CN103800915A

CN103800915A - 一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法

Info

Publication number: CN103800915A
Application number: CN201210445957.8A
Authority: CN
Inventors: 方晓玲; 陈彦佐; 沙先谊
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2032-11-08
Also published as: CN103800915B

Abstract

本发明属生物医药技术领域，涉及一种靶向整合素受体的联合给药胶束及其制备方法。本发明合成了末端羧基修饰的普朗尼克（Pluronic-COOH），并以RGD多肽与羧基通过酰胺键相连，得到RGD肽修饰的普朗尼克共聚物（RGD-Pluronic）；将药物阿霉素（DOX）与普朗尼克（Pluronic）共聚后，采用薄膜水化法包载另一药物紫杉醇（PTX）制备混合胶束（RGD-FP-DP）。本发明可提高胶束的载药量，可以增加抗肿瘤药物在靶部位的药物浓度并可以减少其在非靶部位的蓄积，可以有效地提高药物的治疗指数。

Description

一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法

技术领域

本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法。

背景技术

现有技术公开了肿瘤组织不同于正常组织，其血管丰富、血管壁间隙较宽、结构完整性差，淋巴回流缺失，因此包载药物的纳米粒子可以通过EPR效应在肿瘤组织富集。然而，研究发现，纳米粒子进入循环***后，由于主要被单核吞噬细胞***(MPS)摄取，使药物在肝、脾和肺中聚集，这不仅减低了药物的治疗指数，同时对这些器官造成了很大的毒副作用。构建肿瘤靶向递药***，降低抗肿瘤药物对正常器官的损害，实现药物的靶向传释越来越引起研究者的关注。

整合素(Integrin)为细胞黏附分子家族的重要成员之一，是细胞外基质(ECM)的主要受体家族。有研究显示，在恶性肿瘤和受到肿瘤细胞分泌的促血管生长因子刺激活化后的内皮细胞中整合素αVβ₃表达显著性上调，而在正常人体内成熟的血管内皮细胞和绝大多数正常组织器官中整合素αVβ₃呈低水平表达。研究还显示，整合素αVβ₃特异性识别并结合细胞外基质配体分子中的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）序列后发生构象改变而活化，介导下游信号转导，发挥重要的调控作用。由于所有实体瘤或者肿瘤细胞成瘤过程必然伴随着肿瘤新生血管生成，整合素αVβ₃作为肿瘤发生、发展过程中的共有物质，具有一定的特异性，因此整合素αVβ₃是肿瘤治疗潜在的分子靶点。

含RGD序列的多肽，如线性RGD肽、环状RGD肽及RGD肽的多聚体，具有相对分子质量小、稳定、易于制备，且无免疫原性等优点。目前，已有一些含RGD肽序列的环肽进入临床试验。

临床肿瘤治疗实践显示，两种或多种药物联合给药可以减少总的用药剂量，产生互补的作用及多重效应，是提升药效，降低药物毒性的有效策略之一，同时包载两种理化性质不同的药物体系，在肿瘤治疗中，可以以最少的药量达到理想的协同效果。应用聚合物材料制备胶束载体用于抗肿瘤药物的递送是近年来药物输送***研究的热点，但仍存在胶束体系的载药量低的缺陷，联合载药则可以弥补胶束载药量低的缺陷，同时发挥药物各自作用及协同作用。因此主动靶向的联合载药胶束载体在构建肿瘤靶向递药***方面有着潜在的优势。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷,提供一种靶向整合素受体的联合载药胶束及其制备方法。

本发明合成了末端羧基修饰的普朗尼克（Pluronic-COOH），并以RGD多肽与羧基通过酰胺键相连，得到RGD肽修饰的普朗尼克共聚物（RGD-Pluronic）；将药物阿霉素（DOX）与普朗尼克（Pluronic）共聚后，采用薄膜水化法包载另一药物紫杉醇（PTX）制备混合胶束（RGD-FP-DP）。

更具体的，

本发明中，提供了带有活性基团羧基的两亲性共聚物及其制备方法。

本发明中，提供了具有整合素受体靶向的RGD肽修饰的两亲性共聚物及其制备方法。

本发明中，提供了具有药物共聚的两亲性共聚物及其制备方法。

本发明中，提供了靶向整合素受体的胶束及其制备方法和应用。

本发明中，将上述的靶向整合素受体的胶束载体应用于同时载两种或多种亲水性和疏水性抗肿瘤药物，制得到具有主动靶向性的联合载药的胶束。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

带有活性基团羧基的两亲性共聚物（Pluronic-COOH），聚合药物盐酸阿霉素的两亲性共聚物Pluronic-DOX及其制备方法，其合成方法如下：

其中，Pluronic通常选用的型号为Pluronic L35，L43，L44，L61，L62，L64，F68，L81，P84，P85，F87，F88，L92，F98，L101，P103，P104，P105，F108，L121，P123和F127；药物通常选择水溶性抗肿瘤药物。

本发明中，具有整合素受体靶向的RGD肽修饰的两亲性共聚物，其分子式通式为：RGD-X-Pluronic，其中，RGD-X为含有Arg-Gly-Asp序列的线性RGD肽、环状RGD肽以及RGD肽的多聚体，通过下述方法制备：

将上述的具有两亲性的整合素受体靶向的RGD肽修饰的共聚物RGD-X-Pluronic、普通两亲性载体Pluronic与Pluronic-DOX按一定的比例混合，共溶于有机溶剂中，采用薄膜-水化法制备靶向胶束。本发明的实施例中，该靶向胶束中，优选的三种组分的比例按以下质量百分比：RGD-X-Pluronic为1%-20%，Pluronic为89%-20%，Pluronic-DOX为10%-60%。

将疏水性的抗肿瘤药物(例如：紫杉醇(PTX))与RGD-X-Pluronic、Pluronic、Pluronic-DOX共溶于有机溶剂中，按薄膜水化法进行制备，即得包载两种抗肿瘤药物的靶向胶束(例如PTX、DOX联合给药靶向胶束)；所选疏水的抗肿瘤药物载药量为0.1%-20%。

本发明的实施例中，优选联合载药的靶向整合素受体的胶束制备方法，其包括步骤：

(1)按以下质量百分比取各组分：疏水性的抗肿瘤药物0.1%-20%；RGD-X-Pluronic、Pluronic和Pluronic-DOX混合物80-99.9%，该混合物中RGD-X-Pluronic为1%-20%，Pluronic为89%-20%，Pluronic-DOX为10%-60%；

(2)将上述各组分用有机溶剂，优选为二氯甲烷或三氯甲烷溶解，超声使载体材料和药物充分溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，优选温度为37°C，室温下真空干燥过夜，加入去离子水，水化，优选为恒速700rpm，37°C水浴，搅拌30min，冷却至室温，用0.22μm醋酸纤维素酯膜过滤，得联合载药的靶向胶束溶液，冻干后保存。粒径测定显示，所制备的胶束粒径在10-400nm，如图3所示。

本发明中，针对抗肿瘤药物紫杉醇(PTX))具有优异的抗肿瘤疗效，但是其的溶解度小于1μg·ml^-1，口服生物利用度差，且，现有的紫杉醇注射剂泰素

和PTX白蛋白结合物均有着不同的副作用；和针对DOX是一种周期非特异性抗癌化疗药物，临床上主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、乳腺癌、肺癌、软组织肉瘤、肝癌等，但在化疗的过程中常发生严重的不良反应；且DOX分子量低，在体内容易扩散，导致相对平均的组织分布，对正常组织产生毒副作用，同时影响抗肿瘤作用；同时依据临床研究表明的，DOX与PTX联合给药比单独给药的抗肿瘤效果好，尤其是作为用于乳腺癌的一线治疗药物；结合两亲性的RGD肽修饰的共聚物RGD-X-Pluronic具有疏水链，可以自组装形成核-壳型的纳米复合物，疏水性的核可以作为脂溶性药物的微型蓄库；Pluronic两端羟基可以被氧化成为羧基而修饰上带有氨基的亲水性药物等，本发明将RGD肽修饰的嵌段共聚物RGD-X-Pluronic引入到含有PTX和DOX的联合给药传递***制备得到靶向胶束。经试验证实，该联合给药胶束***可以有效增加药物在靶部位的浓度并减少其在肝脾等非靶部位的毒副作用，可显著提高药物的治疗指数。

本发明中，以耐药的KBv细胞为模型，采用MTT法考察RGD-FP-DP、普通胶束和游离药物对耐药肿瘤细胞的生长抑制情况，结果显示：RGD-FP-DP对耐药肿瘤细胞的抑制率显著强于普通胶束和游离药物（如图4所示）。

本发明中，以DOX的红色荧光为探针，考察靶向胶束和普通胶束的在耐药的KBv细胞的摄取情况，结果显示，靶向胶束组耐药细胞的荧光强度显著高于普通胶束组（如图5所示）。

本发明中，以Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测RGD-FP-DP，普通胶束和Taxol与DOX的混合药物(Taxol+DOX)引起的细胞凋亡情况，结果显示，RGD-FP-DP组引起的KBv细胞早期凋亡和晚期凋亡显著强于普通胶束和Taxol+DOX组（如图6所示）。

本发明中，以荷有KBv皮下瘤的裸鼠为动物模型，通过静脉给予荧光探针DiR标记的靶向胶束和普通胶束，以CRi活体成像仪，观察纳米复合物在体内的分布情况和肿瘤部位的主动靶向特性，结果显示，靶向胶束在肿瘤部位的蓄积明显高于普通胶束，同时显示靶向胶束在肝脾部位的摄取明显减少（如图7所示）。

本发明中，以荷有KBv皮下瘤的裸鼠为动物模型，通过静脉给予RGD-FP-DP、普通胶束和游离药物，进行体内药效学评价。结果显示，RGD-FP-DP对KBv耐药肿瘤的药效明显优于其余各组（如图8所示），其中的阿霉素组的给药剂量已接近阿霉素的最大安全浓度，肿瘤虽然最小，但小鼠体重减少非常多，表明其毒性大。

本发明的联合载药胶束的优点有：可提高胶束的载药量，增加抗肿瘤药物在靶部位的药物浓度并减少其在非靶部位的蓄积，能有效地提高药物的治疗指数。

附图说明

图1是Pluronic、Pluronic-NHS和Pluronic-DOX的¹H-NMR图谱。

图2是DOX,Pluronic P105-COOH和Pluronic P105-DOX的紫外全波长扫描图谱。

图3为RGD-FP-DP的粒径分布图(A);透射电镜(B)和原子力显微镜照片(C)。

图4为RGD-FP-DP和普通胶束对KBv肿瘤细胞生长抑制曲线。

图5为RGD-FP-DP和普通胶束在KBv细胞的摄取比较。

图6为Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测对照组，Taxol与DOX的混合药物，普通胶束和RGD-FP-DP引起的细胞凋亡情况。

图7为荧光探针DiR标记靶向胶束和普通胶束在荷有KBv皮下肿瘤的裸鼠体内分布。

图8为各给药组KBv荷瘤鼠处死后剥离出的肿瘤照片：生理盐水(A)、DOX(B)、Taxol(C)、Taxol+DOX(D)、PF-DP(E)和RGD-FP-DP(F)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明，这些实施例完全是例证性的，它们仅仅是用来对本发明进行具体描述，本发明的保护范围不局限于下述实施例。

实施例1制备带有活性基团羧基的两亲性嵌段共聚物Pluronic-COOH

将0.01M Pluronic和400ml丙酮置于圆底烧瓶中，缓慢升温至溶液澄清，放冷至室温后，加入17ml琼斯试剂，于室温磁力搅拌过夜，加入5mL异丙醇淬灭反应。加入12.6g活性炭继续搅拌2h，加热至40°C，趁热抽滤得到澄清溶液，减压蒸发得到白色粘稠物，加入预冷的正己烷，使固体析出，真空干燥得羧基化的Pluronic(Pluronic-COOH)。以凝胶渗透色谱(GPC)分析产物的纯度，以¹H-NMR图谱中亚甲基中质子的峰面积比值计算产物的分子量。

实施例2制备Pluronic-DOX

称取上述实施例1中的Pluronic-COOH 7.4mM，在室温下溶于20ml N,N-二甲基甲酰胺。将1g EDC和2g NHS加入Pluronic-COOH的溶液中。反应15min后,加入2.8ml 2-巯基乙醇，3.48g DOX和10mg三乙胺，于室温继续搅拌12h，氮气保护。反应过后，用去离子水避光透析2天(MWCO 3500)，浓缩液冷冻干燥即得Pluronic-DOX。通过¹H-NMR图谱对产物进行验证；紫外可见分光光度法测定吸光度，计算DOX的摩尔连接率。

实施例3制备以RGD肽修饰的两亲性共聚物

(1)以NHS活化羧基制备Pluronic-NHS：

称取上述实施例1中的Pluronic-COOH 0.053mM，DCC 22mg和NHS 12.2mg共溶于5ml的氯仿中，氮气保护下室温反应24h。待反应结束，减压除去溶剂，并以冷的***沉淀。将沉淀真空干燥至恒重，即得Pluronic-NHS。通过1H-NMR图谱对产物进行验证；

(2)环形RGD肽(c(RGDyK))修饰的两亲性共聚物制备c(RGDyK)-Pluronic；

取上述(1)中的Pluronic-COOH 0.0053mM溶于1ml的N,N-二甲基甲酰胺中，得溶液A；取6.3mg(0.01mM)的c(RGDyK)肽溶于0.1M HEPES,得到溶液B。将溶液B滴加到溶液A中，并以N-甲基-吗啉调节pH值8.4。室温下反应24h，待反应结束，将产物在生理盐水中透析48h(MWCO 3500)，除去过量的游离c(RGDyK)肽。待透析结束，将产物c(RGDyK)-Pluronic冷冻干燥；将合成的c(RGDyK)肽修饰的两亲性共聚物通过¹H-NMR图谱对产物进行验证。

实施例4

将3mg PTX、100mg Pluronic-DOX、167mg Pluronic和30mg c(RGDyK)-Pluronic，置于50ml圆底烧瓶中，加入5ml二氯甲烷使载体材料和药物充分溶解，于37°C下旋转蒸发40min将溶剂蒸干，室温下真空干燥过夜；加入5ml去离子水，在700rpm转速37°C水浴中恒速搅拌30min，冷却至室温，用0.22μm醋酸纤维素酯膜过滤，去除未包载的药物，即得RGD-FP-DP胶束，冻干后保存；RGD-FP-DP胶束的平均粒径为28.33±3.61nm。

实施例5靶向整合素受体的胶束细胞摄取实验

将培养的KBv细胞以0.25%的胰蛋白酶消化，每孔5×105细胞接种于24孔培养板。37°C下，5%CO2条件下培养24h；然后弃去培养液，RGD-FP-DP和普通胶束，继续孵育1h。待孵育结束，以预冷的PBS洗涤三遍，在荧光显微镜下观察细胞摄取胶束的情况；结果显示，摄取RGD-FP-DP的KBv细胞荧光强度显著高于普通胶束组。

实施例6RGD-FP-DP和普通胶束对KBv肿瘤细胞生长抑制实验

将KBv细胞以0.25%的胰蛋白酶消化，每孔5×10⁵细胞接种于96孔培养板，37°C下，5%CO₂条件下培养24h；然后弃去培养液，加入一定浓度的紫杉醇溶液（Taxol溶液）、DOX溶液、Taxol+DOX、RGD-FP-DP和联合载药的普通胶束(FP-DP)，继续孵育72h，培养结束后，每孔加5mg·ml^-1的MTT液20μl，37°C继续培养4h后，终止培养，吸弃上清液，每孔加200μl DMSO，避光振荡10min使结晶物充分溶解，以酶标仪检测570nm处测定OD值，计算细胞抑制率，结果显示：RGD-FP-DP对KBv肿瘤细胞的抑制率显著强于普通胶束。

实施例7以Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测RGD-FP-DP、FP-DP、Taxol、DOX和Taxol+DOX引起的细胞凋亡实验

将KBv细胞以0.25%的胰蛋白酶消化，每孔5×10⁵细胞接种于6孔培养板，37°C下，5%CO₂条件下培养24h；然后弃去培养液，加入一定浓度的各组药物，同时以加入空白1640培液的KBv细胞作为阴性对照组，继续孵育24h，孵育结束后，收集培液，采用预冷的PBS离心洗涤细胞1遍，加入适量0.25%胰酶消化细胞，合并上述收集的培液和消化下来的细胞悬液，离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞3遍并用PBS重悬细胞进行计数，参照Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒的方法处理，进行流式细胞仪检测，结果显示，RGD-FP-DP组引起的KBv细胞早期凋亡和晚期凋亡显著强于普通胶束和各游离药物组。

实施例8

取含有5×10⁶个KBv细胞的悬液注射到雄性balb/c裸鼠的右后肢皮下，待肿瘤长到直径约7mm时，通过尾静脉给予荧光探针DiR标记靶向胶束和普通胶束，在CRI活体成像仪上观察纳米复合物的分布，以考察靶向胶束在肿瘤部位的主动靶向性，结果显示，靶向胶束在肿瘤部位的蓄积明显高于普通胶束，同时显示靶向胶束在肝脾部位的摄取明显减少。

实施例9

取含有5×10⁶个KBv细胞的悬液注射到雄性balb/c裸鼠的右后肢皮下，待肿瘤长至50-100mm³(记作0天)，以药物浓度10mg·kg^-1的剂量，分别给予生理盐水、DOX、Taxol、Taxol+DOX、FP-DP和RGD-FP-DP。于第0、3、6日尾静脉注射给药，于第10日处死小鼠，剥离出肿瘤称重，计算抑瘤率，结果显示，RGD-FP-DP的KBv肿瘤抑瘤率明显高于FP-DP以及各游离药物组，在体内产生良好的治疗耐药性肿瘤的药效。

Claims

1.一种靶向整合素受体的联合载药胶束，其特征在于，由下述质量百分比的组分组成：疏水性的抗肿瘤药物0.1%-20%，具有整合素受体靶向的RGD肽修饰的两亲性共聚物、与药物共聚的嵌段共聚物和普通嵌段共聚物的混合物为80-99.9%，该混合物中RGD肽修饰的两亲性共聚物为1%-20%，与药物共聚的嵌段共聚物为10%-60%，普通嵌段共聚物为89%-20%；联合载药方式为包载和共聚。

2.按权利要求1所述的靶向整合素受体的联合载药胶束，其特征在于，所述的带有活性基团羧基的两亲性嵌段共聚物，其分子式为Pluronic-COOH；普通嵌段共聚物Pluronic，其中，Pluronic代表各种Pluronic型号，包括Pluronic L35，L43，L44，L61，L62，L64，F68，L81，P84，P85，F87，F88，L92，F98，L101，P103，P104，P105，F108，L121，P123和F127。

3.按权利要求1所述的靶向整合素受体的联合载药胶束，其特征在于，所述的具有整合素受体靶向的RGD肽修饰的两亲性共聚物其分子式为：RGD-X-PF-DP，其中，RGD-X为含有Arg-Gly-Asp序列的线性RGD肽、环状RGD肽以及RGD肽的多聚体。

4.按权利要求1所述的靶向整合素受体的联合载药胶束，其特征在于，与嵌段共聚物共聚的药物为水溶性或疏水性药物，选自阿霉素，盐酸阿霉素，表阿霉素，紫杉醇，多西紫杉醇，长春新碱，硫酸长春新碱，甲氨蝶呤或9-硝基喜树碱的一种或两种或两种以上。

5.一种制备权利要求1所述的靶向整合素受体的联合载药胶束的方法，其特征在于，其包括：将所述各组分以有机溶剂溶解，采用薄膜/水化法制备靶向胶束。