CN103725621A

CN103725621A - 一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株

Info

Publication number: CN103725621A
Application number: CN201310612979.3A
Authority: CN
Inventors: 李佩佩; 康丽华; 王华明; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103725621B

Abstract

本发明通过将枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因导入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达甘露聚糖酶，摇瓶发酵酶活达912U/mL。重组甘露聚糖酶的最适作用pH为4，最适作用温度为58℃，可广泛用于饲料添加剂领域。

Description

一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株及其应用。

背景技术

甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。它不仅能够降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率；同时，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有所提高。

甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其它植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖含量分别为22.7％、11.9％、19.6％和33.7％。

我国猪、鸡的主要日粮是玉米-豆粕型日粮，尽管猪、鸡等单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％。单胃动物对豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有的22.7％的半纤维素是不能被单胃动物消化的非淀粉多糖。饲料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖，降低消化道内容物粘度，破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高内源酶的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。因此，目前对甘露聚糖酶的研究是热点内容。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘露聚糖酶的重组表达菌株，本发明通过将来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的甘露聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到了高效重组表达甘露聚糖酶的工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌，其携带有能表达甘露聚糖酶的重组质粒。

所述重组质粒含有枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因。

所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

本发明的另一方面涉及上述甘露聚糖酶在饲料中的应用。

本发明通过将枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因导入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达甘露聚糖酶，摇瓶发酵酶活达912U/mL。重组甘露聚糖酶的最适作用pH为4，最适作用温度为58℃。通过在日粮中添加本发明的甘露聚糖酶，实验组肉鸡日增重、育肥指数比正对照组分别高2%、2.6%，料肉比比正对照组降低了5.6%，说明本发明的甘露聚糖酶能显著提高饲料的利用率，提高肉鸡的日增重和育肥指数，降低料重比，从而可以减少畜禽养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1 甘露聚糖酶基因的克隆

挑取新鲜的枯草芽孢杆菌CGMCC1.897（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心）单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，按照Tiangen 细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明提取染色体。

根据NCBI上甘露聚糖酶同源序列设计引物，以枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体为模板，利用上下游引物进行扩增，扩增条件为： 94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将该产物命名为Man-1。

将Man-1克隆至pMD18-T载体，构建得到质粒pT-Man-1，送至北京华大基因测序中心进行测序，测得Man-1基因序列为SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。将该序列进行NCBI同源序列比对，确定Man-1基因为一新的甘露聚糖酶基因，与现有公开序列相似性最高为88%。

实施例2 表达载体的构建

以质粒pT-Man-1为模板，利用引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1.2min 30个循环；72℃ 7min。凝胶回收扩增产物；Eco RI和Not I双酶切。对表达质粒pPIC9K也进行Eco RI和Not I双酶切；用T4连接酶把上述双酶切产物4℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-Man-1。

实施例3 毕赤酵母工程菌的构建

将表达质粒pPIC-Man-1用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1 mL预冷的电泳缓冲液中(含1mM MgCl₂，10mM HEPES, 250mM 蔗糖, pH 7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇），挑选一个重组菌株，命名为毕赤酵母Man-1（Pichia pastoris Man-1）。

实施例4 发酵和酶学性质测定

将毕赤酵母工程菌Man-1接种于5ml BMGY ( 1％酵母提取物，2％蛋白陈， 1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，l％甘油）, 30℃ 培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加50μL甲醇，诱导培养5天，200rpm，离心5分钟，取发酵液上清液，进行酶学性质和耐受性分析。

甘露聚糖酶酶活测定方法如下所述：

以0.6%槐豆胶甘露聚糖（Sigma公司, Batch#125K0091）为底物，以0.1M 醋酸-醋酸钠（pH5.5）为缓冲液，将甘露聚糖底物37℃平衡20min，将待测酶液37℃平衡10min。取4支试管，分别加入酶液2ml，其中3支作为测定管，分别加入2ml 底物溶液，另一支作为空白管，加入5ml DNS溶液，在37℃±0.5℃水浴30分钟。然后三支测定管分别加入5ml DNS溶液，空白管加入2ml 底物溶液，在沸水浴中反应5分钟，冷却后定容至25ml。以空白管调零，在分光光度计540nn 处测吸光度。

甘露聚糖酶酶活定义：在37℃、pH5.5的条件下，每分钟水解底物产生1μmol甘露糖所需酶液的量为一个甘露聚糖活性单位。蛋白含量测定参照Bradford法。

按照上述测定方法测定发酵液上清的酶活为912U/mL，说明本发明构建的毕赤酵母工程菌能高效重组表达甘露聚糖酶。

、最适pH分析

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定，在温度55℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组甘露聚糖酶的最适pH值为 4.0。

、最适温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.5的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组甘露聚糖酶的最适温度为58℃。

实施例5 本发明的甘露聚糖酶在畜禽养殖中的应用

本实验在肉鸡商品日粮基础上降低150kcal/kg的代谢能，然后在日粮中添加本发明的重组甘露聚糖酶。通过对肉鸡生产性能的评价，探讨甘露聚糖酶对低能日粮能量利用率的改善幅度。

采购1日龄罗氏308白羽肉公鸡，分为正负对照组和实验组，每个处理组16个重复，每个重复8羽鸡，生产试验期为35天；正对照组：正常商品日粮处理组；负对照组：在对照日粮基础上降低150kcal/kg代谢能；试验组：在负对照日粮基础上添加100-200克/吨本发明的重组甘露聚糖酶（50000U/g），试验结果如下表所示：

组别	日增重(g)	料肉比	育肥指数
				正对照组	70.11±4.76	1.59±0.18^b	340.12±40.69
负对照组	67.12±2.06	1.63±0.23^b	331.42±30.33
				实验组	71.50±4.80	1.50±0.11^a	349.07±39.85

实验结果显示，在减少日粮能量值的条件下，通过在日粮中添加甘露聚糖酶，实验组肉鸡日增重、育肥指数比正对照组分别高2%、2.6%，料肉比比正对照组降低了5.6%，说明本发明的甘露聚糖酶能显著提高饲料的利用率，提高肉鸡的日增重和育肥指数，降低料重比，从而可以减少畜禽养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> PRT

<213> mannase enzyme sequence

<400> 1

Met Leu Lys Leu Ile Ala Val Cys Leu Ser Ile Val Leu Leu Arg Leu

1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Ser Ile Glu Ala His Thr Val Tyr Pro Val Asn Pro

20 25 30

Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Asp Ile Met Asn Trp Leu Ala His Leu

35 40 45

Leu Asn Arg Ser Asp Thr Arg Val Leu Ser Gly Val Phe Gly Gly Tyr

50 55 60

Ser Asp Val Thr Phe Ser Met Thr Glu Glu Asn Arg Leu Lys Asn Ala

65 70 75 80

Thr Gly Glu Cys Leu Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Gly Arg Gly Trp

85 90 95

Leu Glu Thr Ala Asp Ile Thr Asp Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Asn Ser

100 105 110

Ser Leu Ile Ser Tyr Cys Arg Arg Gly Gly Leu Pro Gln Val Arg Leu

115 120 125

His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Gln Phe Gly Asn Tyr Lys Thr Ala Ile

130 135 140

Lys Lys Thr Leu Tyr Lys Asn Ile Leu Asp Pro Ser Thr Val Glu Gly

145 150 155 160

Lys Arg Leu Glu Ala Leu Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu Thr Gln

165 170 175

Leu Arg Phe Gln Gly Val Thr Val Leu Phe Arg Pro Val Leu Glu Met

180 185 190

Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Asp

195 200 205

Thr Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Ile Tyr Arg

210 215 220

Tyr Met Thr Glu Thr Arg Gly Leu Asp Asn Leu Phe Arg Val Tyr Leu

225 230 235 240

Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ser

245 250 255

Tyr Val Asp Ile Thr Gly Leu Asp Ala Tyr Ser Thr Asp Pro Tyr Ala

260 265 270

Ile Ser Gly Tyr Asp Ala Met Met Ser Leu Lys Arg Leu Ser Ala Phe

275 280 285

Val Glu Thr Gly Pro Ser Gly Asn Ile Gly Asn Phe Asp Tyr Ala Ala

290 295 300

Ser Ile Lys Ala Ile Arg Gln Lys Tyr Pro Glu Thr Thr Tyr Phe Leu

305 310 315 320

Thr Trp Asp Glu Gln Leu Arg Pro Val Ser Asn Gln Gly Ala Gln Ser

325 330 335

Leu Tyr Gln Asn Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Leu Glu Leu

340 345 350

Arg Ser Leu Lys Pro Ile Val Asp

355 360

<210> 2

<211> 1083

<212> DNA

<213> mannase gene sequence

<400> 2

atgcttaaat tgatagccgt ctgcctgtct attgttttat tgcgcttagg agccgccagt 60

tcgattgaag cacatacagt ttatcctgtt aatccaaatg cccagcagac gacaaaagat 120

atcatgaact ggctggcgca cctgctcaac cgttccgata ccagggtctt gtccggtgtg 180

ttcggcgggt acagcgatgt cactttttca atgacagagg aaaaccgctt gaaaaacgcg 240

acgggagagt gtctcgcaat ctacggctgt gactatggga gaggatggct ggaaacagcg 300

gatatcaccg atactatcga ttacagctgc aacagcagct tgatctcata ctgtagaagg 360

ggcggtctcc ctcaagtcag gctgcatctt gcaaatccgg cttttcaatt cggaaactat 420

aaaacggcca tcaaaaagac cctgtacaaa aacatcctgg acccttcaac tgttgaagga 480

aaacggcttg aggcgctgct cagcaaaatc gccgacggcc ttactcagct gagatttcaa 540

ggcgtcaccg ttctgttcag gcctgttctc gaaatgaacg gcgagtggtt ctggtggggg 600

ctgacaggct acaaccaaaa agacacggaa agaatctcgc tgtacaaaga gctttacaag 660

aagatatacc gctatatgac agagacaaga ggattggata acctgttcag ggtgtatttg 720

cctgatgcca acagagactt taaaacagac ttctacccag gctcatctta tgtggatatt 780

accggtctgg acgcttactc cacggatccg tatgcgattt caggttatga tgcaatgatg 840

tctctgaaaa gactgtctgc ctttgtcgaa accggtccgt ccggcaatat cggaaacttt 900

gattatgctg cgtctattaa ggcgatcagg caaaagtatc ccgagaccac gtactttttg 960

acatgggatg aacaattgag gcctgtgtcc aatcaaggcg cgcaaagcct ttatcaaaac 1020

agctggacat taaataaagg cgaaattttg gaattgaggt ccttgaagcc gatcgtggac 1080

taa 1083

Claims

1.一种毕赤酵母工程菌，其携带有能表达甘露聚糖酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的甘露聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

3.如权利要求2所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的甘露聚糖酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

4.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌在生产甘露聚糖酶中的应用。