CN103709197A

CN103709197A - 取代的水杨醛-tcf衍生物及其制备方法和用途

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Publication number: CN103709197A
Application number: CN201410023272.3A
Authority: CN
Inventors: 余孝其; 李坤; 后际挺
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN103709197B

Abstract

本发明属于生物化学领域，具体涉及取代的水杨醛-TCF衍生物及其制备方法和用途。本发明提供了一种取代的水杨醛-TCF衍生物，其结构式如式Ⅰ所示。本发明还提供了上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法和其在对线粒体进行染色标记中的用途。本发明提供的取代的水杨醛-TCF衍生物具有毒副性小、原料简单易得、整条合成路线可操作性强、反应条件也比较温和、总体成本较低等优势，和现有的昂贵的线粒体标记物相比，无疑更有市场竞争力。

Description

取代的水杨醛-TCF衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及取代的水杨醛-TCF（2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃）衍生物及其制备方法和用途。

背景技术

线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的由两层膜包被的细胞器。它是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供了能量，所以有“细胞动力工厂”之称。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。因此，对细胞内线粒体形态及分布的跟踪检测有利于我们研究一些相关的生命过程。

近几年来，由于其高灵敏性以及时空分辨率，荧光检测法被广泛应用于各个领域。而制备用于标记线粒体的荧光探针也已受到高度重视。[参见：(a)A.T.Hoye,J.E.Davoren,P.Wipf,Acc.Chem.Res.,2008,41,87-97;(b)L.F.Yousif,K.M.Stewart,S.O.Kelley,ChemBioChem,2009,10,1939-1950;(c)B.A.D.Neto,JoséR.

R.G.Silva,RSC Adv.,2013,3,5291-5301.]目前市售的线粒体染料种类偏少，价格普遍昂贵，光稳定性还有待提升。因此，相继有线粒体靶向的荧光探针的报道问世。[参见：(a)B.C.Dickinson,D.Srikun,C.J.Chang,Curr.Opin.Chem.Biol.,2010,14,50-56;(b)S.C.Dodani,S.C.Leary,P.A.Cobine,D.R.Winge,C.J.Chang,J.Am.Chem.Soc.,2011,133,8606–8616;(c)G.Masanta,C.S.Lim,H.J.Kim,J.H.Han,H.M.Kim,B.R.Cho,J.Am.Chem.Soc.,2011,133,5698–5700;(d)L.Xue,G.Li,C.Yu,H.Jiang,Chem.Eur.J.,2012,18,1050–1054;(e)K.Krumova,L.E.Greene,G.Cosa,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,17135–17143.]但此类探针一般是对线粒体中某一物种产生荧光响应，如锌离子以及活性氧簇（ROS）。这些探针并不能真正用于标记生命过程中线粒体的形态变化，而纯粹对线粒体进行示踪的荧光探针还鲜有报道。[参见：(a)C.W.T.Leung,Y.Hong,S.Chen,E.Zhao,J.W.Y.Lam,B.Z.Tang,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,62–65;(b)S.Zhang,T.Wu,J.Fan,Z.Li,N.Jiang,J.Wang,B.Dou,S.Sun,F.Song,X.Peng,Org.Biomol.Chem.,2013,11,555–558;(c)N.Jiang,J.Fan,T.Liu,J.Cao,B.Qiao,J.Wang,P.Gao,X.Peng,Chem.Commun.,2013,49,10620-10622;(d)Y.Chen,L.Qiao,L.Ji,H.Chao,Biomaterials,2014,35,2-13.]而其中发射长波荧光的染料更是少。由于长波荧光具有穿透能力强、生物组织伤害小等优点，因此，设计合成专门用来对线粒体示踪的长波荧光染料依然是很有必要的。

水杨醛作为一种便宜易得的化学原料，其含有的醛基和酚羟基可以参与多种反应，从而制备很多水杨醛衍生物，这种衍生手段操作性和经济性都很强。TCF含有三个氰基，具有很强的吸电子性和很好的溶解性。利用TCF和取代的水杨醛可以构建大共轭荧光团，并且具备分子内电荷转移，使其发光达到红色甚至近红外区域。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种取代的水杨醛-TCF（2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃）衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：

其中，R为C1～C8烷氧基、

-NH₂或-OH；R₁～R₃独立地为C1～C8烷基或C1～C8羰基。

作为本发明优选的方案，R为C1～C4烷氧基、

-NH₂或-OH；R₁～R₃独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基。

进一步优选的，R为C1～C4烷氧基、

R₁～R₃独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基。

更进一步优选的，R为

R₁～R₃独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基。

更进一步优选的，R为R₁、R₂独立地为C1～C4烷基。

最优的，R为二乙基氨基。

本发明还提供了上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法，其反应式如下：

上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法包括以下步骤：

a、将取代的水杨醛和1,2-二溴乙烷溶于无水有机溶剂中，然后再加入的无水碳酸钾，在40～80℃下反应12～24小时，制备得到中间体1；

b、将中间体1与TCF在室温下反应，以碱作为催化剂，反应时间为4～8小时，制备得到中间体2；

c、将中间体2、三苯基膦和碘化钾，在无水乙腈或者DMF（N,N-二甲基甲酰胺）中回流反应24～48小时，制备得到取代的水杨醛-TCF衍生物。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤a所述的无水有机溶剂为无水丙酮、无水DMF、无水乙腈中的任意一种。优选的，所述的无水有机溶剂为无水丙酮。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤a所述1,2-二溴乙烷的用量为大大过量。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤a所述无水碳酸钾的用量为取代水杨醛的1.2～2倍当量。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤b所述中间体1与TCF的摩尔比为1:1～1.5:1。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤b所述的碱为无水醋酸铵、哌啶或者***啉中的任意一种。优选的，所述的碱为无水醋酸铵。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤b所述碱的用量为TCF的1～5倍当量。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤b所述反应的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或无水THF(四氢呋喃)：无水EtOH(乙醇)=4:1～1:4（V/V）的混合溶剂中的任意一种。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤c所述中间体2与三苯基膦的摩尔比为1:2～1:5。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤c所述碘化钾的用量为中间体2的1～2倍当量。

本发明还提供了上述取代的水杨醛-TCF衍生物在对线粒体进行染色标记中的用途。

本发明利用取代水杨醛的醛基和TCF缩合构建红色荧光团，然后利用酚羟基连接上三苯基膦靶向基，设计合成了一种发射红色荧光的线粒体失踪染料。本发明通过在含有强供电子基团的取代水杨醛中引入强吸电子基TCF部分，使得整个化合物的发射波长可以红移到600nm以上，完全满足生物实验中对荧光波长的需求。三苯基膦的引入可以使得化合物在细胞线粒体中富集，从而实现对线粒体的标记。该系列化合物具有优良的光稳定性、抗氧化性，不受线粒体中的活性组分影响，能够实现对线粒体形态分布的实时示踪。此外，本发明提供的取代的水杨醛-TCF衍生物具有毒副性小、原料简单易得、整条合成路线可操作性强、反应条件也比较温和、总体成本较低等优势，和现有的昂贵的线粒体标记物相比，无疑更有市场竞争力。

附图说明

图1化合物4的氢谱图。

图2化合物4在水中的紫外吸收和荧光发射图。

图35μM化合物4和细胞核染色剂NucBlue在HeLa细胞中的共聚焦荧光成像图。其中，a图为NucBlue的荧光成像图（405nm激发，420-470nm收集）；b图为化合物4的荧光成像图（552nm激发，590-650nm收集）；c图为a图和b图的叠加图。

图40.5μM化合物4和市售线粒体荧光探针Mito-Tracker Green在HeLa细胞中共同孵化后的共聚焦荧光成像图。其中，a图为Mito-Tracker Green的荧光成像图（488nm激发，500-540nm收集）；b图为化合物4的荧光成像图（552nm激发，590-650nm收集）；c图为a图和b图的叠加图。

图51.0μM化合物4和市售线粒体荧光探针Mito-Tracker Green在HeLa细胞中共同孵化后的共聚焦荧光成像图。其中，a图为Mito-Tracker Green的荧光成像图（488nm激发，500-540nm收集）；b图为化合物4的荧光成像图（552nm激发，590-650nm收集）；c图为a图和b图的叠加图。

图6化合物4的MTT细胞毒性实验。

具体实施方式

取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法包括以下步骤：

a、将取代的水杨醛和1,2-二溴乙烷溶于无水有机溶剂中，然后再加入的无水碳酸钾，在40～80℃下反应12～24小时，制备得到中间体1；所述无水碳酸钾的用量为取代水杨醛的1.2～2倍当量；

b、将中间体1与TCF在室温下反应，以碱作为催化剂，反应时间为4～8小时，制备得到中间体2；所述中间体1与TCF的摩尔比为1:1～1.5:1；所述碱的用量为TCF的1～5倍当量；

c、将中间体2、三苯基膦和碘化钾，在无水乙腈或DMF中回流反应24～48h，制备得到取代的水杨醛-TCF衍生物；所述中间体2与三苯基膦的摩尔比为1:2～1:5；所述碘化钾的用量为中间体2的1～2倍当量。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤b所述的有机碱为无水醋酸铵、哌啶或者***啉中的任意一种。优选的，所述的有机碱为无水醋酸铵。

其中，上述取代的水杨醛-TCF衍生物的制备方法中，步骤b所述反应的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或无水四氢呋喃：无水乙醇=4:1～1:4（V/V）的混合溶剂中的任意一种。

在合成中间体1的过程中，通过实验发现，使用无水DMF作溶剂时，反应会有很多杂点产生，而且产率很低。换用无水丙酮作溶剂后，杂点明显减少，产率也有适当提高。未反应的水杨醛原料可以通过柱层析色谱回收，回收产率较高。

在合成中间体2的过程中，中间体1和TCF的摩尔比优选为1.2:1，无水醋酸铵用量优选为TCF的4倍当量。THF/EtOH的比例可以适当调整。THF的作用时溶解TCF，EtOH的作用时溶解无水醋酸铵。另外，由于中间体2在EtOH中的溶解性较差，EtOH含量的适当增加可以利于产物的析出。反应溶剂可以随着碱的不同而变化。

在合成取代的水杨醛-TCF衍生物的过程中，优选三苯基膦的用量为中间体2的3倍当量，KI的用量为中间体2的2倍当量。加入KI是为了促进亲核取代反应的进行。反应需要TLC监测，24小时基本反应完。

本发明实施例中，HeLa细胞株购于ATCC（American Type Culture Collection）公司，10%胎牛血清购于Hyclone公司，DMEM（H）培养基购于美国Gibco。细胞核染料NucBlue和线粒体染料Mito-Tracker Green均购自于Life Technologies公司。

实施例1中间体1的合成：

将4-二乙基氨基水杨醛（1.93g，10mmol）、1,2-二溴乙烷（4.3mL，50mmol）溶于40mL无水丙酮，然后加入无水碳酸钾（1.66g，12mmol）。反应升温至60℃回流。TLC监测反应不再进行时，减压除去溶剂，加入60mL二氯甲烷溶解。有机相依次用水、饱和食盐水洗涤三次后用无水硫酸钠干燥。随后减压除去溶剂，将所得粗产物用300-400目细硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯5:1，最后得到红褐色固体约500mg，产率为16.7%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.21(s,1H),7.75(d,J=9.0Hz,1H),6.34(dd,J=9.0,2.0Hz,1H),6.02(d,J=2.3Hz,1H),4.39(t,J=6.2Hz,2H),3.71(t,J=6.2Hz,2H),3.44(q,J=7.1Hz,4H),1.24(t,J=7.1Hz,6H)。

实施例2中间体2的合成：

将中间体1（90mg，0.3mmol）和TCF（50mg，0.25mmol）溶于2mL无水THF，然后加入3mL无水EtOH。一次性加入无水醋酸铵（77mg，1.0mmol），室温下搅拌，溶液很快就变为蓝色，随即有固体析出。6小时后停止反应，抽滤，用少量冷的无水乙醇洗涤两次，得到蓝色固体100mg，产率为83.3%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.11(d,J=16.0Hz,1H),7.56(d,J=9.2Hz,1H),6.87(d,J=16.0Hz,1H),6.42(d,J=9.2Hz,1H),6.04(s,1H),4.42(t,J=5.5Hz,2H),3.80(t,J=5.5Hz,2H),3.51(q,J=7.1Hz,4H),1.79(s,6H),1.29(t,J=7.1Hz,6H)。

实施例31-(碘化2’-三苯基鏻乙氧基-4’-二乙胺基）苯基-2-[(2’’,2’’-二甲基-4’’-腈基-5’’-二腈甲基-2’’,5’’-二氢）]3’’-呋喃基-（E）-乙烯（化合物4）的合成：

将中间体2（96mg，0.2mmol）和三苯基膦（156mg，0.6mmol）溶于20mL无水乙腈中，加入KI（66mg，0.4mmol）。在氮气保护下，将反应加热到80℃回流。TLC监测至反应基本不再进行，减压除去溶剂，将所得粗产品直接用300-400目细硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷/甲醇=5:1（V/V）。最终得到蓝色固体107mg，产率为67.7%。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(d,J=16Hz,1H),7.88–7.72(m,9H),7.67(m,6H),7.51(d,J=9.2Hz,1H),6.38(d,J=9.2Hz,1H),6.28(s,1H),6.21(d,J=16Hz,1H),5.05–4.87(m,2H),4.13(dt,J=10.3,5.1Hz,2H),3.57(q,J=7.0Hz,4H),1.63(s,6H),1.25(t,J=7.1Hz,6H);¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ177.2,174.5,160.5,154.8,144.2,135.1,134.3,130.4,117.8,116.9,113.5,112.7,111.8,107.5,105.2,96.3,94.8,63.3,51.8,45.7,26.4,24.9,24.4,12.9.

HRMS calcd for C₄₂H₄₀N₄O₂P⁺[M-I]⁺:663.2883,found:663.2878。

实施例4化合物4在HeLa细胞（子***细胞）中与NucBlue的共成像

首先，在含10%胎牛血清的DMEM（H）培养基中，通5%CO₂，将HeLa细胞于37℃下培育24小时。然后将培养基去除后，加入含有5μM化合物4的生理盐水并加入1滴市售细胞核染料NucBlue的溶液，共培养30分钟，取出培养皿，用生理盐水洗3次后，将培养皿放在荧光共聚焦显微镜上成像得到图3。

图3a中激发光为405nm，收集420-470nm波段；图3b中激发光为552nm，收集590-650nm波段。从图3的叠加图c可以看出，化合物4能够很好的进入细胞并主要分布在细胞质中。

实施例5化合物4在HeLa细胞中与Mito-Tracker Green的共成像：

首先，在含10%胎牛血清的DMEM（H）培养基中，通5%CO₂，将HeLa细胞于37℃下培育24小时。然后将培养基去除后，加入含有0.5μM或1.0μM化合物4的生理盐水并加入0.5μM市售细胞线粒体染料Mito-Tracker Green，共培养30分钟，取出培养皿，用生理盐水洗3次后，将培养皿放在荧光共聚焦显微镜上成像得到图4、图5。

图4、图5两幅图中，a图中激发光为488nm，收集500-540nm波段；b图中激发光为552nm，收集590-650nm波段。从叠加图c可以看出，化合物4的染色区域和市售线粒体染料基本一致，说明化合物4的浓度为0.5μM和1.0μM时均有很好的示踪效果。

实施例6化合物4的细胞毒性实验：

将处于对数生长期的HeLa细胞接种于96孔培养板中，每孔接种3000个细胞，用含10%胎牛血清的DMEM(H)培养基在37℃，5%CO₂条件下培养过夜。待细胞完全贴壁，加入不同浓度梯度的化合物4，每个浓度设3个复孔，同时设空白对照组。加药后继续培养24小时，MTT法检测细胞的抑制率。

如图6所示，在浓度范围0.625～40μM范围内，化合物4的细胞毒性非常小。

本发明提供的取代的水杨醛-TCF衍生物具有毒副性小、原料简单易得、整条合成路线可操作性强、反应条件也比较温和、总体成本较低等优势，和现有的昂贵的线粒体标记物相比，无疑更有市场竞争力。

Claims

1.取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物，其结构式如式Ⅰ所示：

其中，R为C1～C8烷氧基、

-NH₂或-OH；R₁～R₃独立地为C1～C8烷基或C1～C8羰基。

2.根据权利要求1所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物，其特征在于：R为C1～C4烷氧基、-NH₂或-OH；R₁～R₃独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基；

优选的，R为C1～C4烷氧基、

R₁～R₃独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基；

进一步优选的，R为

R₁～R₃独立地为C1～C4烷基或C1～C4羰基；

更进一步优选的，R为

R₁、R₂独立地为C1～C4烷基；

最优的，R为二乙基氨基。

3.权利要求1或2所述取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，包括以下步骤：

b、将中间体1与2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃在室温下反应，以碱作为催化剂，反应时间为4～8小时，制备得到中间体2；

c、将中间体2、三苯基膦和碘化钾，在无水乙腈或N,N-二甲基甲酰胺中回流反应24～48小时，制备得到取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物。

4.根据权利要求3所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤a所述的无水有机溶剂为无水丙酮、无水N,N-二甲基甲酰胺、无水乙腈中的任意一种。

5.根据权利要求3所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤a所述无水碳酸钾的用量为取代水杨醛的1.2～2倍当量。

6.根据权利要求3所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤b所述中间体1与2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的摩尔比为1:1～1.5:1。

7.根据权利要求3所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤b所述的碱为无水醋酸铵、哌啶或者***啉中的任意一种；所述碱的用量为2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃的1～5倍当量。

8.根据权利要求3所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤b所述反应的溶剂为甲醇、乙醇、乙腈或无水四氢呋喃：无水乙醇=4:1（V/V）的混合溶剂中的任意一种。

9.根据权利要求3所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物的制备方法，其特征在于：步骤c所述中间体2与三苯基膦的摩尔比为1:2～1:5；所述碘化钾的用量为中间体2的1～2倍当量。

10.权利要求1或2所述的取代的水杨醛-2-二氰基亚甲基-3-氰基-4,5,5-三甲基-2,5-二氢呋喃衍生物在对线粒体进行染色标记中的用途。