CN103735571B - 硫化氢及其供体在改善***质量及功能中的应用 - Google Patents
硫化氢及其供体在改善***质量及功能中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
硫化氢及其供体在改善***质量及功能中的应用,涉及在生殖领域。硫化氢能够通过在体外直接添加到***中,短时间内即可以显著提高临床弱***症患者***的活力。硫化氢还可以为体外培养的***抵抗氧化应激,减轻因为人为操作和离体培养对***造成的应激损伤,维持***的活力水平。硫化氢还能够改善感染所造成生精障碍,保护睾丸的生精结构,维持血睾屏障的完整性,以及雄激素的合成,减轻睾丸组织中的炎性水平,和生***的氧化应激,减少感染所引起的生***的凋亡,从而维护正常的生精过程,保持***的质量,维持雄性正常的生育能力。本发明开拓了硫化氢一个新的应用领域,对于解决人类生殖障碍,改善辅助生殖技术提供了有意义的参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种气体分子硫化氢(Hydrogensulfide,H2S)及其供体的用途,尤其涉及在生殖领域内的应用。
背景技术
据世界卫生组织报道,在世界范围内,已婚夫妇中约有5%-30%不能生育,***不育的比例在发展中国家更为突出,在我国发病率约10%,且有逐渐上升趋势。其中男性不育是造成人类生殖障碍的重要因素,约占40%-60%。近年来,辅助生殖技术及的问世,如人工授精(IUI)、体外受精—胚胎移植(IVF)和卵浆内单***注射(ICSI)等,为解决人类生殖障碍提供了有力的手段。但无论是正常生育功能的维持,还是辅助生殖技术的治疗均涉及到***的质量,维持甚至提高***的质量对于解决人类生殖障碍,提高辅助生殖的成功率都有着重要的作用。
不育男性中超过85%均能够产生***,但是大多质量低下,临床上通常表现为少***症、弱***症及少弱***症,即***数目过少,或者运动能力低下,这是导致男性不育的重要原因。***发生是一个极其复杂的过程,是***生长分化与成熟的一个连续动态的过程。同时在***发育的过程中有很多的细胞因子和局部的调节起了重要作用,生***、支持细胞以及***的共同作用维持了***发生的特殊环境。***发生过程中的任何一个环节发生障碍,均会影响***的质量,造成男性不育。除了基因突变和染色体异常等遗传因素,环境因素和感染等疾病因素均是导致***发生障碍的重要原因。这其中氧化应激与炎症反应是最关键的损伤机制。
目前为止,男性生精障碍的治疗大都收效甚微。从激素治疗,到补充相应营养成分(抗氧化作用),很多种疗法都已经被尝试。虽然有些研究表明某些疗法有一定的效果,但是没有任何一种疗法能够对所有患者都起效,同时又无法预测该疗法能够适用于哪类患者。尽管目前辅助生殖技术已经大大取代了生精障碍的传统医疗方法,但是能够找到一种解决男性生精障碍的药物,不仅能够大大提高辅助生殖的成功率,也有助于提高人类自然受孕的概率,避免辅助生殖技术带来的伦理风险和潜在生育缺陷。
发明内容
解决的技术问题:本发明针对上述技术空白,提供一种硫化氢及其供体在改善和提高人类生育能力中的应用。
技术方案:硫化氢及其供体在体外改善***质量及功能的应用。硫化氢及其供体在体外培养液中改善和维护***质量及功能的应用。硫化氢及其供体在制备治疗***不育药物中的应用。
有益效果:在本发明中,硫化氢(H2S)及其供体能够通过在体外直接添加到***中,短时间内即可以显著提高临床弱***症患者***的活力。
在本发明中,硫化氢(H2S)及其供体可以为体外培养的***抵抗氧化应激,减轻因为人为操作和离体培养对***造成的应激损伤,维持***的活力水平。
在本发明中,硫化氢(H2S)及其供体能够改善感染所造成生精障碍,保护睾丸的生精结构,维持血睾屏障的完整性,以及雄激素的合成,减轻睾丸组织中的炎性水平,和生***的氧化应激,减少感染所引起的生***的凋亡,从而维护正常的生精过程,保持***的质量,维持雄性正常的生育能力。
本发明对硫化氢(H2S)及其供体发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域,对于解决人类生殖障碍,改善辅助生殖技术提供了有意义的参考。
附图说明
图1在离体***中添加H2S对弱***症病人***活力的影响。*与相应时间为未给予硫化氢的实验组相比p<0.05。
图2在离体的***培养液中加入不同浓度的过氧化氢(H2O2),同时添加H2S,观察其对***活力的影响。*与未加H2O2处理的对照组相比p<0.05,#与相同浓度H2O2处理但未给予硫化氢供体GYY4137预处理的实验组相比#<0.05。
图3在离体的***培养液中加入不同浓度的过氧化氢(H2O2),同时添加H2S,观察其对***前向运动能力的影响。*与未加H2O2处理的对照组相比p<0.05,#与相同浓度H2O2处理但未给予硫化氢供体GYY4137预处理的实验组相比#<0.05
图4注射细菌脂多糖(LPS)后,H2S供体GYY4137对小鼠附睾尾部***密度的影响。*与生理盐水组(saline)相比*<0.05,***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图5注射细菌脂多糖(LPS)后,H2S供体GYY4137对小鼠附睾尾部***活率的影响。*与生理盐水组(saline)相比***<0.001,#与LPS实验组相比###<0.001。
图6注射细菌脂多糖(LPS)后,H2S供体GYY4137对小鼠附睾尾部***前向运动能力的影响。*与生理盐水组(saline)相比***<0.001,#与LPS实验组相比##<0.01。
图7注射细菌脂多糖(LPS)后,H2S供体NaHS对小鼠附睾尾部***密度的影响。*与生理盐水组(saline)相比**<0.01,***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图8注射细菌脂多糖(LPS)后,H2S供体NaHS对小鼠附睾尾部***活率的影响。*与生理盐水组(saline)相比*<0.05,***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图9注射细菌脂多糖(LPS)后,H2S供体NaHS对小鼠附睾尾部***前向运动能力的影响。*与生理盐水组(saline)相比**<0.01,***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图10注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中生精结构的影响,苏木素-伊红染色×200。
图11注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中促炎因子IL-1β的影响。*与生理盐水组(saline)相比***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图12注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中促炎因子IL-6的影响。*与生理盐水组(saline)相比***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图13注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中促炎因子TNF-α的影响。*与生理盐水组(saline)相比***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
图14注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中促炎因子iNOS的影响。*与生理盐水组(saline)相比**<0.01,***<0.001,#与LPS实验组相比###<0.001。
图15注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中抗炎因子IL-10的影响。*与生理盐水组(saline)相比**<0.01,#与LPS实验组相比#<0.05。
图16注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中氧化应激水平的影响,DHE染色×200
图17注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中生***凋亡情况的影响,TUNEL染色×200
图18注射LPS后,H2S对小鼠睾丸中血睾屏障完整性的影响,免疫荧光染色×400。
图19注射LPS后,H2S对小鼠血清睾酮水平的影响。*与生理盐水组(saline)相比***<0.001,#与LPS实验组相比#<0.05。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品。实例中所用硫化氢供体GYY4137由新加坡国立大学PhillipMoor教授赠送,另一硫化氢供体NaHS为市售产品,购买于AdamasReagentCo.,Ltd.
本发明所述化合物可以制成注射液,用于静脉滴注、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射。亦可以制成口服的胶囊,片剂等。
实施例1:硫化氢(H2S)对弱***症病人离体***中***活力的改善。
选择弱***症患者的***样本进行实验。***法***,用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样品水浴保持22-37℃,液化后的***,根据WHO《人类***检查与处理实验室手册》第5版(《WHO5》)标准评价,使用电脑辅助***分析仪CASA(IVOS;Hamilton-ThornResearch,Inc.Beverly,MA,USA),对***参数(体积,***计数,活力和运动特性的百分比)进行评估。
硫化氢供体GYY4137溶于生理盐水,加入***中的终浓度为2.5μM。***置于37℃,5%CO2的培养箱中培养2小时,分别在15分钟、30分钟、60分钟、120分钟使用计算机辅助***分析仪CASA,对***活力进行评估。对于每个标本,选取6-10个视野,计数到的***数目不小于500个。
图1***活率的变化曲线显示,硫化氢能够显著地维持和改善弱***症病人***的活力水平。
实施例2:硫化氢(H2S)对离体***在***培养液中受到氧化应激时***活力的改善
选择健康男性的***捐赠者的***样本进行实验。***法***,用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样品水浴保持22-37℃,液化后的***,根据WHO《人类***检查与处理实验室手册》第5版(《WHO5》)标准评价,使用电脑辅助***分析仪CASA(IVOS;Hamilton-ThornResearch,Inc.Beverly,MA,USA),对***参数(体积,***计数,活力和运动特性的百分比)进行评估。
密度梯度离心法从***中分选***,分离后的***培养在商品化的***培养液中,先给与50μM的硫化氢供体GYY4137孵育30分钟,之后加入不同浓度的H2O2,,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养2小时,使用计算机辅助***分析仪CASA,对***活力进行评估。对于每个标本,选取6-10个视野,计数到的***数目不小于500个。
图2,图3***活率及前向运动能力变化的结果显示,硫化氢能够帮助离体培养的***抵抗外来的氧化应激。
实施例3:硫化氢(H2S)对LPS造成小鼠***发生障碍的保护作用
选用SPF级雄性C57BL/6小鼠(购于南京大学模式动物所,下同),8-10周,随机分为四组:溶剂对照组(Saline)、硫化氢对照组(GYY4137)、损伤组(LPS)、损伤+给药组(LPS+GYY4137/NaHS),每组10只。LPS溶于生理盐水,以10mg/kg的剂量通过腹腔注射造成小鼠的生精功能损伤模型,在给予LPS后1小时,将硫化氢供体GYY4137/NaHS溶于生理盐水,以GYY4137(50mg/kg)/NaHS((50μmol/kg)的剂量通过腹腔注射给药。给药24小时后,牺牲小鼠,取小鼠附睾尾部的***,睾丸组织和血清进行相关参数的测定。
图4,图5,图6显示小鼠附睾尾部的***质量在给予硫化氢供体GYY4137前后的变化。图7,图8,图9显示小鼠附睾尾部的***质量在给予另外一种硫化氢供体NaHS前后的变化。结果表明LPS造成小鼠附睾尾部***的密度、活率和前向运动***率出现了明显下降,而给予硫化氢之后,这三项***质量指标均出现了明显恢复。
图10对小鼠睾丸组织做石蜡切片,进行苏木素-伊红染色观察睾丸生精结构的情况。如图显示,LPS刺激小鼠的睾丸生精结构紊乱,生***出现脱落,生精小管结构也被破坏。而给予硫化氢后,小鼠睾丸的组织结构基本正常,没有出现明显的脱落坏死区域。
图11,图12,图13和图14均显示小鼠睾丸组织促炎因子水平的变化情况。LPS刺激小鼠的睾丸中促炎因子IL-1β,IL-6和TNF-α的mRNA水平和iNOS的蛋白表达水平出现了明显的增高,硫化氢显著抑制了促炎因子水平的的增高。
图15显示小鼠睾丸组织抗炎因子水平的变化情况。结果表明H2S不仅抑制了促炎因子水平的增高,同时大大增加了抗炎的细胞因子IL-10的mRNA水平,提示硫化氢具有显著的抗炎作用。
图16对小鼠睾丸组织做冰冻切片,进行DHE染色观察小鼠睾丸组织中的活性氧水平。结果显示LPS引起小鼠睾丸组织中活性氧的水平大量增加,而硫化氢可以显著地抑制活性氧的增加。
图17对小鼠睾丸组织做石蜡切片,用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)进行染色,观察生***的凋亡情况,如图所示LPS引起大量生***凋亡,而硫化氢可以显著地抑制生***凋亡。
图18对小鼠睾丸组织做冰冻切片,利用睾丸组织中构成血睾屏障的主要蛋白occludin、ZO-1和claudin11进行免疫荧光染色,观察睾丸组织血睾屏障的完整性,结果显示LPS使得大部分曲细精管中,血睾屏障蛋白的表达强度变弱,环状结构变得不完整,而给予H2S之后,尽管血睾屏障的结构不十分清晰,但是基本维持了其完整的环状结构。
图19取小鼠血清,利用商品化的酶联免疫吸附试验(Elisa)试剂盒检测小鼠血清睾酮的水平,结果显示硫化氢可以显著地抑制LPS引起的血清睾酮水平的降低。
Claims (3)
1.在体外非诊断治疗目的改善***运动能力的应用。
2.在体外培养液中非诊断治疗目的改善和维护***运动能力的应用。
3.在制备治疗改善***运动能力药物中的应用。
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