CN103728407B

CN103728407B - 一种Pyrifluquinazon残留量的测定方法

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Publication number: CN103728407B
Application number: CN201410025583.3A
Authority: CN
Inventors: 崔淑华; 汤志旭; 肖西志; 王英华; 王静; 王兴华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2015-08-26
Anticipated expiration: 2034-01-20
Also published as: CN103728407A

Abstract

本发明公开了一种Pyrifluquinazon残留量的测定方法，用乙腈或1%乙酸乙腈均质提取样品中残留的Pyrifluquinazon，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）和石墨化碳（Carb）基质分散净化后，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用空白基质溶液稀释标准建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为85.3%～92.0%，平均相对标准偏差（RSD）为3.5%～6.1%，检出限低于0.38 μg/kg，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足韩国、日本、欧盟等国家对相应产品安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种Pyrifluquinazon残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种Pyrifluquinazon残留量的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定性定量测定蔬菜、水果和茶叶中残留的Pyrifluquinazon含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

Pyrifluquinazon系日本农药公司发明，并于日本组合化学公司联合开发的具双酰胺结构的新喹唑啉类杀虫剂，主要用于防治蔬菜、果树和茶叶上蚜虫类、粉虱类、粉蚧类、叶蝉类、蓟马类等刺吸性害虫。化学名为1-乙酰基-3,4-二氢-3-[(3-吡啶基甲基)氨基]-6-[1,2,2,2-四氟-1-（三氟甲基）乙基]-2-(1H)-喹唑啉酮，CAS登录号为337458-27-2，结构式为：

Pyrifluquinazon于2010年10月20日在日本登记用于蔬菜、茶树和果树等18种作物，防治20余种害虫。2013年1月美国环保署于建议批准Nichino America公司的新杀虫剂原药pyrifluquinazon登记用于温室观赏作物防控吮吸害虫如蚜虫，牧草虫，粉虱等。该药剂作用机理是使害虫停止取食进而饿死，能防止植物组织遭受更多的损害，同时限制一些重要病害的传播。鉴于该药剂具有新颖作用机制，能很好地防治对已知杀虫剂敏感性下降的害虫，并对各种天敌十分安全，因此十分适用于害虫抗性管理和综合治理，具有很好的应用前景和很大的应用市场。

Pyrifluquinazon虽然对神经毒性和遗传毒性作用不大，但对睾丸、肝和血压有毒性作用。因此，作为我国蔬菜、水果等农产品主要出口市场的韩国和日本对其制定了残留限量标准。韩国规定Pyrifluquinazon在苹果和梨上的最大允许残留量为0.05mg/kg；日本制定了pyrifluquinazon以及代谢物B〔1，2，3，4-四氢-3-[(3-吡啶甲基)胺]-6-[1，2，2，2-四氟-1-（三氟甲基）乙基]喹唑啉-2-one〕换算为pyrifluquinazon的和的残留限量标准，规定在苹果、梨、土豆上的残留限量分别为0.5、1、0.2mg/kg，其余均实行0.01mg/L的“一律标准”；欧盟对pyrifluquinazon实行0.01mg/L的“一律标准”。

迄今为止，国外仅有1篇关于食品中Pyrifluquinazon残留量检测方法的报道，该检测方法采用乙腈提取，液液分配和硅胶固相萃取柱净化后，液相色谱-紫外检测器（HPLC-UVD）对Pyrifluquinazon残留量进行检测。由于食品基质较复杂，对农药残留进行分析时最好采用能进行准确定性的检测方法，如气相色谱质谱或液相色谱串联质谱法，同时，为提高检测效率和检测准确度，建立简便、快速、能准确定性和定量分析蔬菜、水果和茶叶中Pyrifluquinazon残留量检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔬菜、水果和茶叶中Pyrifluquinazon残留量的测定方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种Pyrifluquinazon残留量的测定方法，包括如下步骤：

（1）提取

称取样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠，振荡后离心。

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜。

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在0.5～200μg/L范围内，配制至少5个浓度的Pyrifluquinazon系列浓度标准工作液。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中Pyrifluquinazon的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中Pyrifluquinazon含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中Pyrifluquinazon残留量。若上机溶液中Pyrifluquinazon残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

步骤（1）中样品若为脱水果蔬或茶叶，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈、PSA和Carb组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈、PSA和Carb加入量分别为150mg、25mg、25mg和7.5mg。

步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量5μL。

步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	60-80	20-40
2	1.0	4-10	90-96
				3	4.5	4-10	90-96
4	4.6	60-80	20-40
				5	11.0	60-80	20-40

A和B的%是体积比例。

步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃。

步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱（ESI）检测，电喷雾电压为+3500至+4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，Pyrifluquinazon的母离子为465.0～465.4，子离子分别为422.9～423.3和91.8～92.2。

步骤（4）中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液（样品）中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于蔬菜、水果和茶叶中Pyrifluquinazon定性确证和定量检测，平均回收率为85.3%～92.0%，平均相对标准偏差（RSD）为3.5%～6.1%，检出限低于0.38μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足韩国、日本、欧盟等国家对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为浓度为5.0ng/mL的Pyrifluquinazon多反应监测色谱图。

图2为苹果空白样品的多反应监测色谱图。

图3为茶叶空白样品的多反应监测色谱图。

图4为以苹果为基质配制的Pyrifluquinazon标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器（IKA，Germany）；5810R离心机（Eppendorf，Germany）；MS3基本型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附剂（40～60μm）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）净化剂（40～60μm）、石墨化碳吸附剂（120～400μm）均购于美国安捷伦科技有限公司。

试剂：乙腈（HPLC级，Merke，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；

无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：100mg/L，乙腈配制，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

实施例1：苹果中Pyrifluquinazon残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的苹果10.0g于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，5000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、50mg C₁₈、50mg PSA和15mgCarb的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min。取上清液过0.22μm滤膜后，待测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取10g苹果空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将100ng/mL标准溶液用乙腈稀释成10ng/mL标准中间液，标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行Pyrifluquinazon含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中Pyrifluquinazon的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中Pyrifluquinazon含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中Pyrifluquinazon物残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Agilent，Eclipse plus C₁₈，2.1mm×100mm，粒径3.5μm；

流动相：（A）水（含5mmol/L乙酸铵）；（B）乙腈；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序如表1。

表1：实施例1的梯度洗脱程序

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	70	30
2	1.0	5	95
				3	4.5	5	95
4	4.6	70	30
				5	11.0	70	30

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描；

电喷雾电压：+4000V；

雾化气压力：275.9kPa；

干燥气：氮气，350℃，流速为10.0L/min；

MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：

对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3苹果空白基质中Pyrifluquinazon的标准曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				Pyrifluquinazon	4.07	Y=2421.9X-1007.5	0.9999

加标回收率和重复性：

在不含Pyrifluquinazon的苹果中加入10、20、50和500μg/kg4个浓度水平的Pyrifluquinazon标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，500μg/kg添加浓度的样品待测液用乙腈稀释5倍后再用LC-MS/MS测定。。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，Pyrifluquinazon的平均回收率为88.1%～92.0%，平均相对标准偏差（RSD）为3.5%～6.1%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4Pyrifluquinazon的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的Pyrifluquinazon基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（苹果的浓缩倍数为0.5倍）计算检出限，Pyrifluquinazon的检出限为0.069μg/kg。

实施例2：茶叶中pyrifluquinazon残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的茶叶2.0g于50mL离心管中，加入5mL水复苏30min后，准确加入20mL1%乙酸乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁、2g乙酸钠和3mL水，涡旋1min后，5000r/min离心5min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、50mg C₁₈、50mg PSA和15mgCarb的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min，过0.22μm滤膜于棕色进样小瓶，待LC-MS/MS测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取2g茶叶空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，过膜后用其稀释配制0.5、1、2、5、10、20、50ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

操作步骤、色谱和质谱条件与上述苹果样品中pyrifluquinazon的测定一致。

定性鉴定：

同上述苹果样品中pyrifluquinazon的测定一致。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为Y=2206.7X-812.48，相关系数为0.9996。

加标回收率和重复性：

在不含pyrifluquinazon的茶叶中加入10、20和100μg/kg3个浓度水平的pyrifluquinazon标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在3个加标水平上，pyrifluquinazon的平均回收率为85.3%～91.4%，平均相对标准偏差（RSD）为3.9%～5.1%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表5pyrifluquinazon的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的pyrifluquinazon基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（茶叶的浓缩倍数为0.1倍）计算检出限，pyrifluquinazon的检出限为0.38μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种Pyrifluquinazon残留量的测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)试样处理：称取粉碎样品于具塞离心管中，加入乙腈或1％乙酸乙腈均质提取1min，加入氯化钠或乙酸钠中的一种与无水硫酸镁和水振荡离心后，移取提取上清液于离心管中，每毫升提取液中加入150mg无水硫酸镁、25mg C₁₈、25mg PSA和7.5mgCarb进行基质分散固相萃取净化，将净化液过0.22μm有机相滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定；

(2)检测：采用液相色谱-串联质谱法，其中：

液相色谱条件为：色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃；流动相为：含5mmol/L乙酸铵的水溶液和乙腈，梯度洗脱；梯度洗脱程序为：

时间(min) 5mmol/L乙酸铵的水溶液(体积百分比) 乙腈(体积百分比) 0 70 30 1.0 5 95 4.5 5 95 4.6 70 30 11.0 70 30

质谱条件为：电喷雾质谱检测；电喷雾电压为+3500V至+4500V；雾化气压力为275.9kPa；干燥气为氮气；干燥气温度为350℃；干燥气流速为10.0L/min；多反应监测(MRM)扫描模式：Pyrifluquinazon的母离子为465.0～465.4，子离子分别为422.9～423.3和91.8～92.2；

(3)标准工作溶液的配制

将不含Pyrifluquinazon的同种类基质空白样品按上述步骤(1)处理，用该基质空白样品溶液在0.5～200μg/L范围内，配制至少5个浓度的Pyrifluquinazon系列浓度标准工作液；

(4)测定和结果计算

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到基质标准工作曲线；在相同条件下将步骤(1)中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中Pyrifluquinazon的色谱峰面积，代入基质标准曲线，得到样品液中Pyrifluquinazon含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中Pyrifluquinazon残留量。