CN103743707B - 可控高速层析相位的显微方法与装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可控高速层析相位的显微装置，包括：沿样品光光路依次布置的二维扫描***、第一4f***、样品、第二4f***；设置在考光光路上的压电陶瓷控制反射镜，用于改变所述样品光光路和参考光光路的光程差；第二偏振分光棱镜，用于将样品光和参考光合束；沿所述偏振分光棱镜出射光路依次布置的偏振片和CCD。本发明还公开了一种可控高速层析相位的显微方法。本发明***稳定性更高，可控性更强，经济性更好，能够实现复杂的角度扫描；并可将层析相位显微***的速度提高4倍以上。

Description

可控高速层析相位的显微方法与装置

技术领域

本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种可控高速层析相位的显微方法与装置。

背景技术

生物组织中不同的细胞有不同的折射率，承担着不同的组织任务；同一个细胞内细胞核、细胞质和各种细胞器都有不同的折射率，当生物的生命活动发生改变的时，其相应组织内的细胞折射率分布也会发生改变，例如癌变细胞折射率增加，被疟原虫感染的红细胞折射率分布改变等，所以对生物细胞折射率的定量三维检测是光学显微领域与生命科学领域一项重要的课题。

对细胞的折射率的观察不同于对荧光样品和染色样品的观察，细胞几乎处于透明状态，折射率对光波的调制主要体现在光程的调制上，所以必须通过干涉的方法才能对折射率信息进行采集，现在对折射率成像的方法主要有相衬显微术、干涉显微术，但这些方法只能对一个面成像，而且由于光程的改变具有累加效应，会导致这两种显微方式的成像结果会有很强的噪声，无法准确量化折射率分布。

2007年，W Choi提出一种层析相位显微术，实现了三维定量折射率成像，对透明活动生物样品成像有很好的效果，能够准确的反应样品中折射率的分布情况。层析相位显微术运用干涉四步移相的方法来定量测量相位，通过120张定量相位图来重构一张三维折射率分布。为了提高层析相位显微术的成像速度，W Choi运用声光调制器移相实现了每秒10帧的数据采集速度。声光调制器的使用限定了整个体统的数据采集频率，整个***的控制变得单一，同时每秒10帧的数据采集速度对于观察快速变化的生物活动细胞依然不够，所以设计一种稳定的、可控的、高速的层析相位显微镜是显微光学成像和生命科学一项有意义的突破。

发明内容

本发明提供了可控高速层析相位的显微方法和装置，将低频相应稳定的压电陶瓷运用到层析相位显微镜中循环扫描的控制方法，提高了层析相位显微镜的采样速度和运行可控性。本发明能够以最快每秒512x512像素50帧的速度采集样品相位信息，而且***更稳定，可控性更强，为晶体掺杂加工检测、活动生物样品三维观察和疾病诊断提供有了一种力的工具。

一种可控高速层析相位的显微方法，包括以下步骤：

（1）激光器发射出激光光束，所述光束经过扩束镜扩束照射到反射镜上，经反射镜反射的激光透射二分之一波片进入偏振分光棱镜，旋转所述二分之一波片调节光束中p偏振光和s偏振光的分量，调整样品路跟参考路的光强；

（2）所述参考路激光，依靠固定反射镜与压电陶瓷控制反射镜构建“Z”型光路，压电陶瓷控制反射镜包括反射镜和控制反射镜发生微位移的压电陶瓷，两个透镜沿着光传播方向依次放置在所述压电陶瓷控制反射镜之前和之后，两个透镜构成4f***，对参考路激光进行二次扩束，其中第一个透镜的前焦点和第二个透镜的后焦点在所述压电陶瓷控制反射镜反射面上。所述压电陶瓷控制反射镜在压电陶瓷控制下移动，每次改变参考路光程1/4波长的距离，实现四步移相；

（3）所述样品光照射到二维扫描***，所述二维扫描***由两个振动方向相互垂直摆放的一维振镜组成，所述两个一维振镜之间有两个透镜，组成4f***，两个振镜分别放置在4f***的前后焦面上，所述样品光经过二维扫描***，能够以第二个一维振镜反射点为球心扫描转动；

（4）所述经过二维扫描***的光束入射到扫描透镜上，所述第二个一维扫描振镜的反射面在扫描透镜的焦点处，经过扫描透镜的光束与光轴平行，聚焦到会聚透镜的后焦点处，所述激光透过会聚透镜，变成平行光透射位于其前焦点处的样品；

（5）透过样品的光被显微物镜接收，所述显微物镜的后焦点跟所述会聚透镜前焦点重合，样品放置在所述显微物镜后焦点处，所述被显微物镜接收的光经显微镜场镜照射到CCD成像面，所述显微物镜场镜与显微物镜构成4f***，所述CCD处于所述显微物镜前焦面；

（6）所述样品光与所述参考光通过偏振分光棱镜合束，合束后的光透过偏振片统一偏振方向，所述偏振分光棱镜与偏振片放置与CCD与显微物镜场镜之间，CCD拍摄记录样品路激光与参考路激光的干涉图样；

（7）所述光路***搭建完好的情况下，压电陶瓷控制反射镜先处于0相位差位置，二维扫描***转动使平行光按照设定的角度轨迹透射样品，同时，CCD快速拍摄图像，扫描一个周期后，得到干涉图像包p1；

（8）改变所述压电陶瓷控制反射镜的位置，使参考路与样品路的光程差依次改变1/4λ,2/4λ,3/4λ,λ,1/4λ,2/4λ……，λ为光束的波长，重复如步骤（7）中的扫描和记录方法依次得到干涉图像包p2,p3,p4,p5,p6,p7……，利用p1,p2,p3,p4相邻的4个干涉图像包，运用四步移相算法与解包络算法得到各个扫描角度下的相位积分图，再运用反Radon变换得到t1时刻的折射率三维分布图；利用干涉图像包p2,p3,p4,p5，得到t2时刻的折射率三维分布图，以此类推，可以快速地对变化样品三维折射率分布进行三维记录。

***搭建优选方案中，所述激光发出光束经扩束透镜束腰扩束到3mm；所述参考路中两个透镜将激光扩束到10mm左右；调整二分之一波片的角度，使入射到偏振分光棱镜中的光有50%反射、50%透射；样品路中会聚透镜与显微物镜都采用1.4NA的浸油透镜，以保证单向最大扫描角度达到60°；在二维扫描***施加0电压信号时，***内所有的透镜的光轴与光路主光轴重合；

控制方法优选方案中，压电陶瓷工作在线性变化最好的区段，标定每次移动反射镜的距离，实现准确的相位移动；CCD拍摄速度为每秒5000帧，角度扫描周期为20ms，角度扫描轨迹为覆盖-60°～60°的线性角度扫描照明。

本发明还提供了一种实现层析相位的显微装置，包括：

（1）激光器，发出激光；

（2）所述激光器发出的光束在分束之前依次通过扩束镜，反射镜，二分之一波片和第一偏振分光棱镜，光束在第一偏振分光棱镜中发生反射与透射，其中所述的反射光构成光路的参考路，所述透射光构成光路的样品路；

（3）所述的参考路上的参考光在与样品路上的样品光合束前依次通过反射镜、聚焦透镜、压电陶瓷控制反射镜和准直透镜。其中，聚焦透镜的前焦点和准直透镜的后焦点重合在压电陶瓷控制反射镜的反射点上；

（4）所述的样品路在与参考路合束前依次通过二维扫描***、扫描透镜、会聚透镜、样品、显微物镜、反射镜和显微场镜，其中扫描透镜、会聚透镜、显微物镜、显微场镜连续的任意两个构成4f***，二维扫描***的扫描中心点位于扫描透镜的后焦点处，样品位于会聚透镜的前焦点处；其中二维扫描***由两个一维扫描振镜和两个等焦距透镜组成，两个一维振镜扫描角度相互垂直，分别处于沿光路传播方向第一个透镜的后焦点和第二个透镜的前焦点，当振镜转动时，激光光束能够以第二个一维扫描振镜的反射点为中心，呈辐射状转动；

（5）所述样品路光与参考路光在第二偏振分光棱镜合束，合束后的激光透过偏振片入射到CCD成像面上，CCD成像面位于显微场镜的前焦面上；

其中在优选方案里，扩束镜将激光器发出的光束扩束到3mm，参考路中聚焦透镜与准直透镜将参考路光束扩束到10mm；样品路中扫描透镜采用两英寸，焦距150mm双胶合透镜；会聚透镜采用1英寸入瞳，1.4NA浸油透镜；显微物镜采用1.4NA，100X浸油透镜；显微物镜场镜采用两英寸，焦距200mm双胶合透镜；

本发明的工作原理如下：

激光器发出激光经扩束镜扩束照射到反射镜上，由反射镜反射后透过二分之一波片照射到第一偏振分光棱镜中，由于激光器发出的光是偏振光通过调整二分之一波片的角度可以调整激光光束中p，s分量进而调整第一偏振分光棱镜的透反比例；

激光在第一偏振分光棱镜处被分为样品光与参考光，参考光依次照射到反射镜、聚焦透镜、压电陶瓷控制反射镜、准直透镜，其中聚焦透镜和准直透镜能够将光束进一步扩束，反射镜与压电陶瓷控制振镜使光路“Z”型弯折，压电陶瓷施加不同电压时能够改变参考路的光程，每次移动四分之一波长，实现四步移相；

样品路激光依次通过二维扫描***、扫描透镜、会聚透镜、样品、显微物镜、反射镜和显微场镜，其中二维扫描***由两个一维振镜和两个等焦距透镜组成，两个等焦距透镜构成4f***，两个一维振镜的转动轴相互垂直，分别位于4f***的共轭面上，当两个一维振镜转动时，光束能够以第二个透镜的反射点为球心呈辐射状转动。第二个一维振镜的反射点位于扫描透镜的焦点处，当二维扫描***转动时透过扫描透镜的光为平行于主光轴的聚焦光，会聚透镜与扫描透镜构成4f***，透过会聚透镜的光为过会聚透镜前焦点的平行光，样品放置在会聚透镜的前焦点上，会聚透镜为NA等于1.4的浸油透镜，且焦距只有扫描透镜的百分之一，所以当聚焦在会聚透镜后焦面上且主光线与主光轴平行的光能够以很大角度扫描透射样品，理论上可以实现-67°～67°的扫描。显微物镜与会聚透镜构成4f***，透过样品的光进入显微物镜后成为聚焦在其前焦面上的平行于主光轴的光，显微物镜与显微场镜构成4f***，显微场镜的出射光为平行光。

样品光与参考光在第二偏振分光棱镜处合束，合束后的激光透过偏振片照射到CCD成像面上，其中CCD成像面中心位于显微镜场镜前焦点处，调整偏振片角度能够改变干涉条纹的对比度。

***运行时，设定压电陶瓷电压依次为V0，V1，V2，V3，V4，V5，V6……，使参考路依次改变光程1/4λ,2/4λ,3/4λ,λ,1/4λ,2/4λ……，并处于不断循环中。当电压为V0时，维持压电陶瓷电压不变，振镜扫描，同时CCD拍摄，按照扫描轨迹得到干涉图像I（x,y）₀₀₀₁，I（x,y）₀₀₀₂，I（x,y）₀₀₀₃，I（x,y）₀₀₀₄，I（x,y）₀₀₀₅……I（x,y）_000n，n的大小根据每次测量的要求来设定，以后为了简便起见将（x，y）忽略不写；改变压电陶瓷电压到V1，维持压电陶瓷电压不变，振镜扫描，同时CCD拍摄，按照扫描轨迹得到干涉图像I₁₀₀₁，I₁₀₀₂，I₁₀₀₃，I₁₀₀₄，I₁₀₀₅……I_1000n，扫描轨迹跟之前完全一样，CCD拍摄的照片数量也完全一样；参照这种方式，随着压电陶瓷不断改变得到的数据依次为I₂₀₀₁，I₂₀₀₂，I₂₀₀₃，I₂₀₀₄，I₂₀₀₅……I_2000n，I₃₀₀₁，I₃₀₀₂，I₃₀₀₃，I₃₀₀₄，I₃₀₀₅……I_3000n，……，命名规则为下标后三位代表一个周期内拍摄的第几张图，前面的数代表压电电压改变次数。根据得到的干涉图利用四步移相的方法得到相位分布图，公式为

式中，k代表压电电压改变次数，i表示一个周期内拍摄的第几张图；

再通过二维解包络算法将相位图连接起来成为连续的相位曲面，其公式为：

Φ(k,i)=unwrap2(φ(k,i))

unwrap2为二维解包络函数，再经过消背景处理，其公式为

Φ′(k,i)=Φ(k,i)-Φ(0,0)(k,i)-(Φ(i)_back-Φ(0,0)(i)_back)

其中，Φ(i)_back为没有样品的情况下得到的背景相位图,Φ(0,0)(k,i)为Φ(k,i)相位图像最左上点的相位值，Φ(i)_back为不加样品的背景相位图，Φ(0,0)(i)_back为背景相位图像最左上点的相位值。通过减左上角相位值能够初始化相位起始点，为所有相位图设定统一标准。

经过上述处理后得到第k次改变压电陶瓷电压时，n+1个透射角度下的相位分布图Φ(k,0～n)，n+1相位透射角度θ(0～n)根据扫描轨迹是确定的或者可以根据干涉图像求得，通过二维Radon变换即可可得，第k次改变压电陶瓷电压时样品的三维折射率分布。假设压电陶瓷每20ms改变一次电压，即可实现50Hz的三维相位信息记录，而且20ms的响应周期对于，压电陶瓷来说能够实现稳定的控制。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

（1）***稳定性更高，可控性更强，经济性更好，能够实现复杂的角度扫描；

（2）能够将层析相位显微***的速度提高4倍以上；

（3）装置结构简洁，方便快速高精度调整。

附图说明

图1为本发明可控高速层析相位的显微装置的结构示意图；

图2为本发明可控高速层析相位显微的装置中二维扫描***的结构示意图；

图3为可控高速层析相位显微镜信号控制方式示意图。

具体实施方式

如图1所示，一种高速可控层析相位的显微装置，包括：激光器1，扩束镜2，反射镜3，二分之一波片4，第一偏振分光棱镜5，反射镜6，聚焦透镜7，压电陶瓷控制反射镜8，准直透镜9，二维扫描***10，扫描透镜11，会聚透镜12，样品13，显微物镜14，反射镜15，显微场镜16，第二偏振分光棱镜17，偏振片18，CCD19；如图2所示，二维扫描***10由一维扫描透镜101，透镜102，透镜103，一维扫描透镜104组成。

其中，激光器1发出激光光束，光束经过扩束镜2扩束照射到反射镜3上，经过反射镜3反射的激光，透射二分之一波片4，照射到第一偏振分光棱镜5上，通过调节二分之一波片4的角度能够改变光束中s、p偏振光的比例，进而调整第一偏振分光棱镜5对激光光束的透反比例，其中第一偏振分光棱镜5反射的光构成***参考路，第一偏振分光棱镜5透射的光构成***的样品路。

第一偏振分光棱镜5反射的光照射到反射镜6上，经反射镜6反射的光透射聚焦透镜7聚焦到压电陶瓷控制反射镜8表面，经压电陶瓷控制反射镜8反射的光透射准直透镜9变成平行光。其中，压电陶瓷控制反射镜8在施加电压变化时能够发生细微的移动，通过标定可以实现每次改变参考路光程1/4λ，实现四步移相。

第一偏振分光棱镜5的透射光照射到二维扫描***10中，根据图2所示中二维扫描***结构图，激光照射到一维扫描振镜101上，一维扫描振镜101的反射光照射到透镜102上，一维扫描振镜101的反射点位于一维透镜102的后焦点处，透镜102和103构成4f***，一维扫描振镜104的反射点位于透镜103的后焦点上，平行光入射到二维扫描***10中，能够平行出射，当两个一维扫描振镜101和104转动时，平行光束能够以一维扫描振镜104的反射点为中心呈辐射状转动。二维扫描***10的出射光照射到扫描透镜11上，其中扫描透镜11的后焦点位于二维扫描***10的一维扫描振镜104的反射点上，透过扫描透镜11的光聚焦在会聚透镜12的后焦面上，其中扫描透镜11与会聚透镜12构成4f***，会聚透镜12的出射光为过其前焦点的平行光，会聚透镜12采用NA1.4的浸油透镜，样品13放置会聚透镜12的前焦点处，通过二维扫描***10扫描可以对样品13实现-60°～60°的角度扫描。显微物镜14为1.4NA，100X的显微物镜与会聚透镜12构成4f***，显微物镜14接收的光照射到反射镜15上，样品光经反射镜反射后照射到显微场镜16上，显微场镜16与显微物镜14构成4f***，样品光经过显微场镜16后经过显微物镜场镜的前焦点的平行光。

样品光路与参考光路在第二偏振分光棱镜17处合束，合束后的光透过偏振片18照射到CCD19成像面上，CCD19成像面中心与显微镜场镜16的后焦点重合，偏振片18能够统一偏振方向，实现样品路与参考路的干涉，当改变偏振片18的角度时，能够调整s光与p光的透过量，进而调整干涉条纹的对比度。

***运行时，***的信号控制如图3所示，Ⅰ为CCD控制信号，每一个脉冲信号，CCD采集一幅图像，图3Ⅰ中的频率仅为象征频率，具体频率视样品复杂程度而定；Ⅱ为压电陶瓷控制电压信号，v1，v2，v3，v4，分别代表压电陶瓷在该电压控制下，参考路的光程分别改变1/4λ,2/4λ,3/4λ,λ，实现四步移相；Ⅲ为振镜扫描信号，每次扫描时为单方向扫描，回程时间占整个周期很小比例，压电陶瓷控制电压信号改变一次电压的时间内，振镜扫描一个周期。振镜扫描一个周期拍摄的图片数据为同一个相位差下的数据，连续四个周期扫描得到的图像构成一个完整四步移相的三维折射率分布原始数据包，由于整个扫描时周期是循环的，所以三维折射率分布单帧图像采集速度为振镜扫描一个周期所需时间。

Claims (6)

1.一种可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，包括：

激光器，及沿激光器光路依次布置的扩束镜、反射镜、二分之一波片和第一偏振分光棱镜；所述第一偏振分光棱镜用于将所述激光器光路分为样品光光路和参考光光路；

沿样品光光路依次布置的二维扫描***、第一4f***、样品、第二4f***；所述二维扫描***由两个一维扫描振镜和两个等焦距透镜组成，所述两个一维振镜的扫描角度相互垂直；

设置在参考光光路上的压电陶瓷控制反射镜，用于改变所述样品光光路和参考光光路的光程差；所述压电陶瓷控制反射镜包括反射镜和控制反射镜发生微位移的压电陶瓷；

第二偏振分光棱镜，用于将样品光和参考光合束；

沿所述第二偏振分光棱镜出射光路依次布置的偏振片和CCD。

2.如权利要求1所述的可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，所述的第一4f***包括依次布置的扫描透镜和会聚透镜；所述第二4f***包括依次布置的显微物镜和显微场镜。

3.如权利要求2所述的可控高速层析相位的显微装置，其特征在于，所述扫描透镜采用两英寸，焦距150mm双胶合透镜；所述会聚透镜采用1英寸入瞳，1.4NA浸油透镜；所述显微物镜采用1.4NA，100X浸油透镜；所述显微场镜采用两英寸，焦距200mm双胶合透镜。

4.一种可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)激光器发射出激光光束，所述光束经过扩束镜扩束照射到反射镜上，经反射镜反射的激光透射二分之一波片进入偏振分光棱镜，旋转所述二分之一波片调节光束中p偏振光和s偏振光的分量，调整样品路跟参考路的光强；

将样品路上的光束聚焦在样品上，并收集透过样品的透射光，将参考路上的光束与所述透射光合束，统一偏振方向后发生干涉，再利用CCD采集干涉图样；

所述样品路上的光束照射到二维扫描***，所述二维扫描***由两个振动方向相互垂直摆放的一维振镜组成，所述两个一维振镜之间有两个透镜；

2)根据光程差改变量1/4λ,2/4λ,3/4λ,λ，依次并循环改变所述样品路与参考路的光程差，且在每次改变时，利用所述样品路上的光束对样品进行扫描，通过CCD采集到与每个光程差改变量相对应的干涉图像包pi；

所述的参考路设有用于改变所述样品路与参考路的光程差的压电陶瓷控制反射镜；所述的压电陶瓷控制反射镜包括反射镜和控制反射镜发生微位移的压电陶瓷；

3)以干涉图像包pi为起点，依次提取pi,p(i+1),p(i+2),p(i+3)四个干涉图像包，运用四步移相算法与解包络算法得到各个扫描角度下的相位积分图，再运用反Radon变换得到对应时刻的折射率三维分布图。

5.如权利要求4所述的可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，所述的样品路和参考路由同一激光器发出的光束扩束后经偏振分光棱镜分束而成。

6.如权利要求5所述的可控高速层析相位的显微方法，其特征在于，所述激光器发出的光束扩束到3mm后分束，所述参考路上的光束扩束到10mm后与所述样品路上的光束合束。