CN103740825A - 一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒 - Google Patents

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杨博辉
郭婷婷
刘建斌
韩吉龙
孙晓萍
郭健
牛春娥
冯瑞林
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Abstract

本发明公开一种对绵羊毛色基因检测的试剂盒，特别是一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒。本发明的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒内有序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的两条引物核苷酸和标准质粒载体SEQIDNO：3核苷酸序列。检测试剂盒提供了一种快速、简便、准确的新检测手段，摆脱了测序仪等大型仪器设备的依赖，而且操作步骤简单，普通兽医临床人员易于熟练掌握应用。

Description

一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种对绵羊毛色基因检测的试剂盒，特别是一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒。
背景技术
绵羊、山羊被毛颜色种类很多，其遗传现象也十分复杂。绵羊毛、山羊绒、羔皮、
裘皮等的颜色均具有重要的经济意义，例如，白色山羊绒比其他颜色的山羊绒价格高。毛色还是品种的重要标志，有些品种的毛色对适应自然环境还起着重要的作用。对细毛羊养羊业来讲，人们的主要目的是为了获得白色优质细毛。近年来，由于国际市场对不经人工染色的天然有色毛织品兴趣增加，有色毛(黑色、褐色)的价格比白色毛贵30％～40％。因此，澳大利亚正在培育黑色美利奴羊，目前数量已达5万只左右。绵、山羊被毛纤维的颜色是由直径约0.1～0.3μm的深色素颗粒形成的，参见：赵有璋.羊生产学(第二版)[M].北京.中国农业出版社.2007。绵羊、山羊毛色的形成主要取决于黑色素及其衍生物的有无与多少，参见：里德U.N，魏H.著.病理学总论与各论.武忠弼主译.北京：人民卫生出版社，1996，129-131.，
而毛色的种类主要取决于黑色素的种类和分布情况，见：方美英.猪的毛色遗传[J].中国畜牧杂志，2002，38(2)：51-52.。黑色素是一种不溶于水与几乎所有溶剂的无定型小颗粒生物色素，合成和储存场所是黑素小体，参见：Li XL，Zheng GR，Zhou RY,et al.Evolution and differentiation ofMSHR gene in different Species[J]J Hered，2007，98(2)：165-168；Klungland H，Vage DI.Pigmentary switches in domestic animal species[J]Ann N Y Acad Sci，2003，994：331-338.，并由多个基因共同作用以及环境因素影响而形成，见：Sturm RA，Teasdele RD，Box NF.Human pigmentation genes：Identification，structure and consequences of polymorphic variation[J]Gene.2001，277：49-62.。黑色素有两种，一种为真黑色素，以黑色和褐色两种形式存在，不含硫原子；另一种是褐黑色素，以黄色和红色两种形式存在，见：师科荣，王爱国，邓学梅.猪毛色性状遗传机制研究进展[J]养猪，2003，4：24-28.，含硫原子，易溶于碱性溶液。真黑色素跟褐黑色素都是由酪氨酸和苯丙氨酸经一系列酶的催化形成的，合成过程的每个阶段都受到了很多信号分子与特定成分的调节和限制，见：伍革民，彭光旭.动物黑色素研究进展[J]甘肃畜牧兽医，2005，1：39-41。近年来，大量试验成果表明，与黑色素合成调控相关的基因有很多，如TYR、MC1R、C-KIT、MSH、ACIH、ATRN、Agouti、LYST、EDN、Dmbxl及MGF等，其中Agouti就是一个重要的黑色素调控基因，参见：师科荣，王爱国，李宁等.中国地方猪种黑素皮质激素受体1基因(MC1R)的单核苷酸多态性.中国科学C辑， 2004，34(2)：144-149.。Parsons等通过经典遗传学方式分析得知Agouti基因座与被毛显性白色相关，参见：Parsons Y.M,Fleet M.R,Cooper D.W.Investigation of the gene responsible for recessive pigmentation in Australian Merino sheep.ProcAssocAdvancAnimBreed.Genet,1997，6th-10th：447-451.；Parsons Y.M,Fleet M.R,Cooper D.W.Isolation of the ovine Agouti coding sequence.Pigment Cell Research,1999,12(7)：394-397.。Royo等研究Xalda羊Agouti基因在皮肤中mRNA的表达量，发现白色个体Agouti表达量高，见：Royo L.J,Alvarez I,Arranz J.J,Fernandez I，Rodriguez A，Perez-Pardal L，Goyache F. Differences in the expression ofthe ASIP gene are involved in the recessive black coat colour pattern in sheep：evidence from the rare Xalda sheep breed.Animal Genetics,2008,39(3)：290-293.。Norris等研究表明在Soay、澳洲美利奴羊中显性白色是由于一段包含ASIP编码基因、AHCY编码区和ATCH启动子序列多拷贝的190Kb串联片段，由于多拷贝的ATCH启动子启动多拷贝的Agouti基因高表达而形成，参见：Norris Belinda J，Whan Vicki A.A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep.Genome Research,2008，18(8)：1282-1293.。因而开展Agouti基因拷贝数变异检测对于开展绵羊毛色分子标记辅助选择育种的研究具有指导意义。
目前检测拷贝数变异CNV的方法包括：基于芯片和DNA测序的高通量分析方法的比较基因组杂交技术(CGH芯片)、BAC芯片技术、SNP分型芯片和寡核苷酸芯片技术等，此外还有基于PCR技术的靶向分析的多重扩增探针杂交技术和依赖于连接的多重探针扩增技术以及高分辨率TILING芯片以及基于芯片技术的MAPH(程玉强，郭卫星，程树群.基因拷贝数异常的研究进展.中国细胞生物学学报,2011,33(7)：789-795.)。目前的新方法的基础也是基于DNA测序建立的，但以上方法都不适用于常规实验室操作。Southern Blot也能用于测定基因拷贝数，参见：QIU Jie-ren,XU Ying,YU Fu-gen.Determining the Copy Number of Exogenous Gene in Transgenic Plant by SYBR Green Real-time Quantitative PCR.Agricultural Science Technology,2011，12(6)：829-831；李嫒，任长虹，吴永红，叶巧，石锦平，屈武斌，郑晓飞，刘虎岐，张成岗.多重PCR在质粒拷贝数检测中的应用.中国生物工程杂志,2011，31(6)：93-98.，但其操作繁琐且很难绝对定量。Norris等设计一种检测Agouti基因拷贝数的非对称性竞争PCR方法，该设计是基于测序技术通过测定竞争性PCR扩增同一起始位点到连接点峰图面积A242或5断裂点峰图面积A238，通过A242/(A242+A238)比值来确定拷贝数，参见：Norris Belinda J，Whan Vicki A.A gene duplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible for white and black sheep.Genome Research,2008，18(8)：1282-1293；Henshall JM，Whan VA，Norris BJ.Reconstructing CNV genotypes using segregation analysis：combining pedigree information with CNV assay.Genetics Selection Evolution,2010,42(34)：2-8.。但这种方法比较复杂，临床兽医难以熟练掌握操作性技术，并且需要测序仪等大型仪器，因此不适用于常规实验室。
发明内容
本发明提供一种可克服现有技术不足，可用于检测控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异的试剂盒。
本发明的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒内有序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条引物核苷酸和标准质粒载体SEQ ID NO：6核苷酸序列。
为方便使用，本发明的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒内还可放置有相关试剂，如：
Figure BDA0000454661440000031
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，
Figure BDA0000454661440000032
Green I)和ROX Reference Dye II，等。
本发明试剂盒的最佳使用方法是：PCR最佳反应体系为18μL，其中包含SYBR Premix Ex Taq(2×)9μL，Rox Reference Dye0.4μL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2引物(10μtM/μL)各0.8μL，ddH2O6μL，模板DNA1μL。PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃复性延伸30s，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65℃升温至95℃，根据溶解曲线判断产物特异性和Ct值。
本发明试剂盒的使用方法是首先将已知浓度的pMD19-Agouti标准质粒倍比稀释5个梯度，选取其中5个浓度梯度作为计算Ct值标准曲线的线性回归方程的荧光定量PCR扩增反应的模板，然后分别中加入试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和
Figure BDA0000454661440000033
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，
Figure BDA0000454661440000034
Green I)和ROX Reference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR扩增产物根据溶解曲线判断产物特异性，根据不同浓度标准质粒的Ct值计算Ct值标准曲线的线性回归方程。然后将待检羊只的DNA为荧光定量PCR模板，然后再分别中加入试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和
Figure BDA0000454661440000035
Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，
Figure BDA0000454661440000036
Green I)和ROX Reference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR扩增产物根据溶解曲线判断产物特异性，将获得的待测样品的Ct值代入Ct值标准曲线的线性回归方程计算待测样品拷贝数。
本发明实质上是一种Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，这一检测试剂盒提供了一种快速、简便、准确的新检测手段。本发明改进了现有技术中Agouti基因拷贝变异检测中的 缺点。由于该方法引入了特异性扩增引物和SYBR Green Buffer体系，使得Agouti基因拷贝变异检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，并避免了漏检和误检。用大量已知不同Agouti基因拷贝数的标本和进行比对实验并对产物进行测序验证，结果证实，本试剂盒特异性较好，吻合度为100％。本发明的试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。在实验样本基因组DNA应用本发明中试剂盒中的特异引物进行扩增后，可直接应用荧光定量PCR仪分析仪进行拷贝数变异分析，而无需现有技术中Agouti基因拷贝变异检测方法在PCR扩增后在大型测序仪中进行毛细电泳检测后还需要应用不对称竞争性PCR技术进行拷贝数变异分析，从而摆脱了测序仪等大型仪器设备的依赖，而且操作步骤简单，普通兽医临床人员易于熟练掌握应用。总之，本发明较上述已有Agouti基因拷贝变异检测方法准确、快速、简便、成本低、实用，具有很好的实用价值和市场价值。
由前述内容可知，本发明所涉及的检测方法是建立利用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Agouti基因拷贝数变异的简单方便的方法，采用这本发明的用于检测Agouti基因拷贝数变异可克服现有技术不足。
附图说明
图1为质粒DNA和待测样本基因组DNA PCR扩增Agouti片段电泳图，显示常规PCR扩增特异性片段，2％的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增后，其扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳在紫外灯下观察，可看到与目的片段大小一致的电泳条带，从右到左依次是DNA分子量Marker(100bp DNA Ladder Marker)、pMD19-Agouti和待测绵羊Agouti基因实时荧光定量PCR扩增产物的结果。图中Marker为DNA分子量Marker，1、2为样本基因组DNA扩增产物，3、4为质粒DNA扩增产物。
图2为pMD19-Agouti质粒标准品标准曲线，显示pMD19-Agouti质粒标准品标准曲线，图中：横坐标表示pMD19-Agouti质粒标准品的DNA浓度，纵坐标表示循环阈值(Ct值)。
表1显示待测绵羊Agouti基因实时荧光定量PCR扩增反应Ct值和基因拷贝数。
具体实施方式
绵羊Agouti基因拷贝变异检测标准品标准线性回归方程的制备
(1)引物设计和合成
参照绵羊Agouti基因DNA序列(Genbank No.EU420023.1)和mRNA序列(Genbank No.NM001134303.1)在内含子3和外显子4之间的一段保守序列，运用primer5.0软件设计一对特异性引物，引物序列(5′→3′)SEQ ID NO：1：GTTAAGTGTTGATGGCGGAG；SEQ ID NO：2：GTTCTTCATCGGAGCCTTTC，扩增长度193bp，以构建标准质粒pMD19-Agouti。所有引物均由上海生工合成并采用LLTRAPAGE纯化方式纯化。
标准质粒载体SEQ ID NO：3核苷酸序列：GTTAAGTGTTGATGGCGGAGCAGGCGAGGACCAGCTAGGGTGCTCTGTGGACATGAGTCGAGCGGGCGGTGGACAGCAGGTGGGGACATCTAGTCCGAGGAGTTCCCAGGCGGGGGTGAGGACGAGTGGGGCGGACGTGGATGGCTCGGGCAGCCTCGGCGTTTCCCCACAGAGAAAGGCTCCGATGAAGAAC
(2)pMD19-Agouti质粒标准品的构建
pMD19-Aguti质粒标准品的构建的PCR反应体系为50μL，包含LA Taq(5U/μL)0.5μL、10×LA PCR缓冲液5μL、dNTP Mixture8μL、模板DNA5μL，引物SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2(10μM/μL)各2μL，加纯水补充到50μL。PCR反应程序：95℃预变性4min、95℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸20s、72总延伸5min，将PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳，然后将目的条带用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgelMidi Purification Kit回收纯化。用pMD19-T载体连接胶回收产物，将连接好的产物转化至E.coli JM109感受态细胞，然后涂布含IPTG、X-Gal、Amp琼脂平板培养基培养，具体操作步骤参照TaKaRa Code：D102A使用说明书。筛选白色阳性菌落并涂布培养，提取质粒并测定其浓度，PCR扩增Agouti片段，PCR产物经2％琼脂糖电泳鉴定，胶回收进行测序鉴定。用NanoDrop2000测定阳性质粒浓度，计算每微升所含质粒拷贝数，计算公式为copies/ul=(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)，其中DNA长度为载体长度2692bp加上PCR产物长度193bp。提取的阳性质粒DNA用NanoDrop2000测得OD260/OD280值为1.81，OD260/OD230为2.02，证明其纯度符合试验要求，浓度为26.7ng/μL，根据公式计算得到的拷贝数为8.44×109copies/μL。
(3)实时荧光定量PCR标准曲线回归方程
将标准质粒先稀释成108copies/μL，然后再稀释6个梯度，稀释倍数为10倍。选取102-106copies/μL五个浓度梯度作为荧光定量PCR扩增反应的模板，每个浓度3个重复。以稀释的质粒为模板进行SYBR Green I实时荧光定量PCR反应扩增的PCR反应体系为18μL，其中包含SYBR Premix Ex Taq(2×)9μL，Rox Reference Dye0.4μL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2(10μM/μL)各0.8μL，ddH2O6μL，模板DNA1μL。反应参数：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃复性延伸30s，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65℃升温至95℃，根据溶解曲线判断产物特异性及扩展效率，得到扩展效率为E=i04.6％。以拷贝数的log值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制质粒标准曲线，计算得到线性回归方程y=- 3.215logx+35.8(R2=0.999)。
绵羊Agouti基因拷贝数检测
(1)绵羊颈静脉采血10mL，加入肝素钠以制备抗凝血，放入-20℃保存，用于提取基因组DNA。按照DNA提取试剂盒说明书步骤提取血液DNA(具体操作步骤参照Code：DP319使用说明书)，用NanoDrop2000测定提取的DNA的浓度，加ddH2O稀释成10ng/μL备用。任取稀释后的一个绵羊基因组DNA进一步做梯度稀释，梯度稀释5个梯度，稀释倍数为5，绘制标准曲线，计算扩增效率。
(2)实时荧光定量PCR扩增反应
本实验任意选取9份待测样品的基因组DNA作为检测模板，标准质粒103copies/μL作为对照。每个样品做3个重复，荧光定量PCR反应，获得扩增曲线。以稀释的质粒、待测绵羊基因组DNA为模板进行SYBR Green I实时荧光定量PCR反应扩增的PCR反应体系为18μL，其中包含SYBR Premix Ex Taq(2×)9μL，Rox Reference Dye0.4μL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2引物(10μM)0.8μL，ddH2O6μL，模板DNA1μL。反应参数：95℃预变性3min；95℃变性10s，60℃复性延伸30s，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65℃升温至95℃，根据溶解曲线判断产物特异性。
(3)绵羊Agouti基因拷贝数计算
由基因组DNA梯度稀释绘制的标准曲线得到的扩增效率为E=98％，扩增效率和标准质粒基本相当，说明该标准曲线可以用于Agouti基因拷贝数检测。将待测绵羊实时荧光定量PCR扩增反应荧光阈值的设定与制作标准曲线时相同，获得待测样品的Ct值代入标准曲线的线性回归方程公式y=-3.215logx+35.8(R2=0.999)求出拷贝重复数，参见表1。
表19个待测样的Ct值和拷贝数
Figure BDA0000454661440000061
<110> 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
<120> 一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（）
<400>
gttaagtgtt gatggcggag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（）
<400>
gttcttcatc ggagcctttc 20
<210> 3
<211> 193
<212> DNA
<213> 标准质粒pMD19- Agouti
<400>
gttaagtgtt gatggcggag caggcgagga ccagctaggg tgctctgtgg acatgagtcg 60
agcgggcggt ggacagcagg tggggacatc tagtccgagg agttcccagg cgggggtgag 120
gacgagtggg gcggacgtgg atggctcggg cagcctcggc gtttccccac agagaaaggc 180
tccgatgaag aac 193

Claims (4)

1.一种控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒内有序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条引物核苷酸和pMD19- Agouti标准质粒载体SEQ ID NO：3核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还放置有SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I）和ROX Reference Dye II。
3. 根据权利要求1和2 所述的试剂盒的使用方法，其特征是：PCR最佳反应体系为18 µL，其中包含SYBR Premix Ex Taq(2×) 9 µL，Rox Reference Dye 0.4 µL，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2引物（10µM/μL）各0.8 µL，ddH2O 6 µL，模板DNA 1 µL，PCR条件: 95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃复性延伸30 s，共40个循环，然后加溶解曲线阶段，65 ℃升温至95 ℃，根据溶解曲线判断产物特异性和循环阈值Ct。
4.权利要求1或2所述的控制绵羊毛色Agouti基因拷贝变异检测试剂盒的使用方法，其特征在于首先将权利要求1中已知浓度的pMD19- Agouti标准质粒倍比稀释6个梯度，选取其中5个浓度梯度作为计算Ct值标准曲线的线性回归方程的荧光定量PCR扩增反应的模板，然后分别中加入权利要求1所述所述试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和权利要求2中所述的SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I）和ROX Reference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR 扩增产物根据根据溶解曲线判断产物特异性，根据不同浓度标准质粒的Ct值计算Ct值标准曲线的线性回归方程；再以待检羊只的DNA为荧光定量PCR模板，然后分别中加入权利要求1所述所述试剂盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和权利要求2中所述的SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（含Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR® Green I）和ROX Reference Dye II后，在荧光定量PCR上进行PCR扩增，PCR 扩增产物根据根据溶解曲线判断产物特异性,将获得的待测样品的Ct值代入权利要求4所得的Ct值标准曲线的线性回归方程计算待测样品拷贝数。
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