CN103768038A - 丝素蛋白单组分微囊、丝素蛋白-纳米金杂化微囊及其制备方法 - Google Patents

Abstract

发明公开了丝素蛋白单组分微囊、丝素蛋白-纳米金杂化微囊及其制备方法，丝素蛋白单组分微囊的制备步骤为：将丝素蛋白、聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒和碳酸盐缓冲液混合得混合液；滴加蛋白的不良溶剂混合，蛋白交联，加入丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液用于去除聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液；再以DNA功能化的纳米金对丝素蛋白单组分微囊进行修饰得到丝素蛋白-纳米金杂化微囊，它是一种中空微囊，既可负载生物大分子类药物，同时纳米金修饰赋予其远程释放调控及拉曼增强特性。制备工艺简单、重现性好，普适性强，适合于规模化生产，而且所用材料具有良好的生物相容性、可降解、无免疫原性，廉价易得。

Description

丝素蛋白单组分微囊、丝素蛋白-纳米金杂化微囊及其制备方法

技术领域

本发明属于药物载体领域，具体地涉及一种丝素蛋白单组分微囊及其制备方法，一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊及其制备方法

背景技术

在药物传递***（drug delivery systems）中，中空结构的有机或无机载体由于其特殊的包封、保护以及传递特性而受到了广泛关注。目前，常见的中空微/纳米粒子主要包括聚电解质微囊、聚合物空心微/纳米球、脂质体、碳管及硅基微粒等，其制备方法也各不相同。其中，层层自组装（Layer-by-layer,LBL）技术由于其简便易行、适用性强等优势而在中空微囊制备中备受重视。然而，LBL法在制备医用中空微囊时也具有其自身的不足，如荷正电的聚电解质引入的潜在生物毒性；无机模板去除时常须使用强腐蚀性酸如氢氟酸、盐酸等；不可降解聚合物如聚苯乙烯球模板的残留等。基于上述不足，2011年，Tsukruk小组利用蛋白变性原理，制备了单组份LBL丝素蛋白微囊，通过控制丝素蛋白沉积的层数调控微囊通透性，避免了荷正电聚电解质带来的生物毒性（Shchepelina,O.;Drachuk,I.;Gupta,M.K.;Lin,J.;Tsukruk,V.V.,Adv.Mater.2011,23,4655-4660.）。而基于聚乳酸（PLA）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球模板的LBL微囊无疑克服了无机酸苛刻的模板去除条件，同时由于PLA和PLGA良好的生物相容性也解决了模板残留问题（Shenoy,D.B.;Antipov,A.A.;Sukhorukov G.B.;H.Biomacromolecules2003,4,265-272.）。但是，LBL法仍无法克服其操作费时及产量随壳层层数的增加而减少的难题，大大限制了传统LBL法实际工业应用价值（Richardson,J.J.;Liang,K.;Kempe,K.;Ejima,H.;Cui,J.;Caruso,F.Adv.Mater.2013,25,6874-6878.Zhu,Y.;Tong,W.;Gao,C.;Mohwald,H.J.Mater.Chem.2008,18,1153-1158）。因而，一步法合成聚电解质微囊得到了初步探索，如以介孔氧化硅或MnCO₃微粒为模板合成聚合物或天然蛋白单组分微囊，并通过条件优化调控了微囊的通透性。（Wang,Y.;Bansal,V.;Zelikin,A.N.;Caruso,F.,Nano Lett.2008,8,1741-1745.Zhu,Y.;Tong,W.;Gao,C.;Mohwald,H.,J.Mater.Chem.2008,18,1153-1158.）。然而，将方法温和简便普适性、模板生物相容性、微囊通透性以及多功能性集于一体的微囊类纳米器件及其制备方法还未见报道。

PLGA是一种具有良好生物相容性和生物降解性的医用高分子材料，经美国FDA批准可用作医用手术缝合线、微胶囊、微球等器械和药用辅料。PLGA在体内中间产物是乳酸，是人机体正常的代谢产物，不会在重要器官聚集，最终代谢产物是CO₂和H₂O。以PLGA微粒作为微囊制备的模板，不仅可解决模板残留问题，而且去除PLGA模板的过程也相对简便温和。丝素蛋白具有卓越的机械强度、良好的生物相容性以及可加工性并且不易引发炎症反应，是药物载体的理想材料。金是极其惰性的材料，金纳米粒子理化性质稳定、环境友好、生物相容性好、半数致死量高，并具有优异的光学性质，通过物理吸附或-SH、-S-SH、-NH₂等共价键合可稳定地固定多种生物分子，如核酸、抗体及药物等，并保持其生物活性。

因此，以PLGA微粒为模板，利用去溶剂法一步合成丝素蛋白单组份微囊，进而利用DNA功能化的纳米金进行微囊表面修饰，在调控其通透性的同时赋予微囊无机纳米粒子引入的特殊光学性质以及DNA的多种生物学功能，使该类杂化微囊兼具药物传递及诊断的功能还未见报道。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种丝素蛋白单组分微囊。

本发明的第二个目的是提供一种丝素蛋白单组分微囊的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊。

本发明的第四个目的是提供一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊的制备方法。

本发明的第五个目的是提供一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种丝素蛋白单组分微囊的制备方法，包括的步骤：

将丝素蛋白、分子量为5000-50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒和pH=9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液，使混合液中丝素蛋白的浓度为2-5mg/mL、使所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的浓度为1×10⁸-3×10⁸个/mL；向混合液中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，得到第一种微粒，向第一种微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到第二种微粒；向水洗后的第二种微粒中加入体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液混合，用于去除聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液。

蛋白的不良溶剂优选甲醇或乙醇。

上述方法制备的丝素蛋白单组分微囊。

一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊的制备方法，包括如下步骤：

1）将丝素蛋白、分子量为5000-50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒和pH=9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液，使混合液中丝素蛋白的浓度为2-5mg/mL、使所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的浓度为1×10⁸-3×10⁸个/mL；向混合液中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，得到第一种微粒，向第一种微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到第二种微粒；向水洗后的第二种微粒中加入体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液混合，用于去除聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液；

2）按丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米粒子的摩尔比为1:10000-100000的比例，将丝素蛋白单组分微囊悬液与DNA功能化的金纳米粒子胶体溶液混合均匀，孵育，得到丝素蛋白-纳米金杂化微囊，所述DNA为端部修饰有一个巯基的5-100个碱基的序列；

蛋白的不良溶剂优选为甲醇或乙醇。

上述方法制备的一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊。

一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备丝素蛋白-纳米金载药杂化微囊中的应用，药优选为蛋白或多糖。

一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备拉曼成像造影剂中的应用。

本发明的丝素蛋白-纳米金杂化微囊是一种中空微囊，既可负载生物大分子类药物，同时纳米金修饰赋予其远程释放调控及拉曼增强特性。丝素蛋白单组分微囊及丝素蛋白-纳米金杂化微囊制备工艺简单、重现性好，普适性强，适合于规模化生产，而且所用材料具有良好的生物相容性、可降解、无免疫原性，廉价易得。

附图说明

图1A，B和C分别为实施例2制备的PLGA微粒（分子量5万）、实施例5制得的丝素蛋白包被的PLGA微粒以及丝素蛋白单组分微囊的扫描电镜照片，D为丝素蛋白单组分微囊的透射电镜照片。

图2为实施例2制备PLGA微粒（分子量1.5万）。

图3A，B分别为实施例6制得的丝素蛋白包被的PLGA微粒以及丝素蛋白单组分微囊的扫描电镜照片。

图4DNA功能化金纳米球（A）、金纳米棒（C）以及金纳米棒和球（E）修饰的丝素蛋白单组分微囊的透射电镜照片；B、D、F为A、C、E对应的扫描电镜照片。

图5杂化微囊的表面增强拉曼图谱。实线为聚焦在微囊上采集的拉曼信号，虚线为聚焦在微囊周围溶液中采集的拉曼信号。

图6负载FITC-BSA（A）以及FITC-dextran250kDa（B）的杂化微囊激光共聚焦照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1丝素蛋白水溶液的制备：

丝素粉购于：湖州新天丝生物技术有限公司,取1g丝素粉，置于5mL LiBr（9.3M）溶液中，60℃缓慢磁力搅拌4h，产生20%的溶液，将所得溶液转入透析袋（MWCO3500），蒸馏水透析3-4d（每4h换水一次），除去盐，所得溶液8,000rpm离心20min，重复3次，除去不溶物，再将所得溶液过0.45μm滤膜。最终得到的丝素蛋白水溶液浓度约为6%，浓度测定是通过测定一定体积丝素蛋白水溶液冻干后重量计算所得。储存液存放于4℃备用。

实施例2PLGA微球的制备：

采用经典的乳液-溶剂挥发法制备PLGA微球：

1)将150mg的PLGA（50:50，分子量5万）溶解于10mL二氯甲烷中，逐滴滴入至100mL浓度为1%的聚乙烯醇中，高速匀质形成乳液，转移至磁力搅拌器上继续搅拌18h，使二氯甲烷挥发完全，10,000rpm离心15min，加水超声重分散，重复此过程三次，冻干，低温储存(图1A)。

2）将150mg的PLGA（50:50，分子量1.5万）溶解于10mL二氯甲烷中，逐滴滴入至100mL浓度为1%的聚乙烯醇中，高速匀质形成乳液，转移至磁力搅拌器上继续搅拌18h，以挥发二氯甲烷，10,000rpm离心15min，加水超声重分散，重复此过程三次，冻干，低温储存（图2）。

实施例3DNA功能化的金纳米球的制备：

采用经典的柠檬酸三钠还原法制备球形纳米金颗粒（AuNSs），将20mL的质量浓度为0.01%的氯金酸水溶液加至圆底烧瓶中，油浴锅中搅拌加热至回流，加入1mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌15min，冷却至室温，得到金纳米球的胶体溶液。

按金纳米球与巯基化DNA（巯基化寡核苷酸5'HS-C6-TTTTT）的摩尔比为1：10000的比例，将金纳米球的胶体溶液与巯基化DNA的水溶液混合40h，离心，向沉淀中加水，得到DNA功能化的金纳米球胶体溶液。

实施例4DNA功能化的金纳米棒的制备：

1）采用经典的种子生长法合成金纳米棒（AuNRs）。实验步骤如下：

a）制备金种子溶液：

将0.25mL浓度为0.01mol/L的HAuCl₄水溶液与7.5mL浓度0.1mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）水溶液均匀混合得混合液，将0.6mL新鲜制备的浓度0.01mol/L的NaBH₄水溶液在磁力搅拌条件下加入混合液中，继续搅拌2min后，静置2h，即得金种子溶液；

b）制备金纳米棒生长液：

取一烧杯，依次加入9.5mL浓度为0.1mol/L CTAB水溶液，0.4mL浓度为0.01mol/L的HAuCl₄水溶液，0.06mL新鲜制备的浓度为0.01mol/L的AgNO₃水溶液，充分混合；加入0.064mL新鲜制备的浓度为0.1mol/L的抗坏血酸水溶液搅拌，直至溶液从淡黄色转为无色透明，即得金纳米棒生长液；

c）制备金纳米棒：

将0.04mL步骤a）制得的金种子溶液加至步骤b）制得的金纳米棒生长液中，以诱发金纳米棒的生长，缓慢搅拌直至溶液颜色转为淡紫色，静置9h，保持恒温28℃得金纳米棒胶体溶液；

3）按金纳米棒与巯基化DNA（巯基化寡核苷酸5'HS-C6-TTTTT）的摩尔比为1：1000的比例，将金纳米棒的胶体溶液与巯基化DNA的水溶液混合40h，离心，除去含有未结合的巯基化DNA的液体，沉淀为DNA功能化的金纳米棒（AuNRs-T5）；

实验表明，端部修饰有一个巯基的5-100个碱基的DNA序列都适用于本发明。

实施例5

一种丝素蛋白单组分微囊的制备方法，包括的步骤：

将丝素蛋白、粒径为2.4μm、分子量为50000聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒（图1A）和pH=9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液混合得混合液，使混合液中丝素蛋白的浓度为2mg/mL、使聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的浓度为1×10⁸个/mL；向混合液中滴加无水乙醇混合，混合液与无水乙醇的体积比为1:6；离心，除去上清液，得到第一种微粒，向第一种微粒中加入刚刚除去的上清液的体积的1倍的质量浓度为2%的戊二醛水溶液用于交联蛋白，搅拌1h，离心，水洗，得到第二种微粒（图1B）；向水洗后的第二种微粒中加入体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液混合16h用于除去聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液。

图1C、D是电子显微镜观察的到的将丝素蛋白单组分微囊悬液干燥后得到的丝素蛋白单组分微囊。

本实验利用丝素蛋白与PLGA的疏水相互作用（Wang,X.;Wenk,E.;Hu,X.;Castro,G.R.;Meinel,L.;Wang,X.;Li,C.;Merkle,H.;Kaplan,D.L.,Biomaterials2007,28(28),4161-4169）将析出的丝素蛋白沉积于PLGA微球表面，再将其交联固化，使之不再解聚，溶解模板最终形成丝素蛋白单组分微囊，因此其他尺度的PLGA微球例如：在分子量为5000-50000的任意微粒同样可以作为模板制备不同尺寸的丝素蛋白单组分微囊。

实施例6

一种丝素蛋白单组分微囊的制备方法，包括的步骤：

将丝素蛋白、粒径为2.4μm、分子量为50000聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒（图1A）和pH=11的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液混合得混合液，使混合液中丝素蛋白的浓度为5mg/mL、使聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的浓度为3×10⁸个/mL；向混合液中滴加无水乙醇混合，混合液与无水乙醇的体积比为1:10；离心，除去上清液，得到第一种微粒，向第一种微粒中加入刚刚除去的上清液的同体积的质量浓度为2%的戊二醛水溶液，搅拌1h，离心，水洗，得到第二种微粒（图3A）；向第二种微粒中加入体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液混合16h，用于去除聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液，滴于硅片干燥后，扫描电子显微镜观察（图3B）。

实验证明，蛋白的不良溶剂选用甲醇或异丙醇也可以用于本发明。

实施例7

一种丝素蛋白-金纳米球杂化微囊的制备方法，包括的步骤：

1）丝素蛋白单组分微囊悬液制备同实施例5；

2）按丝素蛋白单组分微囊与实施例3制备的DNA功能化的金纳米球的摩尔比为1:60000的比例，将丝素蛋白单组分微囊悬液与DNA功能化的金纳米球胶体溶液混合均匀，孵育4h，得到丝素蛋白-金纳米球杂化微囊（图4A，B）。

PLGA微球仅作为模板影响丝素蛋白微囊的尺寸，而不改变微囊的物理化学性质。因此，其他尺度的丝素蛋白单组分微囊也可通过此过程产生相应的丝素蛋白-金纳米球杂化微囊。

实施例8

一种丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊的制备方法，包括的步骤：

1）丝素蛋白单组分微囊制备同实施例5；

2）按丝素蛋白单组分微囊与实施例4制备的DNA功能化的金纳米棒的摩尔比为1:60000的比例，将丝素蛋白单组分微囊悬液与DNA功能化的金纳米棒胶体溶液混合均匀，孵育4h，得到丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊（图4C，D）。

丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米棒的摩尔比还可以在1:10000-100000的范围内选择例如：1:10000，1:20000，1:50000，1:80000，1:100000等，其目的是让DNA功能化的金纳米棒对丝素蛋白单组分微囊进行封堵，以调节其通透性，以便于制备丝素蛋白-纳米金载药杂化微囊。

单组分微囊经金纳米棒修饰得到杂化微囊后，zeta-电位由-9.44±2.67mV变为-4.22±0.62mV表明金纳米棒与丝素之间通过静电作用以及氢键结合，与此前的工作以及其他研究者工作一致(Zhimin Zhou,A.C.Anselmo and S.Mitragotri,Adv.Mater.,2013,25,2723-2727,V.Kozlovskaya,E.Kharlampieva,I.Drachuk,D.Cheng and V.V.Tsukruk,Soft Matter2010,6,3596-9608.)，PLGA微球仅作为模板影响丝素蛋白微囊的尺寸，而不改变微囊的物理化学性质。因此，其他尺度的丝素蛋白单组分微囊也可通过此过程产生相应的丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊。

实施例9

一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备拉曼成像造影剂中的应用

将实施例8制备的丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊制成含有5μM结晶紫的悬液，激发波长633nm，采集拉曼信号（图5）。

实施例10

一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备丝素蛋白-纳米金载药（蛋白药）杂化微囊中的应用

1）丝素蛋白单组分微囊制备同实施例5；

2）DNA功能化的金纳米棒的制备同实施例4；

3）将丝素蛋白单组分微囊与质量浓度为2mg/mL的FITC标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）混合得混合液，30min后将混合液与DNA功能化的金纳米棒按丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米棒的摩尔比为1:60000的比例混合，孵育4h，离心水洗得到包载模型药物的丝素蛋白-纳米金载药杂化微囊（图6A）。

由于本领域公知，模型药物牛血清白蛋白是蛋白的代表，牛血清白蛋白能包载于丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊中，因此，其它蛋白的药物也能包载于丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊中。实施例11

一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备丝素蛋白-纳米金载药（多糖药）杂化微囊中的应用

1）丝素蛋白单组分微囊制备同实施例5；

2）DNA功能化的金纳米棒的制备同实施例4；

3）将丝素蛋白单组分微囊与分子量为250kDa的质量浓度为2mg/mL的FITC标记的葡聚糖（FITC-dextran）混合得混合液，30min后将混合液与DNA功能化的金纳米棒按丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米棒的摩尔比为1:60000的比例混合，孵育4h，离心水洗得到包载模型药物的丝素蛋白-纳米金载药杂化微囊（图6B）。

由于本领域公知，模型药物葡聚糖是多糖的代表，葡聚糖能包载于丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊中，因此，其它多糖也能包载于丝素蛋白-金纳米棒杂化微囊中。

实施例12

一种丝素蛋白-金纳米棒和球杂化微囊的制备方法，包括的步骤：

1）丝素蛋白单组分微囊制备同实施例5；

2）DNA功能化的金纳米球的制备同实施例3；

3）DNA功能化的金纳米棒的制备同实施例4；

4）按丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米棒的摩尔比为1:60000的比例，将丝素蛋白单组分微囊悬液与DNA功能化的金纳米棒胶体溶液混合均匀，孵育4h，混合液再与DNA功能化的金纳米球按丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米球的摩尔比为1:60000的比例，混合，孵育4h，得到丝素蛋白-金纳米棒和球杂化微囊（图4E，F）。

PLGA微球仅作为模板影响丝素蛋白微囊的尺寸，而不改变微囊的物理化学性质。因此，其他尺度的丝素蛋白单组分微囊也可通过此过程产生相应的丝素蛋白-金纳米棒和球杂化微囊。

Claims (8)

1.一种丝素蛋白单组分微囊的制备方法，其特征在于包括的步骤： 

将丝素蛋白、分子量为5000-50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒和pH=9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液，使混合液中丝素蛋白的浓度为2-5mg/mL、使所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的浓度为1×10⁸-3×10⁸个/mL；向混合液中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，得到第一种微粒，向第一种微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到第二种微粒；向水洗后的第二种微粒中加入体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液混合，用于去除聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液。 

2.根据权利要求1所述的一种丝素蛋白单组分微囊的制备方法，其特征是所述蛋白的不良溶剂为甲醇或乙醇。 

3.权利要求1或2的方法制备的丝素蛋白单组分微囊。 

4.一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊的制备方法，其特征是包括如下步骤： 

1）将丝素蛋白、分子量为5000-50000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒和pH=9-11的碳酸盐缓冲液混合得混合液，使混合液中丝素蛋白的浓度为2-5mg/mL、使所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物微粒的浓度为1×10⁸-3×10⁸个/mL；向混合液中滴加蛋白的不良溶剂混合，所述混合液与蛋白的不良溶剂的体积比为1:6-10；离心，除去上清液，得到第一种微粒，向第一种微粒中加入戊二醛水溶液进行蛋白交联，离心，水洗，得到第二种微粒；向水洗后的第二种微粒中加入体积比为1:1的丙酮和N-甲基吡咯烷酮混合液混合，用于去除聚乳酸-羟基乙酸共聚物，水洗得到丝素蛋白单组分微囊悬液； 

2）按丝素蛋白单组分微囊与DNA功能化的金纳米粒子的摩尔比为1:10000-100000的比例，将丝素蛋白单组分微囊悬液与DNA功能化的金纳米粒子胶体溶液混合均匀，孵育，得到丝素蛋白-纳米金杂化微囊，所述DNA为端部修饰有一个巯基的5-100个碱基的序列。

5.根据权利要求4所述的一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊的制备方法，其特征是所述蛋白的不良溶剂为甲醇或乙醇。 

6.权利要求4或5的方法制备的一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊。 

7.权利要求6的一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备丝素蛋白-纳米金载药杂化微囊中的应用，所述药为蛋白或多糖。 

8.权利要求6的一种丝素蛋白-纳米金杂化微囊在制备拉曼成像造影剂中的应用。 

Images