CN103740690A - 一种浓缩、稳定、分离液体酶的方法 - Google Patents

一种浓缩、稳定、分离液体酶的方法 Download PDF

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王素文
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Abstract

本发明提供了一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，组分按重量百分比计：大环分子合成受体1.0-20.0％，非离子型表面活性剂0.1％-50％，酶稳定剂0.25％-5％，生物酶0.01％-80％，极性溶剂余量；按上述组分配比混合，控制pH3-12，温度0-80℃，反应1-24h。溶液中形成了含生物酶的超分子微球，粒径大小在10nm-1000nm之间。本发明所选材料均为环保无害，易降解的材料。最重要的是这种方法没有损害酶的活性，且使酶的活性在相当长一段时间都有较高的活性，包裹于超分子微球中的酶活性较普通液体酶的活性提高20%，将其应用于纺织乳化剂或液体洗涤剂的配方中四周后生物酶的活性损失小于10%。

Description

一种浓缩、稳定、分离液体酶的方法
技术领域
本发明涉及到液体酶制剂，具体属于浓缩、稳定、分离液体酶制剂的方法。
背景技术
液体酶制剂是一种使用方便，绿色环保，生物降解性良好的原料。专一的催化特性及温和的反应条件，在工业界得到越来越多的使用和重视。但是，液体酶制剂的浓缩，稳定及分离一直是一个困扰着人们的难题。
当然，有许多人在尝试寻找办法解决有关液体酶制剂浓缩，稳定及分离的问题。并且提出一些可行的技术，有添加酶稳定剂，膜分离技术，微波真空浓缩法，试剂浓缩，和温敏性水凝胶法等。
添加酶稳定剂方法是比较传统的稳定，浓缩酶制剂的方法。在US20070134375A1中，Andreas Habich等人在发明中涉及一种稳定的固态或者液态酶制剂，其包含至少一种酶和至少一种选自***胶、至少一种植物蛋白及其混合物的稳定剂，提高了酶制剂的贮存和稳定性。
膜分离技术是20世纪60年代兴起的一项分离技术，它借助于外界能量或化学位差的推动，通过特定膜的渗透作用，实现对两组分或多组分混合的气体或液体进行分离、分级、提纯和富集的技术。常用的膜材料有醋酸纤维素（CA）、聚丙烯腈(PAN)、聚矾(PSF)、聚酰胺(PA)、聚偏氟乙烯(PVDF)等。常见的膜分离技术：（1）微滤（Micro filtration，MF）；（2）超滤(Ultrafiltration，UF)；（3）纳滤（Nanofiltration，NF）；（4）反渗透（Reverse osmosis，RO）。目前，在酶制剂工业中，应用较多的是微滤及超滤技术，尤其是超滤技术，而且近年来超滤技术与其他分离技术的联合使用已越来越广泛地被应用。
1965年Blatt等提出用膜分离技术进行微生物的浓缩，并进行试验。王平诸用外压管式膜由菠萝汁中浓缩提取菠萝蛋白酶，酶活可浓缩近4倍，浓缩液中酶截留率95%，回收率79.8%，酶粉得率比传统方法高出47%。在CN201110389274中，周兴等人用超滤和纳滤技术对腈水解酶粗酶进行了一系列处理，最后制备出浓度较高的腈水解酶产品。在专利CN103122343A中，魏兴业等人用管式或中空纤维式的超滤膜对破胶酶复合菌发酵液进行了浓缩，结果得到纯度较高的酶产物。
应用膜分离技术对酶进行浓缩和精制，操作过程简单，减少了杂菌污染与酶失活的机会，提高了酶的回收率并改善了产品的质量。
目前也有人尝试用微波真空浓缩法对酶制剂进行了浓缩，并取得了成功。在CN102899303A中，李冰等人公开了一种木瓜蛋白酶溶液的微波真空浓缩方法，他们用微波真空浓缩方法对瓜蛋白酶进行浓缩，得到了木瓜蛋白酶浓缩液。这种方法浓缩过程温度低，浓缩速度快，得到的木瓜蛋白酶浓缩液酶活回收率高。同时，设备不易结垢，能耗低。
试剂浓缩法用聚乙二醇(PEG)吸收酶液中的水分,该法简便、效率高,但试剂价格较贵,作为工业化生产因成本问题则不予考虑。
减压蒸发浓缩法采用减压装置使待浓缩酶液在一定的真空度和温度下进行,对酶液等热敏性物质,减压装置多采用离心薄膜蒸发器和刮板式蒸发器，但是该法能源消耗较大。
温敏性水凝胶也可以对酶进行浓缩和分离，它根据被浓缩分离物质的尺寸和性质设计凝胶的交联密度或单体结构。但是凝胶对蛋白及酶的分离效率低温时(低于相转变温度)分离效率很高,高温时(高于相转变温度)分离效率降低,在相转变温度附近分离效率发生突跃。（王锦堂仲慧朱红军张维光，南京化工大学学报，1998，20,2）
目前，也有一些技术提到用超分子来封装液体酶制剂，但是因为生物酶三维结构的特点，在超分子技术中不同程度的都遇到了酶失活，以及封装生物酶含量过低的问题。
发明内容：
本发明的目的在于针对酶制剂普遍存在的酶失活的问题，利用超分子纳米微球包裹生物酶的技术，提供一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法。
本发明提供的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，
组分按重量百分比计：大环分子合成受体1.0-20.0％，非离子型表面活性剂0.1％-50％，酶稳定剂0.25％-5％，生物酶0.01％-80％，极性溶剂余量；
按上述组分配比混合，控制pH3-12，温度0-80℃，反应1-24h。溶液中形成了含生物酶的超分子微球，粒径大小在10nm-1000nm之间。
以上优选的组分配比为：大环分子合成受体2.0-18.0％，非离子型表面活性剂0.5％-40％，酶稳定剂0.5％-4.5％，生物酶0.5％-70％，极性溶剂余量；
所述的反应温度优选5-70℃之间，更优选10-50℃之间。
所述的PH值优选5-11。
所述的大环分子合成受体为冠醚、环番、环糊精、葫芦脲、杯芳烃或柱芳烃等。
所述的冠醚为15-冠醚-5、15-冠醚-6、或18-冠醚-6等；
环番为大环番或小环番等；
环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等；
杯芳烃为杯[4]芳烃或杯[5]芳烃等；
柱芳烃为柱[5]芳烃或柱[6]芳烃等。
所述的极性溶剂是水或直链醇或酮。
所述酶稳定剂可以是二元醇或三元醇；二元醇可以是乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇，1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇或1,5-戊二醇；三元醇可以是丙三醇、1,2,4-丁三醇或1,2,5-戊三醇。
所述的非离子型表面活性剂，其结构式可以是PEOX－PPOY－PEOX、R－C6H4－O－（CH2CH2O)n－H、R－CO－(OC2H4)n－OH、RO－(CH2CH2O)n－H或R-COO-(CH2CH2O)n-H；且其分子量>10000，HLB值在5-60之间。
所述的生物酶是蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶、半纤维素酶、脂酶、诺维信酶和枯草杆菌酶中的任意一种或多种。
与现有技术分离，浓缩以及稳定液体酶制剂的方法相比，本发明提出用大环分子合成受体，酶稳定剂，非离子型表面活性剂以及生物酶来构建超分子微球达到分离，浓缩以及稳定液体酶制剂的目的，本发明所选材料均为环保，无危害，易降解的材料。最重要的是这种方法没有损害酶的活性，且使酶的活性在相当长一段时间都有较高的活性，包裹于超分子微球中的酶活性较普通液体酶的活性提高20%，将其应用于纺织乳化剂或液体洗涤剂的配方中四周后生物酶的活性损失小于10%。
附图说明：
图1实施例1动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图2实施例2动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图3实施例3动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图4实施例4动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图5实施例5动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图6实施例6动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图7实施例7动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图8实施例8动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图9实施例9动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图10实施例10动态光散射（DLS）超分子微球颗粒粒径分布图
图11实施例10超分子微球电镜照片
具体实施方式：
实施例1
将非离子型表面活性剂EO11PO69EO11（HLB值6.0）0.9g溶解于50g水中，然后取液体蛋白酶制剂1g与之混合，混合物滴加到0.8gα-环糊精中，再加入2.4g1,2-丙二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在20℃下，搅拌反应20h，通过国标GB/T23527-2009确定液体蛋白酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000041
动态光散射Dynamic Light Scattering（DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布（见图1），包裹酶微粒平均粒径在270nm左右。
实施例2
将非离子型表面活性剂EO133PO50EO133（HLB值26.0）9g溶解于50g乙醇中，然后取液体脂肪酶制剂38g与之混合，混合物滴加到1.5gβ-环糊精中，再加入0.5g1,3-丙二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在20℃下，搅拌反应22h，通过国标GB/T23527-2009确定液体脂肪酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000042
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布（见图2），包裹酶微粒平均粒径在298nm左右。
实施例3
将非离子型表面活性剂EO3PO43EO3（HLB值6.0）20g溶解于100g乙酮中，然后取液体半纤维素酶制剂18g与之混合，混合物滴加到10g小环番中，再加入0.55g1,2-丁二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在30℃下，搅拌反应24h，通过国标GB/T23527-2009确定液体半纤维素酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000051
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图3），包裹酶微粒平均粒径在806nm左右。
实施例4
将非离子型表面活性剂EO37PO56EO37（HLB值14.0）1.5g溶解于50g丙酮中，然后取液体纤维素酶制剂10g与之混合，混合物滴加到5g葫芦脲中，再加入1.2g1,3-丁二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在36℃下，搅拌反应23h，通过国标GB/T23527-2009确定液体纤维素酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000052
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图4），包裹酶微粒平均粒径在353nm左右。
实施例5
将非离子型表面活性剂壬基酚聚氧乙烯醚2.0g溶解于30g丙醇中，然后取液体纤维素酶和半纤维素酶组合物制剂8.0g与之混合，混合物滴加到0.7gγ-环糊精中，再加入0.9g1,4-丁二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在40℃下，搅拌反应24h通过国标GB/T23527-2009确定液体纤维素酶和半纤维素酶组合物制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000061
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图5），包裹酶微粒平均粒径在431nm左右。
实施例6
将非离子型表面活性剂EO103PO39EO103（HLB值26.0）3.0g溶解于50g丁醇中，然后取液体纤维素酶制剂10g与之混合，混合物滴加到2.8g杯芳烃中，再加入1.5g1,5-戊二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在25℃下，搅拌反应20h通过国标GB/T23527-2009确定液体纤维素酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000062
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图6），包裹酶微粒平均粒径在130nm左右。
实施例7
将非离子型表面活性剂：月桂酸聚氧乙烯酯LAE-4、90.8g溶解于40g乙酮中，然后取液体枯草杆菌酶制剂0.6g与之混合，混合物滴加到0.6gβ-环糊精中，再加入1.0g1,2,4-丁三醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在20℃下，搅拌反应20h，通过国标GB/T23527-2009确定液体枯草杆菌酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000071
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图7），包裹酶微粒平均粒径在406nm左右。
实施例8
将非离子型表面活性剂甲基烯丙基聚氧乙烯醚0.3g溶解于10g丙酮中，然后取液体果胶酶制剂0.6g与之混合，混合物滴加到0.6g柱[5]芳烃中，再加入0.5g丙三醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在20℃下，搅拌反应20h通过国标GB/T23527-2009确定液体脂酶制剂的酶活力见下表。
Figure BDA0000452504350000072
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图8），包裹酶微粒平均粒径在676nm左右。
实施例9
将非离子型表面活性剂EO42PO16EO42（HLB值26.0）0.5g溶解于30g丙醇中，然后取液体蛋白酶和果胶酶组合物制剂0.5g与之混合，混合物滴加到0.6gβ-环糊精中，再加入1.0g1,3-丁二醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在20℃下，搅拌反应20h通过国标GB/T23527-2009确定液体蛋白酶和果胶酶组合物制剂的酶活力见下表。
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图9），包裹酶微粒平均粒径在588nm左右。
实施例10
将非离子型表面活性剂EO6PO34EO6（HLB值5.0）0.4g溶解于30g乙醇中，然后取液体果胶酶制剂0.5g与之混合，混合物滴加到0.6gγ-环糊精中，再加入1.0g1,2,5-戊三醇稳定剂混匀。
将上述混合均匀的液体，密封后在20℃下，搅拌反应20h，通过国标GB/T23527-2009确定液体果胶酶制剂的酶活力见下表。
动态光散射Dynamic Light Scattering(DLS)用来测试样品的纳米结构。超分子微球颗粒粒径分布如下图（见图10）包裹酶微粒平均粒径在245nm左右。
此外，我们也用透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对分子形貌进行了观察，如下图（见图11），图11（A)为包酶微球的SEM图，从图可以看出，此微球的外形为较为标准的圆球形。从图上可以读出，此微球的粒径约为120nm。图11（B）为包酶微球的TEM图，从图上可以看出，此微球为实心微球，这是标准的包酶实心微球，粒径大约为120nm左右。

Claims (15)

1.一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：
组分按重量百分比计：大环分子合成受体1.0-20.0％，非离子型表面活性剂0.1％-50％，酶稳定剂0.25％-5％，生物酶0.01％-80％，极性溶剂余量；
按上述组分配比混合，控制pH3-12，温度0-80℃，反应1-24h即可。
2.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的组分按重量百分比计：大环分子合成受体2.0-18.0％，非离子型表面活性剂0.5％-40％，酶稳定剂0.5％-4.5％，生物酶0.5％-70％，极性溶剂余量。
3.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的反应温度为5-70℃。
4.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的PH值为5-11。
5.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的大环分子合成受体为冠醚、环番、环糊精、葫芦脲、杯芳烃或柱芳烃。
6.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的冠醚为15-冠醚-5、15-冠醚-6、或18-冠醚-6。
7.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的环番为大环番或小环番。
8.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的环糊精为α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精。
9.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的杯芳烃为杯[4]芳烃或杯[5]芳烃。
10.如权利要求5所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的柱芳烃为柱[5]芳烃或柱[6]芳烃。
11.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的极性溶剂是水或直链醇或酮。
12.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的所述酶稳定剂是二元醇或三元醇。
13.如权利要求12所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的二元醇是乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇，1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇或1,5-戊二醇；所述的三元醇是丙三醇、1,2,4-丁三醇或1,2,5-戊三醇。
14.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的非离子型表面活性剂，是结构式为PEOX－PPOY－PEOX、R－C6H4－O－（CH2CH2O)n－H、R－CO－(OC2H4)n－OH、RO－(CH2CH2O)n－H或R-COO-(CH2CH2O)n-H，且其分子量>10000，HLB值在5-60之间的非离子型表面活性剂。
15.如权利要求1所述的一种浓缩、分离、稳定液体酶的方法，其特征在于：所述的生物酶是蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、脂肪酶、半纤维素酶、脂酶、诺维信酶和枯草杆菌酶中的任意一种或多种。
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