CN103773867B

CN103773867B - 转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN103773867B
Application number: CN201410022074.5A
Authority: CN
Inventors: 李飞武; 闫伟; 龙丽坤; 李葱葱; 张明; 邢珍娟; 董立明
Original assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jilin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN103773867A

Abstract

本发明公开了一种转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由6条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1~6所示。检测试剂盒包括引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、阳性DNA对照和阴性DNA对照，试剂盒还可以含有显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化或直接观察反应管内沉淀的浊度变化等方法，判断样品是否含有cry2Ab基因成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，适合现场检测。

Description

转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因作物中cry2Ab基因的引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

根据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计，2012年全球转基因作物种植面积达到1.703亿公顷，比1996年增长了100倍，这一增速使得转基因技术成为现代农业史上应用最为迅速的作物技术。目前种植的转基因作物种类主要包括大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、番木瓜、甜菜、苜蓿等，目标性状主要为抗虫、抗除草剂或抗虫抗除草剂复合性状。已商业化的抗虫转基因作物的目的基因主要有cry1Ac、cry1Ab、cry1A.105、cry2Ab、cry3A、cry3Bb等，其中转cry2Ab基因作物包括转基因玉米MON89034、转基因棉花MON15985等，在抗虫转基因作物中所占的比例较大。

与转基因作物产业化的蓬勃发展相对应的，是社会公众对其安全性的持续担忧。为此，许多国家和地区制订了转基因生物标识管理制度，我国自2001年相继颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物标识管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》、《农业转基因生物加工审批办法》等一系列配套管理办法，对转基因生物进行全产业链监管，并对转基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5类17种转基因作物及其产品实施强制性标识管理制度。

转基因生物安全管理制度的执行必须依赖于转基因生物及其产品检测技术。目前转基因作物的检测技术主要分为两大类：一类以转入的外源DNA为检测对象，如PCR、Southern杂交、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、Western杂交、免疫试纸条等。其中PCR方法应用最为广泛，可细分为定性PCR、复合PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR等。然而，由于PCR方法需要PCR仪等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3～4h)，很难实现现场检测，因此，实际工作中还需要一种便捷、准确、且适用于现场操作的转基因作物检测新技术。

LAMP技术是由日本荣研化学株式会社于2000年开发的一种新的基因扩增方法，该方法的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件(60～65℃)进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。

LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因作物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因作物中cry2Ab基因的检测方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于公开一种转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组。

本发明的另一个目的在于公开一种转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，以便于对cry2Ab基因进行LAMP检测。

本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测方法，其具有特异性强、灵敏度高、操作简便、结果可靠等特点。

本发明所采用的技术方案如下：

根据cry2Ab基因的核苷酸序列，设计合成cry2Ab基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性、灵敏度进行验证。

一种cry2Ab基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物1、环引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：ACTGTTCCTC AACCGCTTG(SEQ ID NO：1)；

外引物2：GGAGTAGTCC CTGGTGTAGT(SEQ ID NO：2)；

内引物1：AGGAGAGGTG CAGGTTGGCA CTCAGTTCCA GATGCAAGGC(SEQ ID NO：3)；

内引物2：GACGTGATCC TCAACGCTGA CGTCTTCAGG TAGTCGCGGT AG(SEQ IDNO：4)；

环引物1：CTGAGCAAAG AGTGGCAGCA(SEQ ID NO：5)；

环引物2：GGGCATCTCT GCAGCCA(SEQ ID NO：6)。

转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

(1)引物溶液：由内引物1、内引物2、外引物1、外引物2、环引物1、环引物2等6条引物配制的混合溶液，引物的浓度依次为4～6μmol/L、4～6μmol/L、32～48μmol/L、32～48μmol/L、16～24μmol/L、16～24μmol/L；

(2)具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7～9U/μL；

(3)10×反应缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，20～80mmol/L MgSO₄，6～14mol/L甜菜碱；

(4)dNTPs溶液：由浓度分别为10mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

(5)阳性DNA对照样品：转cry2Ab基因作物的基因组DNA，或含有cry2Ab基因的大肠杆菌质粒DNA；

(6)阴性DNA对照样品：不含cry2Ab基因序列的DNA。

优选的，所述的引物溶液中含有5μmol/L外引物1、5μmol/L外引物2、40μmol/L内引物1、40μmol/L内引物1、20μmol/L环引物1、20μmol/L环引物2。

优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μL。

优选的，所述的10×反应缓冲液中MgSO₄、甜菜碱的浓度分别为40mmol/L、8mol/L。

本发明的cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为SYBR GREEN I荧光染料。

利用以上所述的试剂盒检测cry2Ab基因的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA：按常规CTAB方法或植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；

(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL PCR反应管内加入DNA模板2～5μL、引物溶液1μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液4μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(3)配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将DNA模板分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤(2)一致；

(4)运行LAMP扩增反应：63～65℃孵育30～60min，80℃孵育5min终止反应；

(5)LAMP扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果、或取1～5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

在试剂盒中含有显色剂的情况下，在步骤(4)后获得的LAMP扩增产物中加入1～2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。

通过实验证明，本发明提供的cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等优点。

附图说明

图1为实施例1的LAMP检测结果图，P为阳性对照样品，N为阴性对照样品，1、2为待测样品。

图2为实施例2的LAMP检测结果图，P为阳性对照样品，N为阴性对照样品，1、2为待测样品。

图3和图4是实施例3中进行特异性检测的结果图，1～14依次为转基因玉米MON89034、MON810、Bt11、Bt176，转基因棉花MON531、MON15985，转基因水稻KF-6、TT51-1，转基因玉米MON863、MON88017、MIR604、TC1507、59122，非转基因玉米阴性对照，M为DNA分子量Marker。

图5和图6是实施例4中进行灵敏度检测的结果图，1～6依次为转基因玉米MON89034基因组DNA的拷贝数浓度分别为10000copy/μL、1000copy/μL、100copy/μL、10copy/μL、5copy/μL、1copy/μL的测试样品，7为非转基因玉米阴性对照，M为DNA分子量Marker。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1不含显色剂的试剂盒及其检测方法。

按下列配方制备cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒：

(1)引物溶液：合成外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物1和环引物2，将引物干粉用灭菌去离子水分别配成浓度为200μmol/L的母液，然后取外引物1、外引物2各5μL，内引物1、内引物2各40μL，环引物1、环引物2各20μL，灭菌去离子水70μL，充分混匀配成200μL的cry2Ab基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：

外引物1：ACTGTTCCTCAACCGCTTG(SEQ ID NO：1)；

外引物2：GGAGTAGTCCCTGGTGTAGT(SEQ ID NO：2)；

内引物1：AGGAGAGGTGCAGGTTGGCA-CTCAGTTCCAGATGCAAGGC(SEQ ID NO：3)；

内引物2：GACGTGATCCTCAACGCTGACG-TCTTCAGGTAGTCGCGGTAG(SEQ IDNO：4)；

环引物1：CTGAGCAAAGAGTGGCAGCA(SEQ ID NO：5)；

环引物2：GGGCATCTCTGCAGCCA(SEQ ID NO：6)；

(2)Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μL；

(3)10×反应缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，100mmol/L KCl，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，40mmol/L MgSO₄，8mol/L甜菜碱；

(6)阴性DNA对照样品：不含cry2Ab基因序列的DNA。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

(1)提取待测样品的基因组DNA：采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA；

(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200μL PCR反应管内加入DNA模板5μL、引物溶液1μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs溶液4μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

(4)将反应管放置在浊度仪中，运行LAMP扩增反应：63℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；

(5)LAMP扩增结果的鉴定：利用实时浊度仪(日本荣研公司)观察反应管内沉淀的浊度变化(实时扩增曲线)来判断扩增结果。

本实施例中，阳性对照有沉淀产生(出现典型扩增曲线)，阴性对照无沉淀产生(无典型扩增曲线)；待测样品1的反应管出现沉淀，表明待测样品1中含有cry2Ab基因成分；待测样品2的反应管未出现沉淀，表明待测样品2中不含有转cry2Ab基因作物成分。

实施例2含显色剂的试剂盒及其检测方法。

按下列配方制备cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒：

外引物1：ACTGTTCCTCAACCGCTTG(SEQ ID NO：1)；

外引物2：GGAGTAGTCCCTGGTGTAGT(SEQ ID NO：2)；

内引物1：AGGAGAGGTGCAGGTTGGCA-CTCAGTTCCAGATGCAAGGC(SEQ ID NO：3)；

内引物2：GACGTGATCCTCAACGCTGACG-TCTTCAGGTAGTCGCGGTAG(SEQ IDNO：4)；

环引物1：CTGAGCAAAGAGTGGCAGCA(SEQ ID NO：5)；

环引物2：GGGCATCTCTGCAGCCA(SEQ ID NO：6)；

(2)Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μL；

(6)阴性DNA对照样品：不含cry2Ab基因序列的DNA；

(7)显色剂：1000×SYBR GREEN I荧光染料。

用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：

(4)将反应管放置在恒温水浴锅中，运行LAMP扩增反应：63℃孵育60min，80℃孵育5min终止反应；

(5)LAMP扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入2μL的显色剂，混匀，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。

本实施例中，阳性对照显现绿色，阴性对照显现橙色；待测样品1的反应管显现绿色，表明待测样品1中含有cry2Ab基因成分；待测样品2的反应管显现橙色，表明待测样品2中不含有cry2Ab基因成分。

实施例3试剂盒及检测方法的特异性实验。

对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品包括：转cry1A.105和cry2Ab基因玉米MON89034、转cry1Ab基因玉米MON810、Bt11、Bt176、转cry1Ac基因棉花MON531、转cry1Ac和cry2Ab基因棉花MON15985、转cry1Ab基因水稻KF-6、转cry1Ab/Ac基因水稻TT51-1、转cry3Bb基因玉米MON863、MON88017、转cry3A玉米MIR604、转cry1F玉米TC1507、转cry34Ab和cry35Ab基因玉米59122等13种抗虫转基因作物，以及非转基因作物。

本实施例中，仅含有cry2Ab基因的转基因玉米MON89034和转基因棉花MON15985的LAMP扩增产物出现典型扩增曲线，而其他转基因作物均为出现典型扩增曲线，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对转基因作物中的cry2Ab基因具有很好的特异性。

以本发明所述的外引物1和外引物2，对上述测试样品进行定性PCR检测。

PCR检测反应体系为：1×PCR缓冲液(大连宝生物公司)、0.2mmol/L dNTPs(大连宝生物公司)、0.2μmol/L外引物1、0.2μmol/L外引物2、0.75U Taq DNA聚合酶(大连宝生物公司)、100ng模板DNA，用灭菌去离子水补齐到25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸7min。PCR结束后，取10μL扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，PCR检测结果与本发明所述的LAMP方法结果相一致。

实施例4试剂盒及检测方法的灵敏度实验。

对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的灵敏度进行实验，测试样品由转基因玉米MON89034(含cry2Ab基因)的基因组DNA以灭菌去离子水梯度稀释而成，测试样品中MON89034玉米基因组DNA的拷贝数浓度分别为10000copy/μL、1000copy/μL、100copy/μL、10copy/μL、5copy/μL、1copy/μL。

本实施例中，10000copy/μL、1000copy/μL、100copy/μL、10copy/μL、5copy/μL、1copy/μL的测试样品反应管中均出现典型扩增曲线，而阴性对照无典型扩增曲线，表明本发明所述试剂盒及其检测方法的检测极限可达5个拷贝。

以本发明所述的外引物1和外引物2，按实施例3所述的方法，对上述测试样品进行定性PCR检验。

本实施例中，10000copy/μL、1000copy/μL、100copy/μL、10copy/μL、5copy/μL的测试样品的PCR扩增产物出现典型电泳条带，而1copy/μL、阴性对照均无典型电泳条带，表明PCR方法的检测极限为25个拷贝。

两种方法的比较结果显示，本发明的试剂盒及其检测方法的检测灵敏度可以达到5个拷贝，而PCR方法的检测灵敏度为25个拷贝；经比对，本发明的试剂盒及检测方法的灵敏度明显高于PCR方法，可检测出更低含量的样品。

应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 吉林省农业科学院

<120> 转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

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<160> 6

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cry2Ab基因的LAMP检测外引物1

<400> 1

actgttcctc aaccgcttg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cry2Ab基因的LAMP检测外引物2

<400> 2

ggagtagtcc ctggtgtagt 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cry2Ab基因的LAMP检测内引物1

<400> 3

aggagaggtg caggttggca ctcagttcca gatgcaaggc 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cry2Ab基因的LAMP检测内引物2

<400> 4

gacgtgatcc tcaacgctga cgtcttcagg tagtcgcggt ag 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cry2Ab基因的LAMP检测环引物1

<400> 5

ctgagcaaag agtggcagca 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cry2Ab基因的LAMP检测环引物2

<400> 6

gggcatctct gcagcca 17

Claims

1.转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2、环引物1和环引物2，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物1：ACTGTTCCTCAACCGCTTG（SEQ ID NO：1）；

外引物2：GGAGTAGTCCCTGGTGTAGT（SEQ ID NO：2）；

内引物1：AGGAGAGGTGCAGGTTGGCA-CTCAGTTCCAGATGCAAGGC（SEQ ID NO：3）；

内引物2：GACGTGATCCTCAACGCTGACG-TCTTCAGGTAGTCGCGGTAG（SEQ ID NO：4）；

环引物1：CTGAGCAAAGAGTGGCAGCA（SEQ ID NO：5）；

环引物2：GGGCATCTCTGCAGCCA（SEQ ID NO：6）。

2.转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：

（1）引物溶液：由权利要求1所述的6条引物配制的混合溶液，引物的浓度依次为5 μmol/L、5 μmol/L、40 μmol/L、40 μmol/L、20 μmol/L、20 μmol/L；

（2）Bst DNA聚合酶：浓度为8 U/μL；

（3）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH₄)₂SO₄，40 mmol/L MgSO₄，8 mol/L甜菜碱；

（4）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

（5）阳性DNA对照样品，转cry2Ab基因作物的基因组DNA，或含有cry2Ab基因的大肠杆菌质粒DNA；

（6）阴性DNA对照样品：不含cry2Ab基因序列的DNA；

（7）显色剂：1000×SYBR GREEN I荧光染料。

3.利用权利要求2所述的试剂盒检测转基因作物中cry2Ab基因的方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入DNA模板2~5 μL、引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液4 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；

（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将DNA模板分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；

（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；

（5）LAMP扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果；或取1~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；或在反应管中加入1~2 μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。