CN103743902A - 检测沉默gpc-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法 - Google Patents

检测沉默gpc-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法 Download PDF

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CN103743902A CN201310601573.5A CN201310601573A CN103743902A CN 103743902 A CN103743902 A CN 103743902A CN 201310601573 A CN201310601573 A CN 201310601573A CN 103743902 A CN103743902 A CN 103743902A
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陈洁
姚敏
王理
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells

Abstract

本发明公开了一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法。通过1）针对靶基因共有序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,再合成相应dsDNA，将dsDNA***载体构建4种重组质粒，并通过荧光定量PCR挑选出干扰效率最高的一种重组质粒；2）将上述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞，并对其进行筛选，得到稳定转染HepG2细胞;3）将上述稳定转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型；4）而后测定上述稳定转染HepG2细胞在人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型中生长情况。通过以上方法来检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力，可以用于GPC-3对移植瘤的研究。

Description

检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法
技术领域
本发明涉及GPC-3相关基因技术，特别涉及一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法。
背景技术
磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)作为一种细胞表面蛋白，在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中特异性高表达，被认为是肝癌早期诊断及特异性治疗的潜在靶点。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）属于糖基磷脂酰肌醇锚定的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族。GPC-3基因定位于人染色体X26.10，因为该分子的突变或者异常表达常与疾病相关，所以受到广泛关注。现有技术当中，基于沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤研究没有简单高效的手段，沉默GPC-3基因转录对肝癌裸鼠移植瘤的能力的验证不够简便。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，方法包括如下步骤：
1）针对靶基因human GPC3,Gene ID:2719的4个转录本的共有序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,再合成相应dsDNA，将dsDNA***载体构建4种GPC-3-miRNA重组质粒，并通过荧光定量PCR挑选出干扰效率最高的一种GPC-3-miRNA重组质粒；
2）将上述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞，并对其进行筛选，得到稳定转染HepG2细胞;
3）将上述稳定转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型；
4）而后测定上述稳定转染HepG2细胞在人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型中生长情况。
在一些实施方式中，4种的GPC-3-miRNA重组质粒分别为：
p-CMV-GPC-3-miRNA-1；
p-CMV-GPC-3-miRNA-2；
p-CMV-GPC-3-miRNA-3；
p-CMV-GPC-3-miRNA-4;
p-CMV-GPC-3-miRNA-1***序列正、反义链（5’-3’）分别为
F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3
R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3
p-CMV-GPC-3-miRNA-2***序列正、反义链（5’-3’）分别为
F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3
R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3
p-CMV-GPC-3-miRNA-3***序列正、反义链（5’-3’）分别为
F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3
R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3
p-CMV-GPC-3-miRNA-4***序列正、反义链（5’-3’）分别为
F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3
R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3
在一些实施方式中，干扰效率最高的重组质粒为：
p-CMV-GPC-3-miRNA-1。
在一些实施方式中，载体为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR。
在一些实施方式中，干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞中使用GenjetTM转染试剂，得到稳定转染HepG2细胞使用的筛选用试剂为杀稻瘟菌素。
在一些实施方式中，步骤（3）中转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型的方法为：收集对数生长期的转染HepG2细胞，以2×107／(0.2ml·只)接种于裸鼠右肩胛部皮下，形成直径4mm左右的皮下***。
在一些实施方式中，测定转染HepG2细胞生长情况的方法为为测肿瘤生长曲线和免疫组织化学分析。
在一些实施方式中，测肿瘤生长曲线方法为：
接种后，每天观察裸鼠的生存状况、注射部位有无感染和破溃、肿瘤生长后有无自然消退并记录每组肿瘤长出时间；待肿瘤出现后，每周用游标卡尺测量肿瘤长、短径，根据公式：肿瘤体积V(mm3)=0.5×a×b2(a=长径，b=短径)，计算肿瘤体积，并根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线。于接种后35天用颈椎脱臼法处死裸鼠，大体观察移植瘤的生长状况及周围脏器受累情况；剥离肿瘤用生理盐水冲洗、擦干，拍照；将标本浸入4%多聚甲醛内固定24h，备用；
免疫组织化学分析方法为：
将上述测肿瘤生长曲线方法中备用的标本脱蜡，水化，双氧水阻断内源性过氧化物酶，高压加热法修复抗原，正常动物血清封闭非特异性结合；分别滴加GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1抗体，4℃过夜，PBS漂洗；滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10min，PBS漂洗；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的四盐酸二氨基联苯胺溶液，室温显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，无水乙醇脱水透明、封片；光学显微镜观察、摄像；以0.0l mol/L PBS(pH=7.5)替代第一抗体、第二抗体作阴性对照。
在一些实施方式中，针对4种GPC-3-miRNA重组质粒设计p-CMV-Neg-miRNA质粒作为对照；
p-CMV-Neg-miRNA***序列正、反义链（5’-3’）分别为：
F;5-tgctgAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3
R:5-cctgAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTc-3
本发明专利申请的方法可以用于沉默GPC-3对移植瘤的研究。
本发明专利申请的方法能够检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力。
可以得出如下结果：
沉默GPC-3基因转录延长人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型潜伏期。
沉默GPC-3基因转录延缓肝癌裸鼠移植瘤生长速度。
沉默GPC-3基因转录明显肝癌裸鼠移植瘤。
沉默GPC-3基因转录使肝癌裸鼠移植瘤中GPC-3、β-catenin、p-GSK3β、cyclinD1表达水平低于空白对照组。
并且本发明专利申请的方法简单高效，明确的表明了沉默GPC-3基因转录对抑制肝癌裸鼠移植瘤有着明显能力。
附图说明
图1为本发明一实施方式的测定人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型潜伏期的比较图；
图2为本发明一实施方式的测定皮下移植瘤生长曲线；
图3为本发明一实施方式的检测肝癌察移植瘤抑制效果比较图；
图4为本发明一实施方式的免疫组化检测瘤组织Wnt信号通路相关蛋白表达图。
具体实施方式
实施例
1.1材料的准备：
人HepG2细胞株购自中科院上海细胞所；胎牛血清、胰蛋白酶溶液及磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Invitrogen公司；二甲基亚砜及杀稻瘟菌素购自美国Sigma公司；GenJetTM DNA In Vitro Transfection Reagent购自美国SignaGen公司；鼠抗人GPC-3抗体购自美国Abcam公司；β-catenin、p-GSK3β、cyclinD1及β-actin兔抗人抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG抗体购自英国Everest Biotech公司。
1.2实验动物的准备：
18只BALB/c裸鼠由(南通大学实验动物中心提供），鼠龄4～6周，体重18～20g，雌雄各半，随机分对照组（untreated组）、miRNA阴性组（miRNA-neg组）和miRNA干扰组（GPC-3-miRNA组），每组6只，于SPF条件下饲养。
1.3HepG2细胞的培养
人肝癌细胞株HepG2用含有10％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5％CO2孵箱中贴壁培养，待细胞融合度＞80%时传代。
在前期准备完成的条件下，具体采用以下步骤检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力：
2.1四种GPC-3-miRNA重组质粒设计与合成
针对靶基因human GPC3,Gene ID:2719的4个转录本的共有序列，利用Invitrogen miRNA设计***软件设计4对miRNA寡聚单链DNA及阴性对照序列寡聚单链DNA，序列见表1。
将4对miRNA寡聚单链DNA及阴性对照序列寡聚单链DNA分别用双蒸水溶解成100μM，互补单链各取5μL混合，10×退火缓冲液2μL，双蒸水补齐至20μL，95℃加热5min，室温冷却20min，形成相应dsDNA。
将相应退火的dsDNA继续稀释成10nM，取4μL，载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR2μL，5×连接缓冲液4μL，T4DNA连接酶1μL，双蒸水补齐至20μL，室温连接30min，获得5种连接产物。
分别取10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，后接种到LB/壮观霉素平板培养基上，37℃孵箱中培养过夜，长出的菌落即为阳性菌落，挑出菌落扩增，提取重组质粒，测序鉴定。四种GPC-3-miRNA重组质粒分别为：p-CMV-GPC-3-miRNA-1、p-CMV-GPC-3-miRNA-2、p-CMV-GPC-3-miRNA-3和p-CMV-GPC-3-miRNA-4，GPC-3-miRNA重组质粒的阴性对照为p-CMV-Neg-miRNA，序列见表1。
将构建的4种重组质粒，通过荧光定量PCR筛选干扰效率最好的一对，即p-CMV-GPC-3-miRNA-1。
表1GPC-3-miRNA载体质粒名称及序列
Figure BDA0000421190610000051
Figure BDA0000421190610000061
2.2细胞转染及筛选
将两组HepG2细胞（miRNA-neg及GPC-3-miRNA组）种板24h，肉眼观细胞密度达到70%左右时，利用GenjetTM转染试剂将p-CMV-Neg-miRNA、p-CMV-GPC-3-miRNA-1分别转染至miRNA-neg及GPC-3-miRNA组HepG2细胞中，利用杀稻瘟菌素对转染后的HepG2细胞筛选，得到上述稳定转染HepG2细胞克隆，扩增培养。
2.3移植瘤裸鼠模型建立
分别收集对数生长期miRNA-neg组稳定转染HepG2细胞、GPC-3-miRNA组稳定转染HepG2细胞和untreated组（原始HepG2）细胞，以2×107／(0.2ml·只)接种于裸鼠右肩胛部皮下，形成直径4mm左右的皮下***。
2.4测定转染HepG2生长情况：
2.4.1肿瘤生长曲线
接种后，每天观察裸鼠的生存状况、注射部位有无感染和破溃、肿瘤生长后有无自然消退并记录每组肿瘤长出时间。待肿瘤出现后，每周用游标卡尺测量肿瘤长、短径，根据公式：肿瘤体积V(mm3)=0.5×a×b2(a=长径，b=短径)，计算肿瘤体积，并根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线。于接种后35天用颈椎脱臼法处死裸鼠，大体观察移植瘤的生长状况及周围脏器受累情况。剥离肿瘤用生理盐水冲洗、擦干，拍照。将标本浸入4%多聚甲醛内固定24h，备用。
2.4.2免疫组织化学分析
将上步骤的标本常规脱蜡，水化，双氧水阻断内源性过氧化物酶，高压加热法修复抗原，正常动物血清封闭非特异性结合。分别滴加GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1抗体，4℃过夜，PBS漂洗；滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10min，PBS漂洗；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的四盐酸二氨基联苯胺溶液，室温显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，无水乙醇脱水透明、封片。日本Olympus公司BX50光学显微镜观察、摄像；以0.0l mol/L PBS(pH=7.5)替代第一抗体、第二抗体作阴性对照。
2.4.3统计学处理
利用SPSS18.0软件进行单向方差分析(One-way ANOVA)。测定值以均数±标准差表示,阳性细胞所占百分比的比较采用χ2检验，肿瘤平均体积采用t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。
实施效果
3.1HepG2人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型潜伏期
实验组（GPC-3-miRNA组）裸鼠皮下肿瘤形成与对照组（untreated和miRNA-neg组）相比潜伏期延长，平均为11.17±0.98天，miRNA-neg和untreated组肿瘤形成的潜伏期分别为5.5±0.55天、5.33±0.52天，实验组肿瘤形成明显延迟，P<0.01。miRNA-neg组和untreated组相比未见统计学明显差异，P>0.05。见图1。显示将沉默GPC-3的HepG2稳定株给予裸鼠皮下注射，GPC-3-miRNA阻断GPC-3表达后，HepG2细胞移植瘤在裸鼠皮下生长受到了显著抑制。
3.2人肝癌HepG2细胞荷瘤生长曲线取0.2ml HepG2细胞悬液在裸鼠右肩胛部皮下注射，形成直径4mm左右的皮下***，第二日后***逐渐被吸收；对照组第5天左右，接种部位出现扁平结节，并逐渐长大。实验组裸鼠皮下肿瘤生长速度明显慢于对照组，实验结束时差异最为明显。实验结束时，GPC-3-miRNA组瘤体积为65.48±13.66mm3明显小于对照组，对照组分别为404.83±52.63mm3，365.67±14.47mm3，实验组和对照组相比P<0.01，表明沉默GPC-3具有一定的抑制肿瘤生长的作用。对照组相比未见统计学明显差异，P>0.05。实验过程中全部动物均无自然死亡。见图2。HepG2细胞在裸鼠中的成瘤能力明显降低，提示抑制GPC-3的表达在一定程度上能抑制HepG2细胞的增殖能力。
3.3肝癌察移植瘤抑制效果移植瘤外观呈粉红色，表面凹凸不平，无破溃，肿瘤组织表面纤维包膜完整易分离，瘤组织质中，呈结节状或分叶状。其他组织和器官未见转移的癌肿病灶见图3。
3.4免疫组化检测Wnt/β-catenin信号通路关键分子表达免疫组织化学法分别检测瘤组织内GPC-3、β-catenin、p-GSK3β、cyclinD1蛋白的表达情况。GPC-3-miRNA组中GPC-3、β-catenin、p-GSK3β、cyclinD1表达水平低于对照组。见图4。为了研究GPC-3以何种机制影响肿瘤细胞的增殖，利用免疫组化检测了Wnt信号通路关键分子p-GSK3β及其下游信号分子β-catenin和cyclinD1的表达，结果显示阻断GPC-3后，β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1表达同样减少。本方法显示阻断GPC-3使细胞中β-catenin和cyclinD1的表达水平降低，导致细胞周期G1期阻滞，细胞增殖受抑。
本检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，可以用于GPC-3对移植瘤的研究，显示沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤的作用，对肝癌的研究有着良好的支持作用。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，该方法包括如下步骤： 
1）针对靶基因human GPC3,Gene ID:2719的4个转录本的共有序列设计并合成4对miRNA寡聚单链DNA,再合成相应dsDNA，将dsDNA***载体构建4种GPC-3-miRNA重组质粒，并通过荧光定量PCR挑选出干扰效率最高的一种GPC-3-miRNA重组质粒； 
2）将上述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞，并对其进行筛选，得到稳定转染HepG2细胞; 
3）将上述稳定转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型； 
4）而后测定上述稳定转染HepG2细胞在人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型中生长情况。 
2.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，4种所述GPC-3-miRNA重组质粒分别为： 
p-CMV-GPC-3-miRNA-1、p-CMV-GPC-3-miRNA-2、p-CMV-GPC-3-miRNA-3和p-CMV-GPC-3-miRNA-4; 
p-CMV-GPC-3-miRNA-1***序列正、反义链（5’-3’）分别为 
F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3 
R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3 
p-CMV-GPC-3-miRNA-2***序列正、反义链（5’-3’）分别为 
F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3 
R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3 
p-CMV-GPC-3-miRNA-3***序列正、反义链（5’-3’）分别为 
F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3 
R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3 
p-CMV-GPC-3-miRNA-4***序列正、反义链（5’-3’）分别为 
F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3 
R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3 。 
3.根据权利要求2所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述干扰效率最高的GPC-3-miRNA重组质粒为p-CMV-GPC-3-miRNA-1。 
4.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述载体为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR。 
5.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法， 
所述干扰效率最高的重组质粒转染至HepG2细胞中构建转染HepG2细胞中使用GenjetTM转染试剂，所述得到稳定转染HepG2细胞使用的筛选用试剂为杀稻瘟菌素。 
6.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述步骤（3）中转染HepG2细胞接种裸鼠皮下构建人肝癌细胞荷瘤裸鼠模型的方法为：收集对数生长期的转染HepG2细胞，以2×107／(0.2ml·只)接种于裸鼠右肩胛部皮下，形成直径4mm左右的皮下***。 
7.根据权利要求2所述一种基于沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤的方法，所述测定转染HepG2细胞生长情况的方法为测肿瘤生长曲线和免疫组织化学分析。 
8.根据权利要求7所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法， 
所述测肿瘤生长曲线方法为： 
接种后，每天观察裸鼠的生存状况、注射部位有无感染和破溃、肿瘤生长后有无自然消退并记录每组肿瘤长出时间；待肿瘤出现后，每周用游标卡尺测量肿瘤长、短径，根据公式：肿瘤体积V(mm3)=0.5×a×b2(a=长径，b=短径)，计算肿瘤体积，并根据体积的均数值绘制肿瘤生长曲线;于接种后 35天用颈椎脱臼法处死裸鼠，大体观察移植瘤的生长状况及周围脏器受累情况；剥离肿瘤用生理盐水冲洗、擦干，拍照；将标本浸入4%多聚甲醛内固定24h，备用； 
所述免疫组织化学分析方法为： 
将上述固定过的标本脱蜡，水化，双氧水阻断内源性过氧化物酶，高压加热法修复抗原，正常动物血清封闭非特异性结合；分别滴加GPC-3、β-catenin、p-GSK3β及cyclinD1抗体，4℃过夜，PBS漂洗；滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10min，PBS漂洗；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的四盐酸二氨基联苯胺溶液，室温显色，蒸馏水洗涤，苏木素复染，无水乙醇脱水透明、封片；光学显微镜观察、摄像；以0.0l mol/L PBS(pH=7.5)替代第一抗体、第二抗体作阴性对照。 
9.根据权利要求1所述一种检测沉默GPC-3基因转录抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，针对4种所述的GPC-3-miRNA重组质粒设计p-CMV-Neg-miRNA质粒作为对照； 
p-CMV-Neg-miRNA***序列正、反义链（5’-3’）分别为： 
F;5-tgctgAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT-3 
R:5-cctgAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTc-3 。
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