CN103792351A - 一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒，方法为革兰氏菌培养——用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原——制备标记羊抗人IgG的胶体金溶液——采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体的存在，从而判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。本发明的试剂盒，改变了传统的微生物检验的不足，将检测过程缩减到10min以内，并且大幅提高了检测的灵敏度和特异性，以满足快速检测革兰氏菌的需要。

Description

一种快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及快速检测革兰氏菌，尤其是获取的快速检测革兰氏菌的方法与试剂盒，具有显著的使用效果，方法极为精准与便捷。

背景技术

免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌，免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选，由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成，此技术对操作者要求也不高，是目前为止基层单位应用时间最长最为广泛的一项快速检测技术，其中免疫胶体金技术是极灵敏又快速的诊断方法之一。

革兰氏染色法能够把细菌分为两大类：凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌；染成红色的称为革兰氏阴性菌。在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全，假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细菌培养时间太长，已经有部分细菌发生死亡或者自溶，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

脉冲电场(pulsed electric field，PEF)是最近20年来发展起来的横跨生物电磁学、高电压和微电子等领域的新技术，已经被广泛应用。在场强高达kV/cm时，宽度在微秒到毫秒级的脉冲可以使细胞膜的脂质双分子层暂时重新排列，形成微孔，帮助许多平时不能通过细胞膜的亲水性大分子顺利通过；当取消脉冲电场后，微孔会关闭而不会对细胞造成任何影响，这种现象称为电穿孔，该技术通过超短脉冲的穿膜入核特性，避免了高温热效应引起的改变，有效保持了膜抗原的活性，因此达到低温灭活的效果。

目前有关检测革兰氏菌的方法已有诸多报道，其工艺方法主要有便携式革兰氏套装染片（专利申请号：201110226527.2，由浓缩的革兰氏染液、高渗透性滤纸、高吸水性海绵和四联排聚乙烯塑料袋制成）；革兰氏阳性菌的灭活（专利申请号：200680035823.1，所述方法包括暴露于可见光，且特别地在波长400-500nm范围内的光）；可提取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的核酸提取芯片（专利申请号：201310296807.X，基于硅珠法提取革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌核酸的核酸提取芯片）；鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法（专利申请号：201310412457.9，利用革兰氏阴性菌特异性表达L-丙氨酸氨基肽酶的性质，采用L-Alanine-AMC-TFA作为该酶的底物，利用环糊精阻滞产生的4-甲基香豆素的扩散，通过在平板上菌落产生的较强荧光区分革兰氏阴性菌和阳性菌）；***核酸提取方法（专利申请号：201210162646.0，提供一种破除***的细胞壁的试剂，由提取液A和提取液B组成；将Tris、EDTA、SDS、Tween80、TritonX-100、Brij58、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇和水混合，制得提取液A；所述提取液B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇和吡咯烷酮混合，制得提取液B）。

本发明提供的快速检测革兰氏菌的方法，克服了现有的革兰氏染色法经常出现假阳性和假阴性的检测结果的缺陷，将检测过程缩减到10分钟以内，并且大幅提高了检测的灵敏度和特异性，以满足快速检测革兰氏菌的需要；同时本发明提供的试剂盒，可操作性强，具有广阔的市场销售前景。

发明内容

本发明的目的在于：提供的快速检测革兰氏菌的方法及试剂盒，克服了现有的革兰氏染色法经常出现假阳性和假阴性的检测结果的缺陷。

本发明的目的是这样实现的：一种快速检测革兰氏菌的方法，分步实施；

第一步，革兰氏菌培养：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923和大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922分别接种于哥伦比亚血培养平板上，置于37℃、培养箱内培养12h后，收集菌落；

第二步，用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原；

第三步，将第二步提取两种抗原及质控血清点在制备好的硝酸纤维膜反应板上；

第四步，制备标记羊抗人IgG的胶体金溶液：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将浓度为0.01%的氯金酸（购自天津化学试剂厂）溶液，置微波炉中加热煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入0.23ml1%柠檬酸钠（购自天津化学试剂厂），继续煮沸10～20min，直至液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后用超纯水恢复到原体积，制成直径为0.22um左右的胶体金颗粒，用0.1M碳酸钾（购自天津化学试剂厂）溶液调节胶体金pH值至6.7，按2.5mg抗体/ml胶体金加入羊抗人IgG抗体（购自美国Sigma试剂公司）混匀，将羊抗人IgG抗体用上述直径为0.22um的胶体金颗粒标记得到。

第五步，采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体的存在，从而判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。

第二步具体包括：

1）制备革兰氏阳性菌膜抗原：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲电信号处理灭活,脉冲发生器由7组同轴电缆、高压电源及电极组成，匹配电阻为7Ω，电场20-30kv，灭活后超声裂解，在15000rpm下，离心15min，再经冷苯酚抽提，用CNB2层析柱层析获得，制备好后，储存在-80℃低温保存，备用；

2）制备革兰氏阴性菌膜抗原：将大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲电信号处理灭活,脉冲发生器由7组同轴电缆、高压电源及电极组成，匹配电阻为7Ω，电场20-30kv，灭活后超声裂解，在15000rpm下，离心15min，再经曲通114表面活性剂抽提，加温至72℃，经15000rpm下，离心15min，过滤，取上清液过sephadexG-200分子筛纯化获得，制备好后，储存在-80℃低温保存，备用；

所述的革兰氏阳性菌膜抗原是金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923磷壁酸抗原，分子量10-100kda；所述的革兰氏阴性菌膜抗原是大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922脂多糖抗原，分子量10-100kda。

第三步具体包括：

1）将硝酸纤维膜在10%的甲醇中浸泡10min后取出，裁剪成1cmx1cm方块，用清洁后镊子将膜安装在垫有吸水垫的PVC反应板的反应孔中，37℃烘烤2h，取出;

用移液器在硝酸纤维膜固定位置上分别点入革兰氏阳性菌膜抗原、革兰氏阴性菌膜抗原的2个检测点和1个点入30个正常的混合血清的质控点,点膜量1-10ul，革兰氏阳性菌膜抗原浓度0.7-2.2mg/ml，革兰氏阴性菌膜抗原浓度0.3-0.8mg/ml；点膜后37℃、烘烤1h，置4℃冷藏保存，备用；

2）所述的硝酸纤维膜上的2个检测点和1个质控点从左到右依次按照革兰氏阳性菌膜抗原检测点、正常血清质控点、革兰氏阴性菌膜抗原检测点的次序排列而成。

本发明提供的一种快速检测革兰氏菌的试剂盒，包括反应板、样本稀释液、洗涤液和金标抗体液；

反应板是将反应膜安装在垫有吸水垫的PVC底板的反应孔中制成；

样本稀释液：1mmol/L，pH8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温2025ul、明胶1ml，超纯水定容至100ml。

洗涤液：1mmol/L，pH8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温20500ul、Nacl2g，超纯水定容至100ml。

制备的标记羊抗人IgG抗体的胶体金溶液，羊抗人IgG浓度2.5mg/ml，胶体金颗粒直径0.22um；胶体金溶液pH6.7。

本发明方法的工艺为革兰氏菌培养→用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原→制备标记羊抗人IgG的胶体金溶液→采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体的存在，从而判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。本发明的试剂盒,改变了传统的微生物检验的不足，彰显技术进步。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述：

实施例

1、制备革兰氏阳性菌磷壁酸抗原

将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923（购自广东环凯微生物科技有限公司），37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲电信号处理灭活；脉冲发生器由7组同轴电缆、高压电源及电极组成，匹配电阻为7Ω，电场25kv，灭活后超声裂解，在15000rpm下，离心15min，再经冷苯酚抽提用CNB2层析柱（购自美国Sigma试剂公司）层析获得,制备好后，储存在-80℃低温保存备用。

2、制备革兰氏阴性菌脂多糖抗原

将大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922（购自广东环凯微生物科技有限公司），37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲电信号处理灭活,脉冲发生器由7组同轴电缆、高压电源及电极组成，匹配电阻为7Ω，电场25kv，灭活后超声裂解，在15000rpm下，离心15min，再经曲通114表面活性剂（购自美国Sigma试剂公司）抽提，加温至72℃，再在15000rpm下，离心15min，过滤，取上清液过sephadexG-200分子筛（购自美国Sigma试剂公司）纯化获得,制备好后，储存在-80℃低温保存备用。

3、反应板的制备

将硝酸纤维膜（购自英国Whatman公司）在10%的甲醇中浸泡10min后取出，裁剪成1cmx1cm的方块，用清洁后镊子将膜安装在垫有吸水垫（购自上海杰一生物技术有限公司）的PVC反应板（选用PVC原材料，经过注塑加工制成5cm*3cm的反应板，该反应板中间开有0.8cm*0.8cm反应孔）中，37℃烘烤2h，取出备用；

用移液器在硝酸纤维膜固定位置上按照从左到右的顺序分别点入革兰氏阳性菌磷壁酸抗原、30个混合血清、革兰氏阴性菌脂多糖抗原；点膜量10ul，革兰氏阳性菌磷壁酸抗原浓度1.4mg/ml，革兰氏阴性菌脂多糖抗原浓度0.5mg/ml；点膜后37℃烘烤1h，置4℃冷藏保存备用。

4、样本稀释液：1mmol/L，pH8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温2025ul、明胶1ml，超纯水定容至100ml。

5、洗涤液：洗涤液：1mmol/L，pH8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温20500ul、Nacl2g，超纯水定容至100ml。

6、金标抗体液的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，将浓度为0.01%的氯金酸（购自天津化学试剂厂）溶液，置微波炉中加热煮沸，按每100ml0.01%氯金酸加入0.23ml1%柠檬酸钠（购自天津化学试剂厂），继续煮沸10～20min，直至液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后用超纯水恢复到原体积，制成直径为0.22um左右的胶体金颗粒，用0.1M碳酸钾（购自天津化学试剂厂）溶液调节胶体金pH值至6.7，按2.5mg抗体/ml胶体金加入羊抗人IgG抗体（购自美国Sigma试剂公司）混匀，将羊抗人IgG抗体（购自美国Sigma试剂公司）用上述直径为0.22um的胶体金颗粒标记得到。

7、革兰氏菌快速检测试剂盒的包装（20份/盒）

1）样本稀释液5ml/瓶，一瓶；

2）洗涤液5ml/瓶，一瓶；

3）金标抗体液5ml/瓶，一瓶；

4）反应板，20份；

5）置于4℃冷藏保存、备用。

8、检测步骤操作：

1）取试剂盒中样本稀释液在1.5ml离心管滴入3滴，加入20ul血清标本，混匀；

2）取反应板一块，在反应板孔中加入50ul上述混匀的标本，待标本液全部渗透后，滴入洗涤液清洗3次，每次3滴。

3）滴入金标抗体液3滴，待其全部渗透后，滴3滴洗涤液清洗，判定结果。

9、结果判读：经肉眼观察，若反应板上左侧检测点和质控点出现***斑点，则判定细菌感染类型为革兰氏阳性菌；若反应板上右侧检测点和质控点出现***斑点，则判定细菌感染类型为革兰氏阴性菌；若质控点不显色，则判定为试剂盒无效。

本发明方法的验证，革兰氏阳性标本检出19例，检出率95%，革兰氏阴性菌检出18例，检出率90%；试剂盒能准确的检测出患者细菌感染类型，灵敏度高、特异性强，且整个检测时间缩减到10min以内。

Claims (4)

1.一种快速检测革兰氏菌的方法，其特征在于：分步实施；

1）革兰氏菌培养；

2）用纳秒脉冲对细菌进行低温灭活处理，提取革兰氏阳性菌磷壁酸抗原和革兰氏阴性菌脂多糖抗原；

其中制备革兰氏阳性菌膜抗原：将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲处理灭活后，超声裂解，在15000rpm条件下，离心15min，再经冷苯酚抽提用CNB2层析柱层析获得,制备好后，储存在-80℃低温保存，备用；

其中制备革兰氏阴性菌膜抗原：将大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922，37℃培养12h后收集菌落，经300ns的脉冲处理灭活后，超声裂解，在15000rpm条件下，离心15min，再经曲通114表面活性剂抽提，加温至72℃，再在15000rpm离心条件下，离心15min，过滤，取上清液过sephadexG-200分子筛纯化制得，制备好，储存在-80℃低温保存，备用；

3）将提取的两种抗原及质控血清点在制备好的硝酸纤维膜反应板上；

用移液器在硝酸纤维膜的固定位置上分别点入，革兰氏阴性菌膜抗原的2个检测点和1个点入30个正常的混合血清的质控点，点膜量1-10ul，革兰氏阳性菌膜抗原浓度0.7-2.2mg/ml，革兰氏阴性菌膜抗原浓度0.3-0.8mg/ml,点膜后37℃烘烤1h，置4℃冷藏保存，备用；

其中硝酸纤维膜经10%的甲醇浸泡10min,取出裁剪，将其安装在垫有吸水垫的PVC反应板的孔中，37℃烘烤2h后使用；

其中硝酸纤维膜上的2个检测点和1个质控点从左到右依次按照革兰氏阳性菌膜抗原检测点、正常血清质控点、革兰氏阴性菌膜抗原检测点的次序排列而成；

4）采用斑点免疫金渗滤技术检测抗体，判断样品是否含有磷壁酸抗体及脂多糖抗体。

2.一种快速检测革兰氏菌的试剂盒，其特征在于：试剂盒由反应板、样本稀释液、洗涤液和金标抗体液构成；

反应板:是将反应膜安装在垫有吸水垫的PVC底板的反应孔中制成；

样本稀释液：用1mmol/L，pH 8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温20 25ul、明胶 1ml，超纯水定容至100ml，制得；

洗涤液：用1mmol/L，pH 8.5的Tris-HCL缓冲液50ml、吐温20 500ul、Nacl 2g，超纯水定容至100ml，制得；

金标抗体液：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，胶体金颗粒直径0.22um；胶体金溶液pH 6.7、吸光值0.08-0.15，将胶体金标记羊抗人IgG抗体，羊抗人IgG浓度1-4mg/ml，制得金标抗体液。

3.依据权利要求1所述的方法，其特征在于：选用的革兰氏阳性菌膜抗原是金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923磷壁酸抗原，分子量10-100kda；选用的革兰氏阴性菌膜抗原是大肠埃希氏菌标准菌株ATCC25922脂多糖抗原，分子量10-100kda。

4.依据权利要求2所述试剂盒，其特征在于：选用的Tris-HCL、吐温20、羊抗人IgG均购自美国Sigma试剂公司。