CN103800351A - 木通皂苷e的药物用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木通皂苷E的药物用途，所述的药物用途是指以木通皂苷E作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗抗肿瘤的药物制剂。本发明的研究结果表明：木通皂苷E可通过诱导严重的内质网应激而抑制肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞的恶性增殖，可广泛应用于治疗原发性肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的药物制剂的制备中；当木通皂苷E与其它治疗药物或化疗药物组合使用时，肿瘤细胞将会因内质网应激而使其耐药力下降，加速其凋亡或死亡，可以实现减量增效，降低药物的毒副作用，将会增加患者治疗机会和延长有效药物治疗的周期，具有广泛和重要的应用前景和开发价值。

Description

木通皂苷E的药物用途

技术领域

本发明涉及木通皂苷E的药物用途，具体说，是涉及木通皂苷E在制备抗肿瘤药物制剂中的用途，属于医药技术领域。本发明还涉及木通皂苷E作为诱导细胞内质网应激试剂的应用，属于生物化学和细胞分子生物学技术领域。

背景技术

肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤是当代严重危害人类健康与生命的重大疾病。这些恶性肿瘤患者在失去手术指征后，往往依赖化疗等综合疗法。以化疗为代表的综合疗法往往因其对患者造血***、免疫***、消化***等严重抑制造成的毒副作用，限制了其持续有效的治疗。若能够寻找到有别于细胞毒化疗药物作用途径的抗肿瘤药物，例如诱导细胞内质网严重应激的药物，单独或联合化疗综合治疗，将有望减少化疗药物的用量，增强疗效，从而延长患者治疗周期及寿命，提高其生存质量，从而产生良好的社会和经济效益。

预知子为木通科植物木通（Akebia quinata（Thunb.）Decne.）、三叶木通（Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.）、白木通（Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz.var.australis（（Diels））Rehd.）的干燥近成熟果实，含有木通皂苷（Akebia saponin）A、B、C、D、E、F及G（其皂苷元均为常春藤皂苷元）等几十种成份。预知子是中医常用中药，其性味苦寒，归肝、胆、胃、膀胱经，具有疏肝理气、和胃、活血止痛、软坚散结、利尿等功效。迄今为止，预知子相关论著、专利、科技成果等文献内容多以复方组成药物之一的形式在临床应用为主，单味药研究罕见。

预知子籽是从预知子中剥离出来的种子，约占干果重量的1/3。现有技术中关于预知子籽的单独功效仅限于本发明人在中国专利申请CN201310140809.X中公开的预知子籽的乙醇提取物可作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗原发性肝癌的药物制剂。

木通皂苷E（Akebia saponin E），其化学名为：3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-α-L-吡喃***糖常春藤皂苷元-28-O-B-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-吡喃葡萄糖，具有如下化学结构式：

研究表明：预知子中木通皂苷E的含量仅为0.74%，预知子籽中的木通皂苷E的含量约为1%；迄今为止，关于木通皂苷E的药物用途尚未见相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种木通皂苷E的药物用途。

本发明所述的木通皂苷E的药物用途，是指以木通皂苷E作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗抗肿瘤的药物制剂。

进一步说，本发明所述的木通皂苷E的药物用途，是指以木通皂苷E作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备包含通过诱导内质网应激途径治疗抗肿瘤的药物制剂。

所述的肿瘤包括肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤。

进一步说，所述的药物制剂中可包括有效量的木通皂苷E和其它治疗抗肿瘤的药物。

进一步说，所述的木通皂苷E还包括基于木通皂苷E结构构象特征进行分子修饰或结构改造得到的类似物和衍生物。

进一步说，所述的木通皂苷E可来源于化学合成和预知子籽的提取物。

更进一步说，由预知子籽提取获取木通皂苷E的方法，包括如下步骤：

a)用60vol%～95vol%的乙醇水溶液对预知子籽粉碎粗粉进行回流提取2～3次，收集提取液，过滤、减压回收乙醇，得到含木通皂苷E的预知子籽醇提物；

b)用去离子水稀释含木通皂苷E的预知子籽醇提物至目视溶液流动性好、无粘稠状态，然后依次用1:1体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2～3次，收集正丁醇萃取相，减压回收正丁醇，得到含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位；

c)将含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位上D101大孔树脂吸附柱，依次用水～95vol%的乙醇水溶液进行梯度洗脱；取50vol%的乙醇水溶液的洗脱液，进行减压回收乙醇、干燥，得到含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位；

d)将含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位用甲醇溶解和硅胶粉拌样后，减压回收甲醇、干燥，上硅胶层析柱，用二氯甲烷与甲醇按体积含量为100%:0～0:100%进行梯度洗脱；取第3个洗脱部分，进行减压浓缩、干燥，得到含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位；

e)将含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位上ODS反相硅胶层析柱，用5vol%的甲醇水溶液～无水甲醇进行梯度洗脱；取第1个洗脱部分，进行减压回收甲醇、干燥，即得木通皂苷E。

本发明所述的药物制剂可以各种给药途径给予患者，包括但不限于口服、透皮、肌肉、皮下和静脉注射。

上述的药物制剂可以是任何可药用的剂型，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

本发明的研究结果表明：木通皂苷E具有显著地诱导细胞发生严重的内质网应激的药效特征；而内质网是细胞内蛋白合成加工的场所，其发生应激会导致细胞严重的“消化不良”、机能锐减，程度严重者会直接诱导细胞凋亡或坏死；因此，木通皂苷E可通过诱导严重的内质网应激而抑制肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞的恶性增殖，因而可广泛应用于治疗原发性肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的药物制剂的制备中，具有药用价值；当木通皂苷E与其它治疗药物或化疗药物组合使用时，肿瘤细胞将会因内质网应激而使其耐药力下降，加速其凋亡或死亡，可以实现减量增效，降低药物的毒副作用，将会增加患者治疗机会和延长有效药物治疗的周期，具有广泛和重要的应用前景和开发价值。

附图说明

图1是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与各对照药对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图，其中：a是普通细胞组，b是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，c是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为3.33μg/mL的阿霉素组，e是用药浓度为6.67μg/mL的阿霉素组，f是0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3.33μg/mL的阿霉素联合用药组。

图2是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与对照药及半量联合用药组在给药72小时后对SMMC7721肝癌细胞形态学的影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片），其中：图a是常规培养的肝癌细胞；图b是给药浓度为6.67μg/mL的阿霉素作用的肝癌细胞；图c是给药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用的肝癌细胞；图d是0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3.33μg/mL的阿霉素作用后的肝癌细胞。

图3是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与各对照药对A549肺癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图，其中：a是普通培养A549肺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，e是用药浓度为2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，f是用药浓度为3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组。

图4是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与化疗药物联用对A549肺癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图，其中：a是普通培养A549肺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组。

图5是含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药72h后对A549肺癌细胞的形态学影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片）。其中：图a是常规培养的肺癌细胞；图b是6μg/mL的阿霉素作用后的肺癌细胞；图c是1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后的肺癌细胞；图d是0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的肺癌细胞。

图6是含木通皂苷E的预知子籽醇提物对MCF7乳腺癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。其中：a是普通培养MCF7乳腺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，e是用药浓度为2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，f是用药浓度为3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组。

图7是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与化疗药物联用对MCF7乳腺癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。其中：a是普通培养MCF3乳腺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组。

图8是含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药72h后对MCF7乳腺癌细胞的形态学影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片）。其中：图a是常规培养的乳腺癌细胞；图b是6μg/mL的阿霉素作用后的乳腺癌细胞；图c是1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后的乳腺癌细胞；图d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的乳腺癌细胞。

图9是含木通皂苷E的预知子籽醇提物对SGC7901胃癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。其中：a是普通培养的胃癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，e是用药浓度为2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，f是用药浓度为3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组。

图10是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与化疗药物联用对SGC7901胃癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。其中：a是普通培养胃癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组。

图11是含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药72h后对SGC7901胃癌的形态学影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片）。其中：图a是常规培养的胃癌细胞；图b是6μg/mL的阿霉素作用后的胃癌细胞；图c是1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后的胃癌细胞；d图是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的胃癌细胞。

图12是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.625mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组。

图13是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对HepG2肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.45mg/mL G418组，c是用药浓度为0.47mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，d是用药浓度为0.24mg生药/mL含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组+0.225mg/mL G418的联合用药组。

图14是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对Huh7肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.45mg/mL G418组，c是用药浓度为0.625mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，d是用药浓度为0.31mg生药/mL含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组+0.225mg/mL G418的联合用药组。

图15是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位组，c是用药浓度为1mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位组，d是用药浓度为2mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位组。

图16是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为2mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组，c是用药浓度为4mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组，d是用药浓度为8mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组。

图17是不同剂量的木通皂苷E对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为30μM的木通皂苷E组，c是用药浓度为60μM的木通皂苷E组，d是用药浓度为120μM的木通皂苷E组。

图18是木通皂苷E的高效液相分析图。

图19是木通皂苷E的超高效液相与四级杆串联飞行时间质谱仪分析图。

图20是木通皂苷E的核磁共振碳谱图。

图21是木通皂苷E的碳谱数据。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1：制备含木通皂苷E的预知子籽醇提物

将预知子籽粉碎成粗粉，用8～10倍量的60vol%～95vol%的乙醇水溶液浸泡2h，加热回流提取2～3次，每次2h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇直至提取液无醇味，得到含木通皂苷E的预知子籽醇提物。

实施例2：含木通皂苷E的预知子籽醇提物的药效实验

采用双蒸水溶解含木通皂苷E的预知子籽醇提物并调节pH至7.0，然后加双蒸水定容至1g生药/mL；细胞培养条件抽滤灭菌，分装保存于-80℃备用；将肿瘤细胞进行96孔板铺皿；过夜细胞贴壁后，进行给药；分别在给药24、48、72h后采用倒置显微镜检测并拍照、MTT法检测肿瘤细胞增殖生长率，并绘制量效曲线。

药效实验一，含木通皂苷E的预知子籽醇提物对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图1是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与各对照药对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果，其中：a是普通细胞组，b是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，c是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为3.33μg/mL的阿霉素组，e是用药浓度为6.67μg/mL的阿霉素组，f是0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3.33μg/mL的阿霉素联合用药组。

由图1可见：各自给药量减半的3.33μg/mL的阿霉素+0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物，对肝癌细胞的抑制作用均明显强于3.33μg/mL的阿霉素及0.94mg/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物的单独作用，接近6.67μg/mL的阿霉素组，呈现减量增效的作用。

图2是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与对照药及半量联合用药组在给药72小时后对SMMC7721肝癌细胞形态学的影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片），其中：图a是常规培养的肝癌细胞；图b是给药浓度为6.67μg/mL的阿霉素作用的肝癌细胞；图c是给药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用的肝癌细胞；图d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的肝癌细胞。

由图2可见：肝癌细胞在给药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后，出现严重的内质网应激（图c）；经用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后，肝癌细胞具有典型的内质网应激，细胞内残留大量空泡，并见细胞伪足及凋亡现象，存活的肝癌细胞数量明显减少，具有明显减量增效的作用（图d）。

药效实验二，含木通皂苷E的预知子籽醇提物对A549肺癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图3是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与各对照药对A549肺癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果，其中：a是普通培养A549肺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，e是用药浓度为2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，f是用药浓度为3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组。

由图3可见：含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药对肺癌细胞的增殖抑制作用具有明显的量效关系，1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药，即对肺癌细胞有显著地增殖抑制作用；当1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药后其增殖抑制作用已强于6μg/mL的阿霉素。

图4是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与化疗药物联用对A549肺癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果，其中：a是普通培养A549肺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组。

由图4可见：含木通皂苷E的预知子籽醇提物与阿霉素各自半量组合（0.94mg生药/mL含木通皂苷E的预知子籽醇提物+阿霉素3μg/mL）用药对肺癌细胞具有明显的增殖抑制作用；并且其半量组合后的增殖抑制作用接近含木通皂苷E的预知子籽醇提物足量（1.88mg生药/mL）及阿霉素足量（6μg/mL）的效果，可实现减量增效的协同作用。

图5是含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药72h后对A549肺癌细胞的形态学影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片）。其中：图a是常规培养的肺癌细胞；图b是6μg/mL的阿霉素作用后的肺癌细胞；图c是1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后的肺癌细胞；图d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的肺癌细胞。

由图5可见：1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药后，肺癌细胞数目剧减，内普遍出现严重的内质网应激，表现为大量的空泡（图c）；阿霉素6μg/mL用药后，肺癌细胞数目剧减（图b）；含木通皂苷E的预知子籽醇提物与阿霉素各自半量组合（0.94mg生药/mL含木通皂苷E的预知子籽醇提物+阿霉素3μg/mL）用药后，肺癌细胞同样数目剧减，尚存细胞内仍有内质网应激的特征（图d）。

药效实验三，含木通皂苷E的预知子籽醇提物对MCF7乳腺癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图6是含木通皂苷E的预知子籽醇提物对MCF7乳腺癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果。其中：a是普通培养乳腺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，e是用药浓度为2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，f是用药浓度为3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组。

由图6可见，含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药对乳腺癌细胞的增殖抑制作用具有明显的量效关系，1.88、2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药，即对乳腺癌细胞有显著地增殖抑制作用；当3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物（f）用药后其增殖抑制作用已远远强于6μg/mL的阿霉素（b）。

图7是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与化疗药物联用对MCF7乳腺癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果。其中：a是普通培养MCF3乳腺癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组。

由图7可见，含木通皂苷E的预知子籽醇提物与阿霉素各自半量组合（d）用药后，对乳腺癌细胞具有明显的增殖抑制作用，作用明显强于含木通皂苷E的预知子籽醇提物足量（c），并且接近阿霉素足量（b）的效果，呈现了明显的减量增效作用。

图8是含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药72h后对MCF7乳腺癌细胞的形态学影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片）。其中：图a是常规培养的乳腺癌细胞；图b是6μg/mL的阿霉素作用后的乳腺癌细胞；图c是1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后的乳腺癌细胞；图d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的乳腺癌细胞。

由图8可见，预知子籽1.88生药/mL的乙醇提取物用药后，乳腺癌细胞发生严重的内质网应激，细胞内有空泡出现（图c）；阿霉素6μg/mL用药后，乳腺癌细胞数目剧减，细胞间连接解离（图b）；含木通皂苷E的预知子籽醇提物与阿霉素各自半量组合（图d）用药后，乳腺癌细胞数目剧减，细胞间连接解离；残留有细胞内空泡现象。

药效实验四，含木通皂苷E的预知子籽醇提物对SGC7901胃癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图9是含木通皂苷E的预知子籽醇提物对SGC7901胃癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果。其中：a是普通培养的胃癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，e是用药浓度为2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，f是用药浓度为3.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组。

由图9可见，含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药对胃癌细胞的增殖抑制作用具有明显的量效关系，1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药，即对胃癌细胞有显著地增殖抑制作用；当2.5mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物（e）用药后其增殖抑制作用已强于阳性对照药6μg/mL的阿霉素（b）。

图10是含木通皂苷E的预知子籽醇提物与化疗药物联用对SGC7901胃癌细胞恶性增殖的抑制作用MTT结果。其中：a是普通培养胃癌细胞组，b是用药浓度为6μg/mL的阿霉素组，c用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物组，d是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组。

由图10可见，含木通皂苷E的预知子籽醇提物与阿霉素各自半量组合（d）用药对胃癌细胞具有明显的增殖抑制作用，接近含木通皂苷E的预知子籽醇提物足量（c）及阿霉素足量（b）的作用，可呈现明显的减量增效的协同作用。

图11是含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药72h后对SGC7901胃癌的形态学影响（采用倒置显微镜（400倍）观察的形态图片）。其中：图a是常规培养的胃癌细胞；图b是6μg/mL的阿霉素作用后的胃癌细胞；图c是1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物作用后的胃癌细胞；d图是用药浓度为0.94mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物+3μg/mL阿霉素的联合用药组作用后的胃癌细胞。

由图11可见，1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽醇提物用药后，大多胃癌细胞出现了严重的内质网应激，胞浆内布满空泡（图c）；阿霉素6μg/mL用药后，胃癌细胞肿胀，数目减少，个别细胞内亦出现空泡（图b）；含木通皂苷E的预知子籽醇提物与阿霉素各自半量组合用药后，胃癌细胞出现类似于阿霉素足量用药后的形态变化（图d）。

实施例3：制备含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位

用去离子水稀释含木通皂苷E的预知子籽醇提物至目视溶液流动性好、无粘稠状态，然后用1:1体积的石油醚萃取3次，所得水相再用1:1体积的乙酸乙酯萃取3次，所得水相再用1:1体积的正丁醇萃取3次，收集正丁醇萃取相，减压回收正丁醇直至正丁醇挥尽，得到含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位。

实施例4：含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位的药效实验

采用双蒸水溶解含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位并调节pH至7.0，然后加双蒸水定容至1g生药/mL；细胞培养条件抽滤灭菌，分装保存于-80℃备用；将肿瘤细胞进行96孔板铺皿；过夜细胞贴壁后，进行给药；分别在给药24、48、72h后采用倒置显微镜检测并拍照。

药效实验一，含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图12是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.625mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，c是用药浓度为1.25mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，d是用药浓度为1.88mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组。

由图12的结果可见：用药浓度为0.625mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位致肝癌细胞所有细胞发生严重的内质网应激，胞浆内布满空泡；含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位的用药浓度达1.25mg生药/mL时，肝癌细胞开始发生细胞固缩、脱胞浆。

药效实验二，含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对HepG2肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图13是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对HepG2肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.45mg/mL G418组，c是用药浓度为0.47mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，d是用药浓度为0.24mg生药/mL含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组+0.225mg/mL G418的联合用药组。

由图13的结果可见：用药浓度为0.47mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位致肝癌细胞所有细胞发生严重的内质网应激，胞浆内布满空泡；含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位与G418各自半量组合，肝癌细胞出现明显的固缩、凋亡和坏死，部分细胞仍可见严重的内质网应激。

药效实验三，含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对Huh7肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图14是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位对Huh7肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.45mg/mL G418组，c是用药浓度为0.625mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组，d是用药浓度为0.31mg生药/mL含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位组+0.225mg/mL G418的联合用药组。

由图14的结果可见：用药浓度为0.625mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位致肝癌细胞所有细胞发生严重的内质网应激，胞浆内布满空泡；含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位与G418各自半量组合，肝癌细胞出现明显的固缩、凋亡和坏死，部分细胞仍可见严重的内质网应激。

实施例5：制备含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位

将含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位上D101大孔树脂吸附柱（柱体积与生药按5:1比例计算），依次用水～95vol%的乙醇水溶液进行梯度洗脱；取50vol%的乙醇水溶液的洗脱液，减压回收直至乙醇挥尽，得到含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位。

实施例6：含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位的药效实验

采用双蒸水溶解含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位并调节pH至7.0，然后加双蒸水定容至1g生药/mL；细胞培养条件抽滤灭菌，分装保存于-80℃备用；将肿瘤细胞进行96孔板铺皿；过夜细胞贴壁后，进行给药；分别在给药24、48、72h后采用倒置显微镜检测并拍照。

药效实验一，含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图15是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为0.75mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位组，c是用药浓度为1mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位组，d是用药浓度为2mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位组。

由图15的结果可见，用药浓度为0.75mg生药/mL的含木通皂苷E的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位致肝癌细胞部分细胞发生了严重的内质网应激现象，胞浆内出现空泡；当含木通皂苷E的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位的用药浓度达1mg生药/mL时，几乎所有细胞都产生了严重的内质网应激。当含木通皂苷E的含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位的用药浓度达2mg/mL时，肝癌细胞开始出现固缩、死亡。

实施例7：制备含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位

将含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位用甲醇溶解和硅胶粉（100-200）拌样（预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位与硅胶粉的质量比为1:3）后，减压回收甲醇、干燥，上硅胶（200-300）层析柱（硅胶与预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位的质量比为20:1），用二氯甲烷与甲醇按体积含量为100%:0～0:100%进行梯度洗脱；取第3个洗脱部分，减压回收甲醇、干燥，得到含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位。

实施例8：含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位的药效实验

采用双蒸水溶解含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位并调节pH至7.0，然后加双蒸水定容至1g生药/mL；细胞培养条件抽滤灭菌，分装保存于-80℃备用；将肿瘤细胞进行96孔板铺皿；过夜细胞贴壁后，进行给药；分别在给药24、48、72h后采用倒置显微镜检测并拍照。

药效实验一，含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图16是不同剂量的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为2mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组，c是用药浓度为4mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组，d是用药浓度为8mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组。

由图16的对比结果可见，用药浓度为2mg生药/mL的含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位组致肝癌细胞部分细胞发生了严重的内质网应激现象，胞浆内出现空泡；用药浓度达4mg生药/mL时，几乎所有细胞发生了严重的内质网应激现象；用药浓度达8mg生药/mL时，细胞出现固缩、死亡现象。

实施例9：制备木通皂苷E

将含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位上ODS反相硅胶层析柱（ODS反相硅胶与预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位的质量比为40:1），用5vol%的甲醇水溶液～无水甲醇进行梯度洗脱；取第1个洗脱部分，减压回收甲醇、干燥，即得木通皂苷E。

实施例10：木通皂苷E的药效实验

采用双蒸水溶解木通皂苷E并调节pH至7.0，然后加双蒸水定容至1g生药/mL（分子量明确后折算成μM）；细胞培养条件抽滤灭菌，分装保存于-80℃备用；将肿瘤细胞进行96孔板铺皿；过夜细胞贴壁后，进行给药；分别在给药24、48、72h后采用倒置显微镜检测并拍照。

药效实验一木通皂苷E对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用：

图17是不同剂量的木通皂苷E对SMMC7721肝癌细胞恶性增殖的抑制作用对比图。图中：a是普通细胞对照组，b是用药浓度为30μM的木通皂苷E组，c是用药浓度为60μM的木通皂苷E组，d是用药浓度为120μM的木通皂苷E组。

由图17的对比结果可见，用药浓度为30μM的木通皂苷E对肝癌细胞中部分细胞产生严重的内质网应激现象，胞浆内出现空泡；用药浓度达60μM时，几乎所有细胞产生严重的内质网应激现象，并有部分细胞发生固缩。

采用Agilent1260HPLC进行高效液相色谱检测，色谱柱：Kromasil ODS4.6×250,5μm，蒸发温度：70℃，雾化温度：40℃，Gas：1.00，流动相为乙腈，梯度洗脱：0～3min5%，3～18min35%～75%，经高效液相色谱检测确定该部位为单一化学成分。

图18是木通皂苷E的高效液相分析图。

采用超高效液相色谱与四级杆串联飞行时间质谱仪分析：超高效液相色谱方法中，流动相A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈；色谱柱温为45℃，样品室温为10℃，流速为0.4mL/min，进样体积为5μl。质谱分析过程采用电喷雾离子源负离子模式进行检测；负离子模式下的质谱参数如下：毛细管电压为2000V，锥孔电压为40V，离子源温度为120℃，脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流量为800l/h，气帘气流量为50l/h，四级杆扫描范围m/z100-1500。明确该部分的分子量为1060。推测系常春藤皂苷连有两个五碳糖（木糖或***糖）和两个葡萄糖。分子式：C₅₂H₈₄O₂₂。

图19是木通皂苷E的超高效液相与四级杆串联飞行时间质谱仪分析图。

采用BRUKER AVANCEⅢ（400MHZ）核磁共振谱仪进行测定，流动相为吡啶，经比较，该化合物为木通皂苷E，即3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-α-L-吡喃***糖常春藤皂苷元-28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-吡喃葡萄糖。

图20是木通皂苷E的核磁共振碳谱图。

图21是木通皂苷E的碳谱数据。

图21中，13C NMR谱共显示52个碳信号，包括30个苷元碳信号。其中苷元碳信号与常春藤苷元基本一致。13C NMR谱中出现了4个糖信号，结合NMR数据和UPLC分析结果，证明其分别为L-***糖、D-木糖和2个D-葡萄糖。经过上述分析，并和公开的文献[马双成,陈德昌,赵淑杰.蓣知子的化学成分研究(Ⅳ).中草药,1995,26(3):122-124]中的数据进行比较，证明其结构为3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-α-L-吡喃***糖常春藤皂苷元-28-O-B-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-吡喃葡萄糖。

综上所述可见：1）木通皂苷E具有显著地诱导细胞发生严重的内质网应激的药效特征；而内质网是细胞内蛋白合成加工的场所，其发生应激会导致细胞严重的“消化不良”、机能锐减，程度严重者会直接诱导细胞凋亡或坏死；因此，可以木通皂苷E作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗抗肿瘤的药物制剂，通过诱导严重的内质网应激而抑制肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞的恶性增殖，具有药用价值；2）当木通皂苷E与其它治疗药物或化疗药物组合使用时，肿瘤细胞将会因内质网应激而使其耐药力下降，加速其凋亡或死亡，可以实现减量增效，降低药物的毒副作用，将会增加患者治疗机会和延长有效药物治疗的周期，具有广泛和重要的应用前景和开发价值；3）鉴于木通皂苷E具有选择性地诱导细胞严重的内质网应激，因此可作为实验用试剂，广泛用于细胞生物学和分子生物学的实验中。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种木通皂苷E的药物用途，其特征在于：以木通皂苷E作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备治疗抗肿瘤的药物制剂。

2.如权利要求1所述的木通皂苷E的药物用途，其特征在于：以木通皂苷E作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备包含通过诱导内质网应激途径治疗抗肿瘤的药物制剂。

3.如权利要求1或2所述的木通皂苷E的药物用途，其特征在于：所述的肿瘤至少包括肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌。

4.如权利要求1或2所述的木通皂苷E的药物用途，其特征在于：所述的木通皂苷E包括基于木通皂苷E结构构象特征的类似物和衍生物。

5.如权利要求1或2所述的木通皂苷E的药物用途，其特征在于：所述的木通皂苷E来源于化学合成或预知子籽的提取物。

6.如权利要求5所述的木通皂苷E的药物用途，其特征在于，由预知子籽提取获取木通皂苷E的方法，包括如下步骤：

a)用60vol%～95vol%的乙醇水溶液对预知子籽粉碎粗粉进行回流提取2～3次，收集提取液，过滤、减压回收乙醇，得到含木通皂苷E的预知子籽醇提物；

b)用去离子水稀释含木通皂苷E的预知子籽醇提物至目视溶液流动性好、无粘稠状态，然后依次用1:1体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2～3次，收集正丁醇萃取相，减压回收正丁醇，得到含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位；

c)将含木通皂苷E的预知子籽正丁醇萃取部位上D101大孔树脂吸附柱，依次用水～95vol%的乙醇水溶液进行梯度洗脱；取50vol%的乙醇水溶液的洗脱液，进行减压回收乙醇、干燥，得到含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位；

d)将含木通皂苷E的预知子籽大孔树脂吸附层析分离部位用甲醇溶解和硅胶粉拌样后，减压回收甲醇、干燥，上硅胶层析柱，用二氯甲烷与甲醇按体积含量为100%:0～0:100%进行梯度洗脱；取第3个洗脱部分，进行减压浓缩、干燥，得到含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位；

e)将含木通皂苷E的预知子籽硅胶柱吸附层析分离部位上ODS反相硅胶层析柱，用5vol%的甲醇水溶液～无水甲醇进行梯度洗脱；取第1个洗脱部分，进行减压回收甲醇、干燥，即得木通皂苷E。

Images