疼痛中枢致敏的产生和维持方面起关键作用。

目前，不同类型的新的镇痛药正在开发之中，以NR为靶点，设法抑制NR的过度激活一直以来是慢性疼痛等神经病变的研究热点。抑制NR的激活通常可以使用NR拮抗剂，然而，这些拮抗剂都具有神经毒作用，拮抗剂阻断NR基础电活动时会破坏NR依赖的生理功能。总之，以NR为靶点设计治疗疾病的策略首先应该不影响NR的基础电活动，减少对NR依赖的生理功能的干扰。对于NR通道而言，阳离子内流的结构基础存在于NR的功能亚基，而阳离子内流的强度等（NR的活性）受调节亚基NR2调节，因此，通过调控NR2来调节NR活性是治疗慢性疼痛的新策略。发明人在之前的研究中利用SiRNA沉默NR2B减轻了病理神经痛大鼠的痛觉过敏，这印证了以NR2为靶点治疗慢性疼痛的可行性。NR2的酪氨酸磷酸化变化是NR2调节NR活性的最基本方式，NR2酪氨酸磷酸化，则NR活性增强，反之，去磷酸化则使NR活性降低，因此，干预NR2的酪氨酸磷酸化治疗NR过度活化导致的病理生理改变可能是避免阻断NR，减少对NR依赖的生理功能干扰的有效途径。

NR2酪氨酸磷酸化由神经元非受体依赖的蛋白激酶家族（Srcfamilyproteinkinases，SFKs）调节。Fyn是脊髓神经元中富含的SFKs成员，Fyn催化NR2酪氨酸磷酸化，是许多信号通路调节NR2磷酸化的信号交汇点。尽管NR2A或NR2B的C-末端的多个酪氨酸残基可以被SFKs家族磷酸化，但NR2BTyr1472位点的磷酸化主要由Fyn调节，一些学者认为NR2B就是NR参与疼痛的调节亚基，因此，SCDH中突触后Fyn调节NR2特别是NR2B酪氨酸磷酸化在慢性疼痛中的作用备受关注。诸多的研究表明，慢性疼痛大鼠痛觉过敏的维持依赖于Fyn调节的NR2BTyr1472位点的酪氨酸磷酸化，多种信号分子可通过Fyn催化NR2尤其是NR2B的磷酸化进而引起炎性疼痛或神经病理痛的发生。这些结果提示，干预神经元内Fyn调节的NR2尤其是NR2B的酪氨酸磷酸化可以治疗慢性疼痛如炎性疼痛。干预神经元内Fyn对NR2的酪氨酸磷酸化可以使用Fyn抑制剂，然而，这种方法特异性差，由于同源家族的酶的催化区域具有保守性，而Fyn是广泛存在于体内多种组织的酪氨酸蛋白激酶，使用激酶抑制剂抑制Fyn的活性会影响神经***以外组织Fyn的生理作用。从遗传性干预的角度，我们也可以通过基因疗法抑制Fyn的表达，目前还没有可应用于临床的具有高转染效率、合适的半衰期、特异性和靶向性高的siRNA分子体内给药***。

发明内容

本发明的目的在于提供一种既可以抑制神经元内Fyn调节的NR2磷酸化，又不影响Fyn活性的多肽。

本发明的另一个目的在于提供一种治疗慢性疼痛的制剂。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于治疗慢性疼痛的多肽，其基序为ASADPGH（SEQIDNO：1），基序通过可选的连接基团偶联有跨膜转运信号段。

优选的，上述治疗慢性疼痛的多肽中偶联的跨膜转运信号段为跨膜转运肽。

优选的，上述跨膜转运肽为Tat蛋白转导域中的片段短肽。跨膜转运肽的序列为YGRKKRRQRRR（SEQIDNO：2）。

特别的，用于治疗慢性疼痛的多肽的序列为ASADPGH-YGRKKRRQRRR（SEQIDNO：3）。

一种治疗慢性疼痛的制剂，含有上述的多肽。

本发明的有益效果是：

本发明的多肽，既可以抑制神经元内Fyn调节的NR2磷酸化，又不影响Fyn活性，可以很好地治疗慢性疼痛。

附图说明

图1是NR磷酸化活化和炎性疼痛的治疗机理图；

图2是Tat-FynP对培养脊髓神经细胞NR2B酪氨酸磷酸化蛋白水平的影响图；

图3是不同肽对Fyn活性的影响图。

具体实施方式

一种用于治疗慢性疼痛的多肽，其基序为ASADPGH，基序通过可选的连接基团偶联有跨膜转运信号段。

跨膜转运信号段的作用在于提供细胞转动信号，将使细胞将目的肽转运至细胞内起效。优选的，跨膜转运信号段为跨膜转运肽。优选的，上述跨膜转运肽为Tat蛋白转导域中的片段短肽。跨膜转运肽的序列为YGRKKRRQRRR。当然，也可以使用其他的跨膜转运信号段，以促进多肽进行细胞内发挥作用。

特别的，用于治疗慢性疼痛的多肽的序列为ASADPGH-YGRKKRRQRRR。

一种治疗慢性疼痛的制剂，含有上述的多肽。

发明人所在课题组在研究中发现，Fyn与NR2的结合是一种由突触后致密物（postsynapticdensityprotein，PSD）蛋白PSD-93介导的非直接连接，而且，PSD-93只介导SFKs家族的Fyn与NR2的结合。实质上Fyn与PSD-95结合也以同样的方式介导NR2磷酸化。PSD-93/95是胞质内一种特殊的衔接蛋白，其N-末端含有PDZ1，PDZ2，PDZ3三个PDZ结构域（与PSD-95，Dlg，andZO-1蛋白同源)又被称为PDZ结构域蛋白。作为PDZ结构域蛋白的主要成员，PSD-93/95通过PDZ2结构域与NR结合在一起。Fyn是一种非受体依赖的蛋白激酶，它通过酶作用区域以外的SH2结构域与PSD-93/95的PDZ3结构域的直接结合从而与NR形成复合体介导NR磷酸化，这种结合是不依赖于激酶磷酸化程度的独特的物理结合方式，FynC末端Tyr去磷酸化及激酶结构域的Tyr磷酸化（Tyr420）都可以使Fyn激活，与通常认为的磷酸酶下调受体的磷酸化相反，酪氨酸磷酸酶α使突触内Fyn去磷酸化反而促进这种复合物的形成，进而上调NR2酪氨酸磷酸化。慢性疼痛如炎性痛时，许多信号分子可间接或直接作用于Fyn促进NR2磷酸化。

总之，PSD-93/95始终与NR连接在一起，当刺激信号传入时，PSD-93/95的PDZ3结构域再与FynSH2结构域结合，使Fyn、PSD-93/95、NR串集在一起，导致NR磷酸化活化（图1A）。据此，发明人设想，可以通过抑制FynSH2与PSD-93/95PDZ3的相互作用，可以抑制Fyn与PSD93/95及NR的串集，从而抑制NR的磷酸化活化，防止或逆转中枢致敏，达到对炎性疼痛的治疗作用（图1B）。该策略基于抑制FynSH2结构域与PDZ3结构域相互作用的策略，不影响NR通道的完整性，保留NR的基础电活动，因此对NR依赖的生理功能干扰小或无干扰，不影响Fyn对神经***NR2以外其它蛋白的磷酸化调节及其它组织器官Fyn的作用。

下面结合实验及实验数据，进一步说明本发明。

以下实验中的所使用的Tat-FynP的具体序列为ASADPGH-YGRKKRRQRRR。

Tat-FynP对培养脊髓神经细胞NR2B酪氨酸磷酸化蛋白水平的影响

Tat-FynP、FynP、mTat-FynP分别加入预先用Fyn激动剂孵育的培养细胞及未加激动剂的培养细胞，孵育后细胞裂解液按常规步骤提取蛋白分两份（另一分备NR2B总蛋白水平检测），利用特异性p-NR2B抗体，通过Western-blot观察各组酪氨酸磷酸化NR2B蛋白水平的变化。

40μg总蛋白上样，每样上二块平行胶，以确定蛋白分子量及上样一致性，SDS-PAGE电泳分离后，以湿转法电转移至PVDF膜上，条件为150mA2小时，转移缓冲液：25mmol/LTris，190mmol/L甘氨酸，0.05%SDS，20%甲醇，转移完毕后，将PVDF膜浸入封闭液，4℃过夜，封闭液成分：1%BSA的BufferA（10mmol/LTris，100mmol/LNaCl，0.1%Tween20）。加入用封闭液稀释的一抗（1：1000羊抗p-NR2B，均为SantaCruz公司），BufferA洗膜10分钟×3次，加入二抗(1：300的生物素标记的马抗羊或羊抗兔IgG，北京中山)，37℃孵育30分钟，洗膜3次，加入3抗（1：300辣根酶标记链酶卵白素，北京中山），BufferA洗膜3次，最后将膜放入DAB溶液中显色，一旦蛋白带的颜色深度达到要求，即用ddH2O漂洗，终止反应，之后拍摄膜照片。将PVDF膜上的目的蛋白条带在GelDoc2000凝胶成像***上分析处理，磷酸化NR2B蛋白含量以ODu×面积表示。

实验结果如图2所示。此数据表明本发明的多肽Tat-FynP，可以抑制神经元内Fyn调节的NR2(本实验中为NR2B)磷酸化。

Tat-FynP对Fyn激酶活性的影响（验证其特异作用或靶向作用）

通过放射性免疫技术测定Fyn激酶活性。

用放射性免疫技术试剂盒分别测定Tat-FynP、FynP、mTat-FynP孵育的脊髓神经细胞Fyn激酶活性变化。Tat-FynP的剂量分别采用可以抑制Fyn与PSD-95相互作用的量的10倍。

通过超声破碎法提取孵育的细胞蛋白，通过lory法测定蛋白浓度。激酶活性检测：加入20μlproteinA/GPlusAgarose，4℃水平摇床100rpm30min，7000rpm离心取上清液。500μg蛋白中加入Fyn抗体4℃摇床，离心，buffer洗涤沉淀，上述步骤3次后bufferA重悬沉淀。构建[γ-³²p]ATP反应体系，将10μl反应体系加入混合液孵育20min，终止反应后SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上，2h，-70℃，黑暗环境中压片48-72h，显影、定影。图像经过数据***分析处理。结果如图3所示。各组Fyn活性无显著差异，说明本发明的多肽，不影响Fyn活性。

Tat-FynP预先鞘内注射对微量甲醛炎性痛模型大鼠痛行为的影响

动物分为正常组、炎性疼痛组（CFA），炎性疼痛组又分模型制作前预先鞘内注射Tat-FynP、FynP、mTat-FynP组，分别于左后肢足底注射微量甲醛前及注射后1d、3d、4d和5d测定大鼠MWT和TWD。结果发现Tat-FynP鞘内注射预处理对炎性疼痛大鼠具有治疗作用。

造模前各组大鼠的两种疼痛行为学指标比较差异均无统计学意义（P>0.05）；与正常大鼠组比较，CFA组第4d（相当于鞘内注射治疗药物后3d）即可观察到患足的MWT值下降非常显著，TWD值明显延长，与模型前基础值和NS组比较差异有统计学意义（P<0.01），且这种变化趋势持续至鞘内注射后5d。Tat-FynP组能使大鼠患足MWT值的下降幅度及TWD值的上升幅度减少，与CFA组比较有显著差异（P<0.01），而FynP组及mTat-FynP组大鼠MWT和TWD值的与CFA组比较无显著差异（P>0.05）。（表1a，表1b）。

表1a、各组大鼠造模前及鞘内注射后或相应时间点MWT的变化

a:P<0.01vsNS，b:P<0.01vsCFA。

表1b、各组大鼠造模后TWD的变化

a:P<0.01vsNS，b:P<0.01vsCFA。

<110>***广州总医院

<120>用于治疗慢性疼痛的多肽

<130>

<160>3

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>7

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>1

AlaSerAlaAspProGlyHis

15

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>人工多肽

<400>2

TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg

1510

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<212>PRT

<213>人工多肽

<400>3

AlaSerAlaAspProGlyHisTyrGlyArgLysLysArgArgGlnArg

151015

ArgArg

Claims (4)

1.一种用于治疗慢性疼痛的多肽，其基序为ASADPGH，基序偶联有序列为YGRKKRRQRRR的跨膜转运肽。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：基序通过连接基团偶联有序列为YGRKKRRQRRR的跨膜转运肽。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽的序列为ASADPGH-YGRKKRRQRRR。

4.一种治疗慢性疼痛的制剂，其特征在于：所述制剂中含有权利要求1、2或3所述的多肽。