CN103725677B - 组织特异性启动子及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种组织特异性启动子及其用途，组织特异性启动子的核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：（a）同时具有SEQ？ID？NO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列；（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明组织特异性启动子首次分离自籼稻品种93-11的ABCG15基因；同时，能够调控目的异源核苷酸序列特异性表达于植物花药组织中，特别是绒毡层组织，为创制新型雄性不育系奠定了基础。

Description

组织特异性启动子及其用途

技术领域

本发明涉及一种组织特异性启动子及其用途，特别是涉及一种花药绒毡层组织特异性表达的籼稻ABCG15基因的启动子及其用途。

背景技术

异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于具有在植物宿主中起作用的可操作地连接的启动子。启动子序列的选择将决定异源DNA序列在植物宿主中表达的时间和位置。因此，当需要在植物优选的组织中表达时，使用组织特异性启动子。相反，当需要在全部植物细胞中表达时，使用组成型启动子。例如，通过对植物基因组的遗传操纵，使之含有与异源抗虫基因可操作连接的组织特异性启动子，使得抗昆虫物质在易感植物组织中特异地表达，可以实现植物对昆虫侵袭的抗性增加。异源核苷酸序列在目标组织中的优先表达减少了组成型启动子在全部植物细胞中启动异源核苷酸序列转录所发生的植物资源消耗。

花药是雄蕊产生花粉的主要部分，花药的壁由表皮层、纤维层、中间层和绒毡层构成。绒毡层为花粉囊周围的特殊细胞层，具双核或多核结构，细胞内含较多的RNA和蛋白质，并有油脂和类胡萝卜素等营养物质，具有供应花粉粒发育所需养料的作用。在某些情况下，人们希望某些重要的功能基因仅在花药组织中特异表达。例如，在杂交制种过程中，花药作为花粉的供给者使其成为创制新型雄性不育系的关键，因此需要有与影响花药和花粉发育相关的异源核苷酸序列可操作连接的花药组织特异性表达启动子。

ABCG15属于ABC（ATPBindingcassette）转移蛋白G亚家族成员（PaulJ.Verrieretal.TrendsinPlantScience2008.13（14）：151-159），已报道ABCG15基因的启动子作为花药绒毡层组织特异性表达启动子从粳稻中分离并进行鉴定，至今未有来源于籼稻ABCG15基因启动子的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种组织特异性启动子及其用途，即新的分离自籼稻品种93-11的ABCG15基因启动子，使目的异源核苷酸序列能够在光合组织中高效特异表达。

为实现上述目的，本发明提供了一种组织特异性启动子，其核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：

（a）同时具有SEQIDNO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列；

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

进一步地，所述组织特异性启动子的核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：

（a）具有SEQIDNO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列；

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

优选地，所述组织特异性启动子的核苷酸序列包括如下（a）或（b）的序列：

（a）具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

上述严格条件可为在6×SSC（柠檬酸钠）、0.5%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含与目的异源核苷酸序列可操作地连接的所述组织特异性启动子的表达盒。

进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述表达盒的DNA构建体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述DNA构建体的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述重组载体的宿主细胞。

为实现上述目的，本发明还提供了一种在其细胞中含有所述表达盒的植物的花药组织。

进一步地，所述植物为玉米、高粱、大麦、燕麦、水稻或小麦。

为实现上述目的，本发明还提供了一种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，包括：将与所述组织特异性启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳定的整合进植物细胞中。

进一步地，所述植物为玉米、高粱、大麦、燕麦、水稻或小麦。

优选地，所述目的异源核苷酸序列在花药组织中表达。更优选地，所述花药组织为绒毡层组织。

进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

优选地，所述目的异源核苷酸序列编码控制植物育性的蛋白质。所述控制植物育性的蛋白质为控制植物雄性不育的蛋白质。所述控制植物雄性不育的蛋白质为影响花药和/或花粉发育的蛋白质。

为实现上述目的，本发明还提供了一种所述组织特异性启动子用于在植物花药组织中优先表达目的异源核苷酸序列的用途。

优选地，所述植物为玉米、高粱、大麦、燕麦、水稻或小麦。

进一步地，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

本发明中术语“启动子”是指DNA调节区，通常含有能够引导RNA聚合酶II在特定编码序列的适合转录起始位点启动RNA合成的TATA盒。启动子可另外含有其它的识别序列，一般位于TATA盒的上游或5’端，称作上游启动子元件，它们影响转录起始速率。公认地，由于本发明启动子区域核苷酸序列己经确定，从本发明具体启动子区域上游的5’非翻译区内进一步分离和鉴定调节元件属于现有技术。因此，本发明启动子区域进一步包括上游调节元件，它赋予与本发明启动子序列可操作地连接的任何异源核苷酸序列组织特异性表达，优选是在花药组织中特异性表达，更优选地在绒毡层组织中特异性表达。

本发明中术语“基因”是指在适宜的调控区域（例如植物可表达性启动子区域）控制下在细胞内含有被转录成RNA分子（例如mRNA）的DNA区域（“转录的DNA区域”）的任何DNA片段。因此，基因可能含有几种可操作性连接的DNA片段，例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区域和含有多聚腺苷酸化位点的3’非翻译区域。内源植物基因是在植物物种中天然发现的基因。嵌合基因是通常不在植物物种中发现的任何基因，或者是在天然情况下其启动子与部分或全部转录的DNA区域或者与该基因的至少另一调控区域无关的任何基因。

本发明分离的启动子序列的特征是提供目的异源核苷酸序列的花药组织特异性表达。所述花药组织为花丝顶端膨大呈囊状的部分，是雄蕊产生花粉的主要部分，花药的壁由表皮层、纤维层、中间层和绒毡层构成。绒毡层为花粉囊周围的特殊细胞层，具双核或多核结构，细胞内含较多的RNA和蛋白质，并有油脂和类胡萝卜素等营养物质，具有供应花粉粒发育所需养料的作用。本发明中术语“花药组织特异性”是指为特定目的，目的异源核苷酸序列在植物（例如水稻植物（“水稻花药组织特异性”））花药组织细胞中的高度特异性表达。换言之，目的异源核苷酸序列主要在植物的花药组织中表达，植物的非花药组织中的DNA转录物水平是无法检测到的或是非常低的（每微克总RNA低于约0.2皮克）。

本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用功能上等价的启动子。具有本质上与含有本发明SEQIDNO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQIDNO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQIDNO:1所示的核苷酸序列、或具有启动子活性部分的核苷酸序列的籼稻ABCG15基因启动子相似的启动子活性的DNA序列，是这些启动子的功能等价物。这些功能等价启动子能在严格条件下与含有上述核苷酸序列的籼稻ABCG15基因启动子区域杂交。

在杂交技术中，己知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，与来自被选生物体的克隆基因组DNA片段或cDNA片段（如基因组文库或cDNA文库）群体中存在的其它对应核苷酸序列选择性地杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可以被可探测的基团如³²P或其它任何可探测标记物标记。因此，例如，通过标记根据本发明序列的合成寡核苷酸可以制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA和基因组文库的方法为本领域己知并公开于Sambrook等人（1989）分子克隆：实验室手册（第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork）。

序列的杂交可在严格条件下进行。所述“严格条件”是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交（如至少2倍于背景）的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列（同源探测）。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性（异源探测）。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH7.0至8.3下盐浓度低于大约1.5MNa离子，典型地大约0.01至1.0MNa离子浓度（或其它盐类），温度对短探针（如10至50个核苷酸）至少大约30℃，对长探针（如超过50个核苷酸）至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS（十二烷基磺酸钠）的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC（20×SSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠）中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45%甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1%至1%的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4至12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以从Meinkoth和Wahl（1984）Anal.Biochem.138：267-284的方程估算：T_m=81.5℃+16.6（logM）+0.41（%GC）-0.61（%form）-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，%GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，%form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。T_m是50%互补靶序列与完全配对探针杂交的温度（在规定的离子强度和pH下）。每1%的错配需T_m降低大约1℃；因此，T_m杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90%的同一性，T_m可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度（T_m）大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度（T_m）1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度（T_m）6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度（T_m）11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的T_m，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使T_m低于45℃（水溶液）或32℃（甲酰胺溶液），优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen（1993）生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交，第I部分，第2章（Elsevier，NewYork）；和Ausubel等人编辑（1995）分子生物学现代方法第2章（GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork）。见Sambrook等人（1989）分子克隆：实验室手册（第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，NewYork）。

因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明启动子序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性。

其它功能等价启动子含有这样的核苷酸序列，即能用含有SEQIDNO:1的第920-932位核苷酸、第947-961位核苷酸、第1507-1519位核苷酸、第1963-1971位核苷酸和第2018-2028位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQIDNO:1的第900-2066位核苷酸所示的核苷酸序列、或SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的至少约25、优选至少约50、特别是至少约100个连续核苷酸的寡核苷酸引物在聚合酶链式反应中扩增的核苷酸序列。

还可以构建人工启动子，其包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的5’调控区域的决定启动子的花药组织特异性的内部序列。所述人工启动子可能包含能在植物中表达的另一启动子的“核心启动子”或“TATA盒区域”，例如WO93/19188中所述的CaMV35S“TATA盒区域”。含有所述人工启动子的启动子区域的适用性可以通过它们与目的异源核苷酸序列的适当融合以及目的异源核苷酸序列在适宜组织、适当发育阶段的表达的检测进行鉴定。

本发明所述的启动子序列及其片段，当组装进DNA结构使启动子序列与目的异源核苷酸序列可操作地连接时，用于遗传性操控任何植物。所述“可操作地连接”是指本发明的启动子序列与第二个序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和调节对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接是指被连接的核酸序列是连续的，必要时相邻地结合两个蛋白编码区，并在同一个阅读框内。以此方式，启动子核苷酸序列与目的异源核苷酸序列构成所述嵌合基因在表达盒中一起提供，以在目的植物中表达。这种表达盒提供了大量限制性位点以***目的异源核苷酸序列，所述目的异源核苷酸序列将受到包含本发明启动子序列的调节区的转录调节。表达盒可另外含有至少一个将共转化进生物体的附加基因。可选择地，附加基因可以在多个表达盒上被提供。

表达盒可另外含有可选择的标记基因。一般地，表达盒将包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。所述选择性标记基因用于选择转化的细胞或组织。所述选择性标记基因包括但不限于，编码抗生素抗性的基因（如编码新霉素磷酸转移酶II（NPT））、磷酸甘露糖异构酶（PMI）的基因和潮霉素磷酸转移酶（HPT）的基因，以及赋予除草剂抗性的基因如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮类和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。

表达盒包括沿5’-3’方向转录的本发明的启动子序列、翻译起始区、目的异源核苷酸序列和在植物中起作用的转录和翻译终止区。目的异源核苷酸序列可以是天然的或对植物宿主外源的或异源的。可选择地，目的异源核苷酸序列可以是天然序列或选择性合成序列。“外源”是指在导入转录起始区的天然植物中不存在所述的导入转录起始区。例如，嵌合基因包含本发明的启动子序列，本发明的启动子序列可操作地与不同于本发明的启动子序列的编码序列连接。

终止区可来源于本发明的启动子序列，也可来源于可操作连接的目的异源核苷酸序列，或可来源于另外的来源。传统的终止区可从土壤农杆菌的Ti质粒获得，如肉碱合成酶和胭脂碱合成酶（NOS）终止区。

在表达盒制备中，可以操控不同的DNA片段以提供适当方向的DNA序列，并在适合的时候提供适当的阅读框。所以，可应用接受子或连接子结合DNA片段，或可进行其它操控以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此目的，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再取代，如转变和转换。

在适合的情况下，目的异源核苷酸序列可被优化以增加在转化植物中的表达量。即可用植物优选的密码子合成基因以改善表达。

本领域公知的，另外的序列修饰可提高细胞宿主中的基因表达水平。这些包括但不限于，去除编码假性聚腺苷信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子的重复序列，以及其它充分表征出可能不利于基因表达的序列。序列的G-C含量可调节到指定宿主细胞的平均水平，引用宿主细胞中己知的基因表达水平进行计算。可能地，修饰序列以避免预测的发夹式mRNA二级结构。

在表达盒或重组载体中，表达盒可另外含有5’前导序列。所述前导序列可以起改进转录效率的作用。所述前导序列为本领域已知的，包括但不限于，细小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列（脑心肌炎5’非编码区）；马铃薯病毒组前导序列，例如烟草蚀刻病毒（TEV）前导序列、玉米矮小花叶病毒（MDMV）前导序列和人免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP）；来自紫花苜蓿花叶病毒包被蛋白mRNA（AMVRNA4）的非翻译前导序列；烟草花叶病毒（TMV）前导序列；和玉米萎黄病斑点病毒（MCMV）前导序列。还可以使用其它己知的改进转录效率的元件，例如内含子等。

本发明的启动子序列可用来启动与目的异源核苷酸序列的信使RNA（mRNA）至少部分互补的反义结构的转录。构建反义核苷酸序列以与相应的mRNA杂交。只要反义序列长到可与相应的mRNA杂交并干扰其表达，就可进行反义序列的修饰。以此方式，可以使用与相应的反义序列具有70%，优选的80%，更优选的85%序列同一性的反义结构。此外，反义核苷酸序列的一部分可被用来破坏靶基因的表达。一般，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。

本发明的启动子序列还可用于启动正义方向的核苷酸序列的转录以抑制植物中内源性基因的表达。应用正义方向的核苷酸序列在植物中抑制基因表达的方法为本领域己知。该方法通常涉及用含启动子的DNA结构转化植物，启动子可操作地连接至少一部分相当于内源性基因转录体的核苷酸序列，并驱动其在植物中表达。典型地，所述核苷酸序列与内源性基因转录体的序列具有实质上地序列同一性，优选地超过大约65%序列同一性，更优选地超过大约85%序列同一性，最优选地超过大约95%序列同一性。

本发明的启动子序列被用于目的异源核苷酸序列的组织特异性表达。“异源核苷酸序列”是指非天然地与启动子序列一起存在的序列。虽然所述核苷酸序列与启动子序列是异源的，但对植物宿主可能是同源的或天然的或异源的或外源的。可操作地与本发明的启动子连接的异源核苷酸序列可编码目的蛋白质。这种异源核苷酸序列的实例包括但不限于，编码赋予以下抗性多肽的核苷酸序列：非生物应激如干旱、温度、盐度、臭氧和除草剂，或生物应激如病原体侵袭，包括昆虫、病毒、细菌、真菌和线虫类，并防止产生这些生物体伴随的疾病；还可以编码控制植物育性的蛋白质，优选控制植物雄性育性的蛋白质。

对于雄性育性来说关键的基因很多，包括中止孢子发育（AbortedMicrospores，即AMS）基因、NEF1基因、AtGPAT1基因、dde2-2突变（其显示出丙二烯氧化合酶基因的缺陷）、flp1（facelesspollen-1）基因、雄性母细胞死亡1（MaleMeiocyteDeath1）基因、绒毡层特异性锌指基因TAZ1、绒毡层决定因子1（TapetumDeterminant1）基因、MS1基因、DPW（MS2）基因、MS3基因、MS5基因、MS7基因、MS8基因、MS9基因、MS10基因、MS11基因、MS12基因、MS13基因、MS14基因、MS17基因、MS20基因、MS22基因、MS23基因、MS24基因、MS25基因、MS26基因、MS27基因、MS28基因、MS29基因、MS30基因、MS31基因、MS32基因、MS33基因、MS34基因、MS36基因、MS37基因、MS38基因、MS43基因、MS45基因、MS48基因、MS50基因。

此外，本发明中在植株雄性组织中表达的影响雄性生育力的核苷酸序列还可编码碳水化合物降解或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，例如α淀粉酶基因、植物生长素、rolB、细胞毒素、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素或者可选自原核调控***。举例而言，米曲霉（Aspergillusoryzae）的RNase-T1或解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）的RNase（被命名为“barnase”）在绒毡层中的表达诱导了绒毡层细胞的破裂，导致雄性不育。农杆菌（Arobacteriumrhizogenes）的rolB基因编码通过从吲哚酚-β-甙释放游离吲哚从而干扰生长素代谢的酶。有研究表明，烟草中rolB基因的花粉囊特异性表达产生了花粉囊枯萎的植株，其中，花粉的产生大大减少，因此rolB基因是可用于控制花粉产生的基因的示例。

转化方案以及将核苷酸序列导入植物的方案依定向转化的植物或植物细胞类型而异，即单子叶植物或双子叶植物。将核苷酸序列导入植物细胞并随后***植物基因组中的适合方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

已经转化的细胞可按照常规的方式生长成植物。这些植物被培育，用相同的转化株或不同的转化株授粉，得到的杂交体表达所需的被鉴定的表现型特征。可培育二代或多代以保证稳定地保持和遗传所需表现型特征的表达，然后收获可保证得到所需表现型特征表达的种子。

本发明提供了一种组织特异性启动子及其用途，具有以下优点：

1、首次分离。本发明组织特异性启动子首次分离自籼稻品种93-11的ABCG15基因。

2、组织特异性表达。本发明组织特异性启动子能够调控目的异源核苷酸序列特异性表达于植物花药组织中，特别是绒毡层组织，为创制新型雄性不育系奠定了基础。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明组织特异性启动子及其用途的重组克隆载体pT-prOsATS1构建流程图；

图2为本发明组织特异性启动子及其用途的重组表达载体DBN-prOsATS1构建流程图；

图3为本发明组织特异性启动子及其用途的突变体植株Osats1的形态学观察图；

图4为本发明组织特异性启动子及其用途的突变体植株Osats1的花粉发育图；

图5为本发明组织特异性启动子及其用途的转基因水稻植株-ATS1的花粉发育图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明组织特异性启动子及其用途的技术方案。

第一实施例、Osats1突变体植株的获得和形态学观察

突变体植株Osats1（四川农业大学合作项目获得）是在籼稻杂交选育过程中鉴定发现的自然突变材料，该材料在植株营养生长阶段与野生型没有显著差异（图3），但是花药在发育早期受到抑制，在花发育后期花药呈现白色，瘦瘪，最终无法产生花粉，表现为完全的雄性不育（图4）。

第二实施例、花药特异性表达启动子prOsATS1的获得及分析

通过精细定位发现Osats1突变体植株由ABCG15基因（Loc_Os06g40550；如序列表中SEQIDNO:2所示）中删除12bp引起的功能缺失突变体，突变体植株Osats1的序列如序列表中SEQIDNO:3所示。

分析发现，位于精细定位的ABCG15基因上游2066bp具有RNA聚合酶识别位点，如序列表中SEQIDNO:1所示，命名为prOsATS1。该启动子特异地表达在花药中，特别是绒毡层组织。

通过NSITE-PL在线预测发现prOsATS1（SEQIDNO:1）上包括5个核心调控元件（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=nsitep&group=programs&subgroup=promoter），具体信息见表1：

表1：prOsATS1的核心调控元件预测表

编号	位置	调控元件	调控元件结合因子
				1	920-932bp	WRKY11BS2	WRKY11
2	947-961bp	E2F BS	E2F
				3	1507-1519bp	CytRE	unknown nuclear factor
4	1963-1971bp	Sph-core	VP1(VIVAPAROUS1)
				5	2018-2028bp	GA-5	BPC1

由此可知，prOsATS1的核心调控序列为序列1的第900-2066位，该段序列很可能是prOsATS1上可用于恢复Osats1突变体花粉育性的最短序列。

第三实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有prOsATS1启动子序列的重组克隆载体

将prOsATS1启动子序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体pT-prOsATS1，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；prOsATS1为prOsATS1启动子序列（SEQIDNO:1）；MCS为多克隆位点）。

然后将重组克隆载体pT-prOsATS1用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体pT-prOsATS1），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100毫克/升）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mMTris-HCl，10mMEDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入150μl新配制的溶液II（0.2MNaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（4M醋酸钾，2M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mMTris-HCl，1mMEDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经NotI和SacII酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体pT-prOsATS1中***的所述prOsATS1启动子序列为序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，即prOsATS1启动子序列正确***。

2、构建含有prOsATS1启动子的重组表达载体

用限制性内切酶SacI和KpnI分别酶切重组克隆载体pT-prOsATS1和表达载体DBNBC-01（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）），将切下的prOsATS1启动子序列片段插到表达载体DBNBC-01的SacI和KpnI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN-prOsATS1，其构建流程如图2所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；prOsATS1：籼稻ABCG15基因启动子（SEQIDNO:1）；gOsATS1：籼稻ABCG15基因（SEQIDNO:2）；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQIDNO:4）；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素）基因启动子（SEQIDNO:5）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQIDNO:6）；LB：左边界）。

将重组表达载体DBN-prOsATS1用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体DBN-prOsATS1），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶SacI和KpnI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN-prOsATS1在SacI和KpnI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示核苷酸序列，即prOsATS1启动子序列。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN-prOsATS1用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶AhdI和XbaI进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN-prOsATS1结构完全正确。

第四实施例、转基因水稻植株的获得及分析

1、获得转基因水稻植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的具有纯合隐性等位基因ABCG15的籼稻突变体Osats1（四川农业大学合作项目获得）的愈伤组织与第三实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第三实施例中2构建的重组表达载体DBN-prOsATS1中的T-DNA（包括prOsATS1启动子序列、OsATS1基因、玉米Ubiquitin基因的启动子序列、PMI基因和Nos终止子序列）转入到水稻染色体组中，获得了转基因水稻植株-ATS1。

对于农杆菌介导的水稻转化，简要地，把水稻种子接种在诱导培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、麦芽糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，从水稻成熟胚诱导出愈伤组织（步骤1：愈伤诱导步骤），之后，优选愈伤组织，用农杆菌悬浮液接触愈伤组织，其中农杆菌能够将所述介导植物生育力的构建体传递至愈伤组织上的至少一个细胞（步骤2：侵染步骤）。在此步骤中，愈伤组织优选地浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.3，侵染培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、pH5.4））中以启动接种。愈伤组织与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤3：共培养步骤）。优选地，愈伤组织在侵染步骤后在固体培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，有一个“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤4：恢复步骤）。优选地，愈伤组织在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的愈伤组织在含选择剂（甘露糖）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤5：选择步骤）。优选地，愈伤组织在有选择剂的筛选固体培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）2mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤6：再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（N6分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述N6分化培养基（N6盐3.1g/L、N6维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、甘露糖5g/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸1mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝胶3g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养。

2、分析转基因水稻植株

分别种植转基因水稻植株-ATS1和野生型水稻植株。实验结果表明：与野生型水稻植株相比，转基因水稻植株-ATS1不仅植株营养生长没有显著差异，而且通过使用prOsATS1驱动OsATS1蛋白表达，花药发育正常，并且能够100%恢复其缺失突变体的花粉育性，可以正常结实（图5）。

综上所述，本发明组织特异性启动子首次分离自籼稻品种93-11的ABCG15基因；同时，能够调控目的异源核苷酸序列特异性表达于植物花药组织中，特别是绒毡层组织，为创制新型雄性不育系奠定了基础。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (15)

1.一种组织特异性启动子，其特征在于，其核苷酸序列选自如下(a)或(b)的序列：

(a)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；

(b)与(a)限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.一种包含与目的异源核苷酸序列可操作地连接的权利要求1所述组织特异性启动子的表达盒。

3.根据权利要求2所述表达盒，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

4.一种包含权利要求2或3所述表达盒的DNA构建体。

5.一种包含权利要求4所述DNA构建体的重组载体。

6.一种在其细胞中含有权利要求2或3所述表达盒的植物的花药组织，所述植物为玉米或水稻。

7.一种在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，包括：将与权利要求1所述组织特异性启动子可操作地连接的目的异源核苷酸序列稳定的整合进植物细胞中，所述植物为玉米或水稻。

8.根据权利要求7所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列在花药组织中表达。

9.根据权利要求8所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述花药组织为绒毡层组织。

10.根据权利要求7所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。

11.根据权利要求10所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码控制植物育性的蛋白质。

12.根据权利要求11所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述控制植物育性的蛋白质为控制植物雄性育性的蛋白质。

13.根据权利要求12所述在植物中表达目的异源核苷酸序列的方法，其特征在于，所述控制植物雄性育性的蛋白质为影响花药和/或花粉发育的蛋白质。

14.一种权利要求1所述组织特异性启动子用于在植物花药组织中优先表达目的异源核苷酸序列的用途，所述植物为玉米或水稻。

15.根据权利要求14所述组织特异性启动子用于在植物花药组织中优先表达目的异源核苷酸序列的用途，其特征在于，所述目的异源核苷酸序列编码目的蛋白质。