CN103735571B - 硫化氢及其供体在改善***质量及功能中的应用 - Google Patents
硫化氢及其供体在改善***质量及功能中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
硫化氢及其供体在改善***质量及功能中的应用，涉及在生殖领域。硫化氢能够通过在体外直接添加到***中，短时间内即可以显著提高临床弱***症患者***的活力。硫化氢还可以为体外培养的***抵抗氧化应激，减轻因为人为操作和离体培养对***造成的应激损伤，维持***的活力水平。硫化氢还能够改善感染所造成生精障碍，保护睾丸的生精结构，维持血睾屏障的完整性，以及雄激素的合成，减轻睾丸组织中的炎性水平，和生***的氧化应激，减少感染所引起的生***的凋亡，从而维护正常的生精过程，保持***的质量，维持雄性正常的生育能力。本发明开拓了硫化氢一个新的应用领域，对于解决人类生殖障碍，改善辅助生殖技术提供了有意义的参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种气体分子硫化氢（Hydrogensulfide，H2S）及其供体的用途，尤其涉及在生殖领域内的应用。
背景技术
据世界卫生组织报道，在世界范围内，已婚夫妇中约有5%-30%不能生育，***不育的比例在发展中国家更为突出，在我国发病率约10％，且有逐渐上升趋势。其中男性不育是造成人类生殖障碍的重要因素，约占40%-60%。近年来，辅助生殖技术及的问世，如人工授精(IUI)、体外受精—胚胎移植(IVF)和卵浆内单***注射（ICSI）等，为解决人类生殖障碍提供了有力的手段。但无论是正常生育功能的维持，还是辅助生殖技术的治疗均涉及到***的质量，维持甚至提高***的质量对于解决人类生殖障碍，提高辅助生殖的成功率都有着重要的作用。
不育男性中超过85%均能够产生***，但是大多质量低下，临床上通常表现为少***症、弱***症及少弱***症，即***数目过少，或者运动能力低下，这是导致男性不育的重要原因。***发生是一个极其复杂的过程，是***生长分化与成熟的一个连续动态的过程。同时在***发育的过程中有很多的细胞因子和局部的调节起了重要作用，生***、支持细胞以及***的共同作用维持了***发生的特殊环境。***发生过程中的任何一个环节发生障碍，均会影响***的质量，造成男性不育。除了基因突变和染色体异常等遗传因素，环境因素和感染等疾病因素均是导致***发生障碍的重要原因。这其中氧化应激与炎症反应是最关键的损伤机制。
目前为止，男性生精障碍的治疗大都收效甚微。从激素治疗，到补充相应营养成分（抗氧化作用），很多种疗法都已经被尝试。虽然有些研究表明某些疗法有一定的效果，但是没有任何一种疗法能够对所有患者都起效，同时又无法预测该疗法能够适用于哪类患者。尽管目前辅助生殖技术已经大大取代了生精障碍的传统医疗方法，但是能够找到一种解决男性生精障碍的药物，不仅能够大大提高辅助生殖的成功率，也有助于提高人类自然受孕的概率，避免辅助生殖技术带来的伦理风险和潜在生育缺陷。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述技术空白，提供一种硫化氢及其供体在改善和提高人类生育能力中的应用。
技术方案：硫化氢及其供体在体外改善***质量及功能的应用。硫化氢及其供体在体外培养液中改善和维护***质量及功能的应用。硫化氢及其供体在制备治疗***不育药物中的应用。
有益效果：在本发明中，硫化氢（H2S）及其供体能够通过在体外直接添加到***中，短时间内即可以显著提高临床弱***症患者***的活力。
在本发明中，硫化氢（H2S）及其供体可以为体外培养的***抵抗氧化应激，减轻因为人为操作和离体培养对***造成的应激损伤，维持***的活力水平。
在本发明中，硫化氢（H2S）及其供体能够改善感染所造成生精障碍，保护睾丸的生精结构，维持血睾屏障的完整性，以及雄激素的合成，减轻睾丸组织中的炎性水平，和生***的氧化应激，减少感染所引起的生***的凋亡，从而维护正常的生精过程，保持***的质量，维持雄性正常的生育能力。
本发明对硫化氢（H2S）及其供体发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，对于解决人类生殖障碍，改善辅助生殖技术提供了有意义的参考。
附图说明
图1在离体***中添加H2S对弱***症病人***活力的影响。*与相应时间为未给予硫化氢的实验组相比p<0.05。
图2在离体的***培养液中加入不同浓度的过氧化氢（H2O2），同时添加H2S，观察其对***活力的影响。*与未加H2O2处理的对照组相比p<0.05，#与相同浓度H2O2处理但未给予硫化氢供体GYY4137预处理的实验组相比#<0.05。
图3在离体的***培养液中加入不同浓度的过氧化氢（H2O2），同时添加H2S，观察其对***前向运动能力的影响。*与未加H2O2处理的对照组相比p<0.05，#与相同浓度H2O2处理但未给予硫化氢供体GYY4137预处理的实验组相比#<0.05
图4注射细菌脂多糖（LPS）后，H2S供体GYY4137对小鼠附睾尾部***密度的影响。*与生理盐水组（saline）相比*<0.05，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图5注射细菌脂多糖（LPS）后，H2S供体GYY4137对小鼠附睾尾部***活率的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比###<0.001。
图6注射细菌脂多糖（LPS）后，H2S供体GYY4137对小鼠附睾尾部***前向运动能力的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比##<0.01。
图7注射细菌脂多糖（LPS）后，H2S供体NaHS对小鼠附睾尾部***密度的影响。*与生理盐水组（saline）相比**<0.01，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图8注射细菌脂多糖（LPS）后，H2S供体NaHS对小鼠附睾尾部***活率的影响。*与生理盐水组（saline）相比*<0.05，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图9注射细菌脂多糖（LPS）后，H2S供体NaHS对小鼠附睾尾部***前向运动能力的影响。*与生理盐水组（saline）相比**<0.01，***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图10注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中生精结构的影响，苏木素-伊红染色×200。
图11注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中促炎因子IL-1β的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图12注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中促炎因子IL-6的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图13注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中促炎因子TNF-α的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
图14注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中促炎因子iNOS的影响。*与生理盐水组（saline）相比**<0.01，***<0.001，#与LPS实验组相比###<0.001。
图15注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中抗炎因子IL-10的影响。*与生理盐水组（saline）相比**<0.01，#与LPS实验组相比#<0.05。
图16注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中氧化应激水平的影响，DHE染色×200
图17注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中生***凋亡情况的影响，TUNEL染色×200
图18注射LPS后，H2S对小鼠睾丸中血睾屏障完整性的影响，免疫荧光染色×400。
图19注射LPS后，H2S对小鼠血清睾酮水平的影响。*与生理盐水组（saline）相比***<0.001，#与LPS实验组相比#<0.05。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品。实例中所用硫化氢供体GYY4137由新加坡国立大学PhillipMoor教授赠送，另一硫化氢供体NaHS为市售产品，购买于AdamasReagentCo.，Ltd.
本发明所述化合物可以制成注射液，用于静脉滴注、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射。亦可以制成口服的胶囊，片剂等。
实施例1：硫化氢（H2S）对弱***症病人离体***中***活力的改善。
选择弱***症患者的***样本进行实验。***法***，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的***，根据WHO《人类***检查与处理实验室手册》第5版(《WHO5》)标准评价，使用电脑辅助***分析仪CASA（IVOS;Hamilton-ThornResearch，Inc.Beverly，MA，USA），对***参数（体积，***计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。
硫化氢供体GYY4137溶于生理盐水，加入***中的终浓度为2.5μM。***置于37℃，5%CO2的培养箱中培养2小时，分别在15分钟、30分钟、60分钟、120分钟使用计算机辅助***分析仪CASA，对***活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的***数目不小于500个。
图1***活率的变化曲线显示，硫化氢能够显著地维持和改善弱***症病人***的活力水平。
实施例2：硫化氢（H2S）对离体***在***培养液中受到氧化应激时***活力的改善
选择健康男性的***捐赠者的***样本进行实验。***法***，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的***样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的***，根据WHO《人类***检查与处理实验室手册》第5版(《WHO5》)标准评价，使用电脑辅助***分析仪CASA（IVOS;Hamilton-ThornResearch，Inc.Beverly，MA，USA），对***参数（体积，***计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。
密度梯度离心法从***中分选***，分离后的***培养在商品化的***培养液中，先给与50μM的硫化氢供体GYY4137孵育30分钟，之后加入不同浓度的H2O2，，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养2小时，使用计算机辅助***分析仪CASA，对***活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的***数目不小于500个。
图2，图3***活率及前向运动能力变化的结果显示，硫化氢能够帮助离体培养的***抵抗外来的氧化应激。
实施例3：硫化氢（H2S）对LPS造成小鼠***发生障碍的保护作用
选用SPF级雄性C57BL/6小鼠（购于南京大学模式动物所，下同），8-10周，随机分为四组：溶剂对照组（Saline）、硫化氢对照组（GYY4137）、损伤组（LPS）、损伤+给药组（LPS+GYY4137/NaHS），每组10只。LPS溶于生理盐水，以10mg/kg的剂量通过腹腔注射造成小鼠的生精功能损伤模型，在给予LPS后1小时，将硫化氢供体GYY4137/NaHS溶于生理盐水，以GYY4137（50mg/kg）/NaHS（(50μmol/kg)的剂量通过腹腔注射给药。给药24小时后，牺牲小鼠，取小鼠附睾尾部的***，睾丸组织和血清进行相关参数的测定。
图4，图5，图6显示小鼠附睾尾部的***质量在给予硫化氢供体GYY4137前后的变化。图7，图8，图9显示小鼠附睾尾部的***质量在给予另外一种硫化氢供体NaHS前后的变化。结果表明LPS造成小鼠附睾尾部***的密度、活率和前向运动***率出现了明显下降，而给予硫化氢之后，这三项***质量指标均出现了明显恢复。
图10对小鼠睾丸组织做石蜡切片，进行苏木素-伊红染色观察睾丸生精结构的情况。如图显示，LPS刺激小鼠的睾丸生精结构紊乱，生***出现脱落，生精小管结构也被破坏。而给予硫化氢后，小鼠睾丸的组织结构基本正常，没有出现明显的脱落坏死区域。
图11，图12，图13和图14均显示小鼠睾丸组织促炎因子水平的变化情况。LPS刺激小鼠的睾丸中促炎因子IL-1β，IL-6和TNF-α的mRNA水平和iNOS的蛋白表达水平出现了明显的增高，硫化氢显著抑制了促炎因子水平的的增高。
图15显示小鼠睾丸组织抗炎因子水平的变化情况。结果表明H2S不仅抑制了促炎因子水平的增高，同时大大增加了抗炎的细胞因子IL-10的mRNA水平，提示硫化氢具有显著的抗炎作用。
图16对小鼠睾丸组织做冰冻切片，进行DHE染色观察小鼠睾丸组织中的活性氧水平。结果显示LPS引起小鼠睾丸组织中活性氧的水平大量增加，而硫化氢可以显著地抑制活性氧的增加。
图17对小鼠睾丸组织做石蜡切片，用原位末端转移酶标记技术（TUNEL）进行染色，观察生***的凋亡情况，如图所示LPS引起大量生***凋亡，而硫化氢可以显著地抑制生***凋亡。
图18对小鼠睾丸组织做冰冻切片，利用睾丸组织中构成血睾屏障的主要蛋白occludin、ZO-1和claudin11进行免疫荧光染色，观察睾丸组织血睾屏障的完整性，结果显示LPS使得大部分曲细精管中，血睾屏障蛋白的表达强度变弱，环状结构变得不完整，而给予H2S之后，尽管血睾屏障的结构不十分清晰，但是基本维持了其完整的环状结构。
图19取小鼠血清，利用商品化的酶联免疫吸附试验（Elisa）试剂盒检测小鼠血清睾酮的水平，结果显示硫化氢可以显著地抑制LPS引起的血清睾酮水平的降低。
Claims (3)
1.在体外非诊断治疗目的改善***运动能力的应用。
2.在体外培养液中非诊断治疗目的改善和维护***运动能力的应用。
3.在制备治疗改善***运动能力药物中的应用。
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