CN103709266B - 一种红芪多糖1、其四种分离物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从红芪多糖1分离出红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C、红芪多糖1-D的方法，红芪多糖1经Sevag法脱蛋白，双氧水脱色，将脱色后的红芪多糖1溶液浓缩，用终浓度为20%～40%乙醇沉淀1～3次，冷冻干燥；干燥后的红芪多糖1用水溶解后，再经DEAE-52柱色谱，以0～2.0mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到红芪多糖1-C和另一组分红芪多糖1-1；将分离出的红芪多糖1-1经Sephadex？G-100柱色谱，蒸馏水以0.5mL·min-1的流速洗脱，苯酚-硫酸法示踪，分别得到三个组分，即红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D。本发明首次从红芪多糖1中分离出红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C、红芪多糖1-D，并对其结构进行了分析，使红芪药材的应用得到了更大的拓展。
Description
技术领域
本发明涉及红芪多糖1的分离物及其用途，属于天然药物化学技术领域。
背景技术
红芪(RadixHedysari)系豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand.-Mazz)的根.为甘肃特产名贵药材，中医将其作为传统中药，在临床上其具有强心，降糖，利尿，抗病毒，抗衰老等功效。红芪多糖作为其主要活性成分之一，其中红芪多糖1部分具有较明显的抗补体、降血糖及体外抗氧化等作用。
1）目前国内外对红芪的化学成分已有了较详细的报道，而对于红芪多糖研究，还只是停留在一级结构及一些药理作用的研究。1997年兰州大学的刘方明从红芪中提取分离出一种均多糖-葡聚糖，并对其结构进行研究；李世刚等通过葡聚糖凝胶柱层析分离纯化得到3个HPS组分，仅用气相色谱法分析了3个HPS组分的单糖组成，并对HPS体外抗肿瘤活性及构效关系进行研究；2009年马守军等对甘谷红芪酸性多糖的纯化及结构进行了初探。马丹等通过分步醇沉法得到3个红芪多糖，分别为红芪多糖1，红芪多糖2，红芪多糖3，封士兰用凝胶柱色谱法对红芪多糖3进行了分离纯化，从红芪多糖3中获得4个组分，该部分内容已经申请专利，专利名称：红芪多糖3的分离物及其用途，专利申请号：201110398728.0。封士兰等对红芪多糖2进行了分离纯化，得到硫酸酯多糖—红芪多糖SHG，研究了红芪多糖SHG的结构，并且获得了专利，专利名称：红芪多糖中的硫酸酯葡聚糖及其制备方法和应用，专利号：ZL201110203348.7。其中，包括红芪多糖1的制备方法，红芪药材粉碎后，进行脱酯处理，在40～70℃的水中提取，浓缩提取液，将浓缩液用终浓度为10～30%乙醇沉淀，过滤，沉淀为红芪粗多糖1。封士兰又用另一种方法提取得到了红芪多糖4，用凝胶柱色谱法对红芪多糖4进行了分离纯化，从红芪多糖4中获得3个组分，该部分内容申请了专利，专利名称：红芪多糖4及其有效成分的制备和应用，专利号：201210486757.7。然而对于红芪多糖1的结构和抗补体作用尚未见报道。
多糖作为生物高分子化合物，药理活性，与其理化性质密切相关。因此，了解红芪多糖1的理化性质显得尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种新的红芪提取物--红芪多糖1以及红芪多糖1的四个分离组分红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C和红芪多糖1-D；
本发明的另一目的是提供上述红芪多糖1的四个组分的分离方法。
本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
红芪多糖1-A（HPS1-A），结构式如Ⅰ：
其中，n=5～50。
HPS1-A构象为高度支化，重均分子量Mw为20～73.86kDa，均方根旋转半径Rg为20～50nm，多分散系数Mw/Mn为1.000～1.300；各单糖组成的摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10，多糖含量为50～100%；HPS1-A主链骨架由1,4、1,4,6-α-D-Glcp组成，侧链分支点位于葡萄糖的6位。侧链分支由1、1,5-α-L-Araf，1,4-α-D-GalpA、1,2,6-α-D-Galp组成。
红芪多糖1-B（HPS1-B），结构式如Ⅱ：
其中，n=10～100。
HPS1-B构象为无规线团构象，Mw为20～286KDa，Rg为10～30nm，Mw/Mn为1.005～1.599；各单糖组成的摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10，多糖含量为50～100%；HPS1-B以1,4、1,4,6-α-D-Glcp组成主链骨架。侧链分支由1、1,4-α-D-Glcp、1,4-α-D-GalpA、1,2,6-α-D-Galp与1、1,5-α-L-Araf组成。侧链分支位于葡萄糖的6位。
红芪多糖1-C（HPS1-C），结构式如Ⅲ：
其中，n=3～100。
HPS1-C构象为无规线团构象，Mw为15～645kDa,Rg为18～30.5nm,Mw/Mn为1～2.533,单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖（Glc）：***糖（Ara）：鼠李糖（Rha）=0.5～10∶0.3～8∶0.5～10，多糖含量为50～100%；HPS1-C主链骨架由1,6、1,4,6-α-D-Glcp和1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成，侧链分支位于葡萄糖4位和鼠李糖4位。侧链分支由1、1,5、1,3,5-α-L-Araf组成。
红芪多糖1-D（HPS1-D），结构式如IV:
其中，n=3～50。
HPS1-D构象为无规则线团构象,Mw为10～45.93kDa,Rg为15～30.5nm,Mw/Mn为1～1.974，单糖组成及摩尔比例为：***糖（Ara）：葡萄糖(Glc)=0.3～8:5～50，多糖含量为50～100%；HPS1-D主链骨架由1,4、1,4,6-α-D-Glcp，侧链分支位于葡萄糖O-6位。侧链分支由1,5、1,3,5-α-L-Araf组成。
红芪多糖1，其组分中包括红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C、红芪多糖1-D。
进一步的，
所述红芪多糖1中，各单糖组成及摩尔比例为:鼠李糖（Rha）:***糖（Ara）:甘露糖（Man）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:0.5～10:0.5～15:1～50:0.1～10；
红芪多糖1-A中，各单糖组成的摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10，多糖含量为50～100%；
所述红芪多糖1-B中，各单糖组成的摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10，多糖含量为50～100%；
所述红芪多糖1-C中，各单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖（Glc）：***糖（Ara）：鼠李糖（Rha）=0.5～10∶0.3～8∶0.5～0，多糖含量为50～100%；
所述红芪多糖1-D中，单糖组成及摩尔比例为：***糖（Ara）：葡萄糖(Glc)=0.3～8:5～50，多糖含量为50～100%。
一种从红芪多糖1分离出红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C、红芪多糖1-D的方法，包括如下步骤：
1）红芪多糖1-C的分离
红芪多糖1经Sevag法脱蛋白，双氧水脱色，将脱色后的红芪多糖1溶液浓缩，用终浓度为20%～40%乙醇沉淀1～3次，冷冻干燥；干燥后的红芪多糖1用水溶解后，再经DEAE-52柱色谱，以0～2.0mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到红芪多糖1-C和另一组分红芪多糖1-1；
2）红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D的分离
将步骤1）中分离出的红芪多糖1-1经SephadexG-100柱色谱，蒸馏水以0.5mL·min-1的流速洗脱，苯酚-硫酸法示踪，分别得到三个组分，即红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D。
红芪多糖1、红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C和红芪多糖1-D中的一种或几种的组合物在制备抗补体药物、降血糖药物或抗辐射药物中的应用。
一种药剂，含有红芪多糖1、红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C和红芪多糖1-D中的一种或几种组合成分。
所述药剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、滴丸剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂中的一种。
相关实验：
一、红芪多糖1中4个组分的构象研究
1.1理化性质
HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D四个组分对苯酚硫酸试剂均产生颜色反应；DAD检测器色谱图显示，HPS1-A和HPS1-B水溶液在280nm有微弱紫外吸收,HPS1-C和HPS1-D水溶液则没有吸收；而这4个组分在200nm左右均有多糖特征吸收峰。以上结果表明组分HPS1-C和HPS1-D为多糖；组分HPS1-A和HPS1-B为含少量蛋白质或多肽的多糖蛋白质组合物，经元素分析仪分析，HPS1-A和HPS1-B含有0.3～0.5%N元素（考马斯亮蓝法测定含蛋白质0.2～2.0%）也验证了这一点。
1.2高效凝胶色谱（HPGPC）法鉴定多糖组分纯度
采用HPGPC-DAD-RI联用技术，色谱柱：Ultrahydrogel1000、500色谱柱串联，流动相:超纯水，流速:0.8mL/min，柱温：35℃，示差折光检测器温度：35℃，进样量:30μl。样品溶液浓度为3mg/mL，0.45μm膜过滤。
如图1-4所示HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D的示差图均为单一对称峰，说明其为均一组分。
1.3凝胶渗透色谱-多角度激光散射（GPC-MALLS）法分析多糖构型
采用Ultrahydrogel1000、500色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含0.02%NaN3的0.154MNaCl溶液，流速为0.8mL/min，柱温：35℃；MALLS的光源气体为氦气和氖气，波长：690nm。流动相的折光指数取1.330，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.138,校准激光的仪器常数为8.1104×10-61/(Vcm)，校准示差折光检测器仪器常数为2.2697×10-41/(Vcm)。
精密称取样品HPS1-A,HPS1-B,HPS1-C和HPS1-D，用流动相配制成30mg/mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进样量50μl，进行GPC-MALLS分析。
本发明采用GPC-MALLS联用技术，测得红芪多糖1中4个组分在溶液状态的构象，可为红芪多糖1研发成为药品（如注射剂等）提供基础。
以旋转均方根半径对摩尔质量作图：当斜率为1时，表示高分子在溶液中是棒状排列；当斜率为0.4～0.6时则表示高分子在溶液中呈无规则线团；斜率约为0.33时则表示高分子在溶液中为球状形态；当图形呈U型（又称马蹄形）时，表示高分子在溶液中为高度支化。HPS1-ARg对Mw作图，分子半径分布呈马蹄形（图5），可知HPS1-A在流动相溶液中的构型为高度支化；HPS1-B的斜率为0.45±0.01（图6），可知HPS1-B为在流动相溶液中的构型为无规则线团。而HPS1-C的斜率为0.55±0.01（图7），可知HPS1-C为在流动相溶液中的构型为无规则线团。HPS1-D,的斜率为0.59±0.01（图8），表明HPS1-D为在流动相溶液中的构型为无规则线团。
二、红芪多糖1中4个组分的单糖组成与糖醛酸的确定
2.1.HPS1、HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D的单糖组成（糖腈乙酸酯法）
2.1.1.气相色谱条件
色谱柱为OV-101柱；进样口温度，210℃；检测器温度，260℃；载气压力：0.5Mpa；
程序升温：起始温度175℃，以15℃/min的速度升至225℃，保持5min，然后以5℃/min的速度升至250℃，保持1.5min。
2.1.2.标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的制备
分别称取鼠李糖、***、木糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖各5mg，加入10mg盐酸羟胺、7mg内标肌醇六乙酰酯、0.5mL吡啶,置烘箱中90℃恒温30min。取出后冷至室温,加入0.5mL醋酸酐,在90℃下继续反应30min(乙酰化)。反应产物减压蒸干,溶于1.0mL氯仿中,进行GC分析。
2.1.3.HPS1、HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D水解及糖腈乙酸酯衍生化
取HPS1、HPS1-A,HPS1-B,HPS1-C和HPS1-D各10mg，加2.0mL2.0mol·L-1TFA置于特弗伦管中,封管后120℃水解3h,冷却后于60℃减压旋蒸除去TFA,加入1.5mL甲醇溶解,减压蒸干,重复3次，除尽TFA。向已水解的样品中加入10mg盐酸羟胺、7mg内标肌醇六乙酰酯、0.5mL吡啶,置烘箱中90℃恒温30min。取出后冷至室温，加入0.5mL醋酸酐,在90℃下继续反应30min(乙酰化)。反应产物减压蒸干,溶于1.0mL氯仿中，进行GC分析。结果见图9～13。
通过与标准单糖糖腈乙酸酯衍生物色谱图对照，结合色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的组成和摩尔比例，HPS1单糖组成及摩尔比例为:鼠李糖（Rha）:***糖（Ara）:甘露糖（Man）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:0.5～10:0.5～15:1～50:0.1～10。HPS1-A单糖组成及摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10；HPS1-B单糖组成及摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10；HPS1-C单糖组成及摩尔比例为葡萄糖（Glc）：***糖（Ara）：鼠李糖（Rha）=0.5～10∶0.3～8∶0.5～10；HPS1-D单糖组成及摩尔比例为***糖（Ara）：葡萄糖(Glc)=0.3～8:5～50。
2.2.糖醛酸的鉴定；
许多植物多糖含有糖醛酸，为了研究本发明的多糖是否也含有糖醛酸，采用气相色谱法和硫酸咔唑法。
2.2.1.气相色谱法鉴定糖醛酸
2.2.1.1.标准单糖衍生物的制备
分别称取鼠李糖、***、木糖、糖葡萄糖、半乳糖、甘露糖各2mg，溶于1mL水中，然后加入78μL0.5mol/L碳酸钠。溶液于30℃保持45min，然后加4%的硼氢化钠0.5mL于室温放置1.5h。滴加25%乙酸至不产生气泡为止以除去多余的硼氢化钠。溶液通过阳离子交换柱，以10mL水洗脱。洗脱液45℃真空蒸干。分两次加入甲醇（3mL）蒸干以除去硼酸盐。85℃真空加热2h将糖醛酸转变为内酯。残渣溶于1mL吡啶中，加入1mL正丙胺，密封，55℃加热30min。溶液冷却（45℃以下），再加热至55℃减压蒸干。残渣分别加入0.5mL吡啶和乙酸酐，95℃加热1h。反应产物减压蒸干,溶于1.0mL氯仿中,进行GC分析。
2.2.1.2样品衍生物的制备
取HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D各10mg，加2.0mL2.0mol/LTFA置于特弗伦管中,封管后120℃水解3h,冷却后于60℃减压旋蒸除去TFA,加入1.5mL甲醇溶解,减压蒸干,重复3次，除尽TFA。然后按照2.2.1.1方法处理。
2.2.2硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量
2.2.2.1糖醛酸标准曲线绘制
精密称取葡萄糖醛酸12mg溶于25mL容量瓶中。准确移取葡萄糖醛酸标准溶液0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8mL于具塞试管中，加蒸馏水至1mL，置于冰水浴中，加入浓硫酸6mL，振摇，85℃水浴中保持20min，取出后冷却至室温，分别加0.2mL0.1%咔唑乙醇液，室温下保持2h，于530nm处测定吸光度A，绘制标准曲线。
2.2.2.2供试品溶液配制及糖醛酸含量测定
称取多糖样品6.0mg溶于5mL容量瓶中。分别取此溶液0.1mL，0.3mL，0.5mL于具塞试管中定容至1mL，以后操作同2.2.1.1糖醛酸标准曲线绘制。
经2.2.1和2.2.2两种方法确定HPS1-C、HPS1-D均不含糖醛酸，而HPS1-A、HPS1-B均含有半乳糖醛酸,含量分别是20.4%、15.5%。
三、红芪多糖1中4个组分的化学结构研究
采用部分酸水解、甲基化结合气-质联用、核磁共振等技术对红芪多糖1中4个组分的结构进行了研究。
3.1.多糖样品的部分酸水解
3.1.1HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D的部分酸水解
取HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D各50mg用0.1mol/LTFA100℃水解1h，冷却至室温后，60℃减压旋蒸除去TFA,加入1.5mL甲醇溶解,减压蒸干,重复3次,除尽TFA。用蒸馏水溶解，透析（3500Da）。袋内部分经Sephadex-100柱色谱纯化后得到次级多糖组分HPS1-A-H、HPS1-B-H、HPS1-C-H、HPS1-D-H；袋外部分收集得到HPS1-A-L、HPS1-B-L、HPS1-C-L、HPS1-D-L。以上所得部分酸水解产物进行单糖组成分析
3.1.2HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D部分酸水解产物的单糖组成分析
HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D的部分酸水解产物按2.1方法进行单糖组成分析。
3.2.多糖的甲基化
3.2.1HPS1-A和HPS1-B糖醛酸的还原
分别取HPS1-A和HPS1-B多糖样品15mg，溶于10.00mL水中，加入0.5gEDC保持PH为4.75(通过2D-3A自动滴定仪，0.5MHcl调节，保持2小时)，加入2MNaBH4溶液，保持PH为7（用4MHcl调节）30min以上滴完，再反应60min,用蒸馏水透析24h，干燥。
3.2.2HPS1-A和HPS1-B还原产物、HPS1-C、HPS1-D的甲基化
取经充分干燥的多糖样品5mg，充分溶于2.5mLDMSO，置10mL的圆底烧瓶中。然后加入100mg的氢氧化钠粉末，充氮气，室温下超声10min～90min，放置90min。然后置冰浴中滴加1.875mL（0.75×2.5倍）碘甲烷，约需1min。在室温下超声30min，放置30min，加水1mL终止反应,加入1mol/LHAc中和，透析，冷冻干燥。如此重复三次，经IR检测在3500cm-1处无吸收峰，即得全甲基化的样品。
上述全甲基化样品加入88%甲酸5.0mL，100℃密封水解3h，减压蒸发至干。加入2mol/L三氟乙酸2.0mL，120℃水解3h，减压蒸发至干。然后加甲醇3.0mL，再减压蒸发至干，如此重复三次。
在上述蒸干的残渣中加入新配置的0.5mol/L硼氢化钠的氨水溶液（硼氢化钠溶解在2mol/L的氨水中）2.5mL，60℃反应60min，加丙酮1.25mL终止反应，40℃减压蒸干。残渣溶于0.5ml18mol/L的乙酸中，加入2.5mL乙酸乙酯，然后再加入7.5mL的乙酸酐，混合后加入0.25mL70%高氯酸，充分混合。反应5min后，冰浴冷却，加入10mL蒸馏水，再加入0.5mL1-甲基咪唑（催化剂），混合，反应5min。加入二氯甲烷1.5mL萃取，取二氯甲烷层，GC-MS分析。
3.3.HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D的NMR分析
称取充分干燥的HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D，溶于1.0mL重水中，冷冻干燥，如此重复用重水交换三次，再溶于0.5mL重水后，用微孔滤膜（0.45μm）滤过后在BrukerDRX-600核磁共振光谱仪上进行1H和13CNMR分析。
经以上的结构研究分析，红芪多糖HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D的结构如下：
HPS1-A主链骨架由1,4、1,4，6-α-D-Glcp组成，侧链分支点位于葡萄糖的6位。侧链分支由1、1,5-α-L-Araf、1,4-α-D-GalpA、1,2,6-α-D-Galp组成。
HPS1-B以1、1,4、1,4,6-α-D-Glcp组成主链骨架。侧链分支由1、1,4-α-D-Glcp、1,4-α-D-GalpA、1,2,6-α-D-Galp与1、1,5-α-L-Araf组成。侧链分支位于葡萄糖的6位。
HPS1-C主链骨架由1,6、1,4,6-α-D-Glcp和1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成，侧链分支位于葡萄糖4位和鼠李糖4位。侧链分支主要由1、1,5、1,3,5-α-L-Araf组成。
HPS1-D主链骨架由1,4、1,4,6-α-D-Glcp，侧链分支位于葡萄糖O-6位。侧链分支主要由1,5、1,3,5-α-L-Araf组成。
四、红芪多糖1及红芪多糖1中4个组分的抗补体作用研究
4.1.材料
巴比妥钠、巴比妥、NaCl、MgCl2·6H2O、CaCl2、豚鼠血清、2%的羊红细胞、溶血素（1:4000）、肝素。
4.2补体经典途径的溶血活性(CH50)测定
4.2.1.溶液配制
巴比妥缓冲液（barbitolbuffersolution，BBS）：取巴比妥钠2.875g，溶于250ml热水中，再加入NaCl42.5g、MgCl2·6H2O0.84g、CaCl20.14g、巴比妥1.0g，补三蒸水至1000ml配制出5倍浓缩的巴比妥缓冲液（5×BBS）。使用时，将5×BBS用三蒸水稀释成巴比妥缓冲液（BBS）即可。
1:1000溶血素：取溶血素适量，加入BBS，配制成为1:1000溶血素溶液。
供试品溶液：称取各供试品(HPS1、HPS1-A、HPS1-B、HPPS1-C、HPS1-D、肝素)适量，用BBS稀释液超声溶解作为1:1溶液，对倍稀释配成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。共得8个浓度的供试品溶液。其中肝素作为阳性对照药。
4.2.2.补体经典溶血***的建立
取补体(豚鼠血清)0.1mL,加入BBS配制成1∶10溶液,用BBS对倍稀释成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280溶液。取1∶1000溶血素、各浓度补体及2%SRBC各0.1mL溶于0.3mLBBS中,混匀,37℃水浴30min后,在5000r·min-1、4℃条件下离心10min。分别取上清0.2mL,在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组(0.1mL2%SRBC溶于0.15mL三蒸水中)。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准,计算溶血率。以补体稀释度为X轴,溶血百分率为Y轴作图。选择达到高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。
4.2.3.药物经典途径抗补体活性测定
取确定的临界浓度的补体与供试品各0.1ml混匀，于37℃水浴10min后，加入0.2mlBBS、0.1ml溶血素和0.1ml2%SRBC。将每管37℃水浴30min后放入低温高速离心机，5000rpm、4℃条件下离心10min后分别取每管上清0.2ml于96孔板，用酶标仪在405nm下测定吸光度。实验同时设置多糖组、多糖对照组（0.1ml多糖溶于0.5mlBBS）、补体组（补体、溶血素和2%SRBC各0.1ml溶于0.3mlBBS）和全溶血组。将多糖吸光度值扣除相应多糖对照组吸光度值后计算溶血抑制率。以多糖浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。计算CH50值。
4.2.4.实验结果
临界补体浓度结果见（图14）不同稀释倍数豚鼠血清(补体)加入溶血体系中,评价其效价。在补体稀释浓度为1∶10～1∶80时,溶血率接近100%,体系基本达到全溶血,所以选择1∶40稀释的豚鼠血清作为以下经典途径筛选实验中所使用的补体。
由图15可知红芪多糖组分HPS1抗补体活性CH50为(0.25±0.03)mg·mL-1，HPS1-A抗补体活性CH50为(0.22±0.03)mg·mL-1,HPS1-B抗补体活性CH50为(0.23±0.03)mg·mL-1,HPS1-C抗补体活性CH50为(0.78±0.03)mg·mL-1，HPS1-D抗补体活性CH50为(0.21±0.03)mg·mL-1，阳性对照肝素的抗补体活性CH50为(0.20±0.05)mg·mL-1。本实验表明红芪多糖HPS1、HPS1-A、HPS1-B、和HPS1-D在经典途径中具有较好的抗补体活性，HPS1-C的抗补体活性相对不明显。
五、HPS1及HPS1中4个组分降血糖作用的研究
5.1.HPS1及1中4个组分对实验性大鼠2型糖尿病的降血糖作用
5.1.1.实验动物
Wistar大鼠，SPF级，体重180～220g，♀，实验动物使用许可证号：SCXK(甘)2004-0006)由甘肃中医学院科研实验中心提供。
5.1.2.药品及试剂
格华止盐酸二甲双胍片（批号：0906066），由中美上海施贵宝制药有限公司提供；型血糖试纸（批号：22967331），由德国ROCHE公司提供。
5.1.3.动物造模及给药
取7～8周龄雌性wistar大鼠90只，按体重随机选取10只作为空白对照，用基础饲料喂养。其余80只饲以高脂高糖饲料喂养4周，一次性按30mg/kg注射链脲佐菌素（STZ），继续饲以高脂高糖饲料4周制作实验性2型糖尿病模型。8周后选取空腹血糖≥11.lmmoL/L的大鼠60只，按体重随机分为2型糖尿病模型组、HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1五个治疗组（100mg/kg·d）及二甲双胍组（100mg/kg·d）。空白对照组及2型糖尿病模型组给予量生理盐水。以上各组均灌胃给药，连续给药5周后取血，用血糖测试仪测大鼠血糖，结果以mmol/L计。
5.1.4.统计学处理
以SPSS15.0处理数据,采用重复测量方差分析(P<0.05),所有数据以x±s表示。结果见表1。
表1.HPS1及其4个组分对实验性2型糖尿病大鼠降血糖作用的影响( n=10)
注：与空白组对比*P<0.05与模型组对比△P<0.05与MET组对比☆P﹥0.05
由表3可见，实验性2型糖尿病大鼠模型组血糖值很高，说明成功制备了大鼠糖尿病模型。HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组和二甲双胍（MET）组的血糖值均较模型组低，与模型组比较具有统计学意义（P<0.05）。说明HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1具有降血糖作用。另外，在实验过程中还观察到红芪多糖5个给药组均可明显改善糖尿病大鼠“三多一少”症状及大鼠的精神状态。表明HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1在降低2型糖尿病大鼠血糖的同时，还通过调节大鼠机体免疫功能，在整体上改善糖尿病大鼠的生存质量。
六.红芪多糖1及1中4个组分抗辐射功能研究
6.1.实验材料
健康昆明种雄性小鼠，20±2g，鼠龄6～7周，由兰州大学GLP实验动物中心提供，共105只×2批，每组15只，随机分为7组，空白组(不照射不给药)，实验对照组(照射模型组，只照射不给药)，HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组（100mg/kg）。
6.2.实验方法
6.2.1.照射条件
以6MHzX射线辐射源（由兰州市陆军总院提供）对小鼠进行一次性全身照射，吸收剂量率为1.0Gy/min，吸收剂量为8Gy，源距为50cm，观察小鼠存活率；吸收剂量率为1.0Gy/min，吸收剂量为4Gy，源距为50cm，小鼠进行一次性全身照射观察对小鼠造血功能的影响。
6.2.2.动物存活率测定
雄性健康小鼠105只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为7组，每组15只。正常对照组和辐射对照组给予等量生理盐水，HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每两天称体重，根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X射线源照射，辐射后继续灌胃10d，观察照射后30d存活率及存活时间。
6.2.3.外周血细胞数、胸腺脾脏指数测定
健康雄性小鼠105只，于实验室适应性喂养三天后，随机分为7组，每组15只。空白组和辐射对照组给予等量蒸馏水，HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组，均于早晨空腹灌胃，每日1次，每次0.5mL，每天称体重，记录并根据体重调整给药量，期间动物自由摄食和饮水。各组连续灌胃10d后进行X射线照射，于照射前、照射后第2、5、7、11、16d，分别剪尾尖采血，加稀释液后用自动血球分析仪（日本Sysmex，KX-21N）测外周血白细胞和淋巴细胞数。
6.2.4统计学处理
数据以均数±标准差（X±S）表示，组间差异显著性采用t检验，采用SPSS统计软件，应用LSD法进行两两比较。外周血白细胞和淋巴细胞数用方差分析，显著性（p<0.01，0.05）作为有效依据。结果见表2。
表2.HPS1及其4个组分经8gyX线照射后各组小鼠存活率
＊与照射模型组相比P＜0.05
各组鼠（除空白组）在射线照射后当天，小鼠食欲下降，活动减少，体重下降，陆续出现精神萎靡不振，耳廓及尾部苍白，部分小鼠耳廓出现血斑，照射组更为明显。但随着时间的推移小鼠渐渐恢复活力，HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组恢复较快，两周左右；小鼠毛色有光泽且较浓密，较少出现皮毛稀疏松散现象。辐照后，照射组小鼠开始出现被毛蓬乱，稀疏无光泽，采食量下降，从第8天开始陆续死亡。照射组与实验组相比，死亡时间较早，死亡数较多。从表6中可以看出，HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组均能提高辐照小鼠的存活率。HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组与照射组比较，死亡鼠平均存活时间均延长。
存活率和存活时间是反映抗辐射作用的最基本最客观的指标，因为抗辐射的最终目的就是为了提高存活率和延长存活时间。实验结果表明HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1组对X-照射小鼠具有良好的抗辐射效果，可以增加小鼠的体重、平均存活时间和30d存活率，即HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1对X-射线照射小鼠有保护作用。
表3.HPS1及其4个组分对小鼠辐照前后外周血白细胞计数的影响（109/L,X±S）
＊与照射模型组相比，P＜0.05＊＊与照射模型组相比，P＜0.01
表4.HPS1及其4个组分对小鼠辐照前后外周血淋巴细胞计数的影响（109/L,X±S）
＊与照射模型组相比，P＜0.05＊＊与照射模型组相比，P＜0.01
由表3和表4可见，各给药组在第16天与模型组比较均能显著提高辐照小鼠白细胞数量和外周血淋巴细胞数量。白细胞数与外周血白细胞数的变化基本一致。本实验结果表明，HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D、HPS1均对X-射线诱发的辐射损伤有较好的保护作用。
本发明的有益效果：
本发明首次从红芪多糖1中分离出了HPS1-A、HPS1-BHPS1-C及HPS1-D，使红芪药材的应用得到了更大的拓展。
本发明制备的红芪多糖1、HPS1-A、HPS1-BHPS1-C及HPS1-D具有抗补体、降血糖、抗辐射的作用，且效果明显。本发明所提出的红芪多糖1、HPS1-A、HPS1-BHPS1-C及HPS1-D制备方法具有简单、提取率高、易操作的优点。
并且，本发明分离HPS1-A、HPS1-BHPS1-C及HPS1-D的方法，更加精纯。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为HPS-A凝胶高效液相色谱图，示差折光检测器；
图2为HPS1-B凝胶高效液相色谱图，示差折光检测器；
图3为HPS1-C凝胶高效液相色谱图，示差折光检测器；
图4为HPS1-D凝胶高效液相色谱图，示差折光检测器；
图5为HPS1-A均方根半径对摩尔质量图；
图6为HPS1-B均方根半径对摩尔质量图；
图7为HPS1-C均方根半径对摩尔质量图；
图8为HPS1-D均方根半径对摩尔质量图；
图9为混合单糖标准品的气相色谱图，其中，1-鼠李糖2-***糖3-木糖4-甘露糖5-葡萄糖6-半乳糖7-内标；
图10为HPS1-A的气相色谱图；
图11为HPS1-B的气相色谱图；
图12为HPS1-C的气相色谱图；
图13为HPS1-D的气相色谱图；
图14为经典途径不同效价的豚鼠血清图；
图15为经典途径多糖抗补体图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
红芪多糖1，包含有四种组分，分别为红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C、红芪多糖1-D。其中，
红芪多糖1-A（HPS1-A），结构式如Ⅰ：
其中，n=5～50。
红芪多糖1-B（HPS1-B），结构式如Ⅱ：
其中，n=10～100。
红芪多糖1-C（HPS1-C），结构式如Ⅲ：
其中，n=3～100。
红芪多糖1-D（HPS1-D），结构式如IV:
其中，n=3～50。
实施例2：红芪多糖1四个组分的提取分离工艺
1）红芪多糖1-C的分离
将红芪多糖1经Sevag法脱蛋白，双氧水脱色，将脱色后的红芪多糖1溶液浓缩，用终浓度为20%～40%乙醇沉淀1～3次，冷冻干燥；干燥后的红芪多糖1用水溶解后，经DEAE-52柱色谱，以0～2.0mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到红芪多糖1-C和红芪多糖1-1；
2）红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D的分离
红芪多糖1-1再经SephadexG-100柱色谱，蒸馏水以0.5mL·min-1的流速洗脱，苯酚-硫酸法示踪，得到红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D。
实施例3：红芪多糖1中4个组分的构象分析
采用Ultrahydrogel1000、500色谱柱串联凝胶色谱，流动相为含0.02%NaN3的0.154MNaCl溶液，流速为0.8mL/min，柱温：35℃；MALLS的光源气体为氦气和氖气，波长：690nm。流动相的折光指数取1.330，多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.138,校准激光的仪器常数为8.1104×10-6(Vcm)-1，校准示差折光检测器仪器常数为2.2697×10-4(Vcm)-1。
精密称取样品HPS1-A,HPS1-B,HPS1-C，HPS1-D用流动相配制成30mg/mL溶液，经0.45μm滤膜过滤，进样量50μL，进行GPC-MALLS分析，用含0.02%NaN3的0.154MNaCl溶液为流动相，样品在溶液中处于完全溶解状态。
经GPC-MALLS分析，HPS1-A构象为高度支化，重均分子量Mw为15～356kDa，均方根旋转半径Rg为18～30.5nm，多分散系数Mw/Mn为1.000～1.633；HPS1-B构象为无规线团构象，Mw为20～286KDa，Rg为10～30nm，Mw/Mn为1.005～1.599；HPS1-C构象为无规线团构象，Mw为15～645kDa,Rg为18～30.5nm,Mw/Mn为1～2.533;HPS1-D构象为无规则线团构象,Mw为10～45.93kDa,Rg为15～30.5nm,Mw/Mn为1～1.974。
实施例4：红芪多糖1中4个组分的单糖组成分析
一、气相色谱法分析HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C、HPS1-D的单糖组成
气相色谱分析的色谱柱为OV-101柱；进样口温度，210℃；检测器温度，260℃；载气压力：0.5Mpa；程序升温：起始温度175℃，以15℃/min的速度升至225℃，保持5min，然后以5℃/min的速度升至250℃，保持1.5min。
通过与标准单糖糖腈乙酸酯衍生物色谱图对照，结合色谱峰面积归一化法测定样品中单糖的组成和摩尔比例，HPS1-A单糖组成及摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10；HPS1-B单糖组成及摩尔比例为：***糖（Ara）:葡萄糖（Glc）:半乳糖（Gal）=0.1～10:5～50:0.1～10；HPS1-C单糖组成及摩尔比例为葡萄糖（Glc）：***糖（Ara）：鼠李糖（Rha）=0.5～10∶0.3～8∶0.5～10；HPS1-D单糖组成及摩尔比例为***糖（Ara）：葡萄糖(Glc)=0.3～8:5～50。
二、糖醛酸的确定
1、气相色谱法
色谱柱为OV-101柱；进样口温度：210℃；检测器温度：280℃；程序升温：起始温度160℃，以5℃/min的速度升至190℃，保持4min。然后以3℃/min的速度升至210℃，保持15min，再以10℃/min升至260℃，然后保持15min。
2、硫酸-咔唑法
称取多糖样品6.0mg溶于5mL容量瓶中。分别取此溶液0.1mL，0.3mL，0.5mL于具塞试管中定容至1mL，置于冰水浴中，加入浓硫酸6mL，振摇，85℃水浴中保持20min，取出后冷却至室温，分别加0.2mL0.1%咔唑乙醇液，室温下保持2h，于530nm处测定吸光度A。
经两种方法确定HPS1-C、HPS1-D均不含糖醛酸，而HPS1-A、HPS1-B均含有半乳糖醛酸,含量分别是20.4%、15.5%。
实施例5：红芪多糖1中4个组分的多糖部分化学结构研究
采用部分酸水解、甲基化结合气-质联用以及NMR技术研究了红芪多糖1中4个组分多糖部分的结构。HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D的结构特征如下所述：
红芪多糖HPS1-A主链骨架由1,5、1,3,5-α-L-Araf和1,6、1,2,6-α-D-Galp组成，侧链分支点位于***糖的3位与半乳糖的2位。侧链分支由1,4、1,4,6-α-D-Glcp，1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成。主链非还原末端连接主要是***糖。
红芪多糖HPS1-B以1,4-α-D-Glcp与1,6-α-D-Galp组成主链骨架。侧链分支由1,6-α-D-Galp、1,2-α-L-Rhap、1-α-D-Glcp与1-α-L-Araf组成。侧链分支位于葡萄糖的6位。
HPS1-C主链骨架由1,6、1,4,6-α-D-Glcp和1,2、1,2,4-α-L-Rhap组成，侧链分支位于葡萄糖4位和鼠李糖4位。侧链分支主要由1、1,5、1,3,5-α-L-Araf组成。
HPS1-D主链骨架由1,4、1,4,6-α-D-Glcp，侧链分支位于葡萄糖O-6位。侧链分支主要由1,5、1,3,5-α-L-Araf组成。
实施例6：红芪多糖1胶囊制备
将脱酯后的红芪药材粉碎，加入6～26倍量水，40～70℃提取1～5次，每次提取0.5～4.5h，提取液浓缩，将浓缩液用终浓度为10～30%乙醇沉淀，过滤，沉淀冷冻干燥，加60%～95%乙醇制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g～1.0g）。
实施例7：红芪多糖1饮料制备
将脱酯后的红芪药材粉碎，加入6～26倍量水，40～70℃提取1～5次，每次提取0.5～4.5h，合并提取液，将提取液浓缩为每1mL液体相当于0.01～1g红芪药材的浸膏，向浸膏中加甜味剂和矫味剂，制成饮料。
实施例8：HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D制剂的制备
HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D粉，加药物制剂常用的润滑剂、崩解剂，压片，制片剂。
HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒剂。
HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D粉，加药物制剂常用的润湿剂、稀释剂，制颗粒，装1号胶囊（装量为0.1g～1.0g）。
HPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D粉，加注射用水使浓度达每mL含0.01mg～10mgHPS1-A、HPS1-B、HPS1-C和HPS1-D，封装于安瓶中，每瓶1mL～5mL,高压灭菌，制成灭菌注射剂，用于肌肉注射或静脉注射。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.红芪多糖1-A，结构式如Ⅰ：
其中，n＝5～50。
2.红芪多糖1-B，结构式如Ⅱ：
其中，n＝10～100。
3.红芪多糖1-C，结构式如Ⅲ：
其中，n＝3～100。
4.红芪多糖1-D，结构式如IV:
其中，n＝3～50。
5.红芪多糖1，其特征在于：其组分中包括权利要求1所述的红芪多糖1-A、权利要求2所述的红芪多糖1-B、权利要求3所述的红芪多糖1-C、权利要求4所述的红芪多糖1-D；
所述红芪多糖1中，各单糖组成及摩尔比例为:鼠李糖(Rha):***糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)＝0.1～10:0.5～10:0.5～15:1～50:0.1～10。
权利要求1所述的红芪多糖1-A中，各单糖组成的摩尔比例为：***糖(Ara):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)＝0.1～10:5～50:0.1～10，多糖含量为50～100％；
权利要求2所述的红芪多糖1-B中，各单糖组成的摩尔比例为：***糖(Ara):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)＝0.1～10:5～50:0.1～10，多糖含量为50～100％；
权利要求3所述的红芪多糖1-C中，各单糖组成的摩尔比例为：葡萄糖(Glc)：***糖(Ara)：鼠李糖(Rha)＝0.5～10∶0.3～8∶0.5～10，多糖含量为50～100％；
权利要求4所述的红芪多糖1-D中，单糖组成及摩尔比例为：***糖(Ara)：葡萄糖(Glc)＝0.3～8:5～50，多糖含量为50～100％。
6.一种从红芪多糖中分离制备如权利要求1所述的红芪多糖1-A、如权利要求2所述的红芪多糖1-B、如权利要求3所述的红芪多糖1-C、如权利要求4所述的红芪多糖1-D的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)红芪多糖1-C的分离
红芪多糖1经Sevag法脱蛋白，双氧水脱色，将脱色后的红芪多糖1溶液浓缩，用终浓度为20％～40％乙醇沉淀1～3次，冷冻干燥；干燥后的红芪多糖1用水溶解后，再经DEAE-52柱色谱，以0～2.0mol·L-1的NaCl梯度洗脱得到红芪多糖1-C和另一组分红芪多糖1-1；
2)红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D的分离
将步骤1)中分离出的红芪多糖1-1经SephadexG-100柱色谱，蒸馏水以0.5mL·min-1的流速洗脱，苯酚-硫酸法示踪，分别得到三个组分，即红芪多糖1-A、红芪多糖1-B和红芪多糖1-D。
7.根据权利要求5所述的红芪多糖1、红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C和红芪多糖1-D中的一种或几种的组合物在制备抗补体药物、降血糖药物或抗辐射药物中的应用。
8.一种药剂，其特征在于：含有权利要求5所述的红芪多糖1、红芪多糖1-A、红芪多糖1-B、红芪多糖1-C和红芪多糖1-D中的一种或几种组合成分。
9.根据权利要求8所述的药剂，其特征在于：所述药剂的剂型为溶液剂、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、片剂、水针剂、冻干粉剂、贴剂、凝胶剂、膜剂、酒剂、浸膏剂或缓控释制剂中的一种。
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