CN103703017A - 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用 - Google Patents

萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103703017A
CN103703017A CN201280029518.7A CN201280029518A CN103703017A CN 103703017 A CN103703017 A CN 103703017A CN 201280029518 A CN201280029518 A CN 201280029518A CN 103703017 A CN103703017 A CN 103703017A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
victory peptide
group
solvent
victory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280029518.7A
Other languages
English (en)
Inventor
狄迪尔·莫乃
路希亚诺·佛倪
梅堤修·格欧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza Braine SA
Lonza AG
Original Assignee
Lonza Braine SA
Lonza AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Braine SA, Lonza AG filed Critical Lonza Braine SA
Publication of CN103703017A publication Critical patent/CN103703017A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1021—Tetrapeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法，所述反应混合物含有所述胜肽及选自由N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组的极性非质子性溶剂，其中所述方法包含步骤a）及步骤b）；步骤a）包含向所述反应混合物中添加组分a1）及组分a2）；其中，组分a1）为甲苯且组分a2）为水，从而获得具有有机层及水层的两相***；步骤b）包含随后分离含有所述胜肽的所述有机层与所述水层。在本发明的一个尤其优选的具体实例中，对该萃取方法使用甲苯与选自由正庚烷、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈及四氢呋喃组成的组的有机溶剂1的组合。该萃取步骤优选用于在液相中制备胜肽的方法中。

Description

萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用
技术领域
本发明涉及一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法。此方法优选用于液相胜肽合成（LPPS）方法中。从反应混合物中萃取胜肽的方法也可用于其他类型的胜肽合成中，例如用于由固相胜肽合成（SPPS）所制备的合成胜肽的裂解后分离。此方法也适用于混合型固相-液相胜肽合成。此外，该萃取胜肽的方法可用于从例如酵母或细菌的天然来源分离胜肽，尤其用于分离重组表达的胜肽。
背景技术
在本申请案的正文中，若未另外陈述，则根据“Nomenclature and symbolismfor amino acids and peptides”, Pure & Appl. Chem. 1984, 第56卷, 第5期, 第595-624页使用胺基酸及胜肽的命名。
若未另外陈述，则以下缩写具有以下清单中所提供的含义：
ACN       乙腈
Boc       叔丁氧基羰基
Bsmoc     1,1-二侧氧基苯并[b]噻吩-2-基甲氧基羰基
Bzl       苯甲基
Cbz       苯甲氧羰基
DCC       N,N'-二环己基碳二亚胺
DCM       二氯甲烷
DEA       二乙胺
DIPE      二异丙醚
DIPEA     N,N-二异丙基乙胺
DMA       N,N-二甲基乙酰胺
DMF       N,N-二甲基甲酰胺
EDC       1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺
eq        当量
EtOAc     乙酸乙酯
Fmoc      芴基-9-甲氧羰基
h         小时
HOBt      1-羟基苯并***
HOBt·H2O 单水合1-羟基苯并***
HPLS      高效液相层析
LPPS      液相胜肽合成
MeTHF     2-甲基四氢呋喃
min       分钟
MS        质谱
NMP       N-甲基-2-吡咯啶酮
OMe       甲氧基
OtBu      叔丁氧基
PG        保护基
PyBOP     六氟磷酸苯并***-1基氧基-参(吡咯啶基)-鏻
SPPS      固相胜肽合成
TAEA      参(2-胺基乙基)胺
TBTU      四氟硼酸O-(苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲
tBu       第三丁基
TEA       三乙胺
TFA       三氟乙酸
THF       四氢呋喃
TLC       薄层层析
TOTU      四氟硼酸O-[氰基(乙氧基羰基)亚甲基胺基]-1,1,3,3-四甲脲
Trt       三苯甲基
UV        紫外线
萃取胜肽的方法一般用于各种类型的胜肽合成，例如液相胜肽合成（LPPS）、固相胜肽合成（SPPS）以及混合型固相-液相胜肽合成。
LPPS尤其常用于胜肽的工业大规模制备。LPPS典型地涉及使两种部分受保护的胺基酸或胜肽偶合，其中一者携带未受保护的C末端羧酸基，而另一者携带未受保护的N末端胺基。在完成偶合步骤之后，所得胜肽的N末端胺基或者C末端羧酸基可通过特异性裂解其保护基（PG）之一而脱除保护基，以便可进行后续偶合步骤。LPPS通常以整体脱除保护基的步骤来结束，在该步骤中移除所有剩余PG。
在LPPS期间对胜肽，尤其携带未受保护的C末端羧酸基及/或未受保护的N末端胺基的胜肽的处置往往因为胜肽在普通有机溶剂中的不良溶解度而受影响。一般而言，胜肽在普通有机溶剂中的溶解度随胜肽链的长度而降低。
二氯甲烷（DCM）通常在LPPS中用作适合反应溶剂。DCM具有良好溶剂性质、低沸点，且其与水的有限混溶性允许通过用水溶液萃取来处理反应混合物。然而，按工业规模使用DCM由于环境原因而成问题，且一般由于其高密度而受限制，这使得用水溶液萃取DCM层耗时又费钱。
此外，一些最近开发且高度有效的偶合试剂，例如六氟磷酸苯并***-1-基氧基-参(吡咯啶基)-鏻（PyBOP）及四氟硼酸O-(苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲（TBTU），在DCM中的溶解性不良。这些偶合试剂尤其有利于偶合两个较大胜肽片段，据悉其在使用其他偶合试剂时产率较低。
此外，许多胜肽仅在中性及碱性条件下在DCM中展现不良溶解度，且仅足以溶于极性非质子性溶剂中，例如N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二甲基乙酰胺（DMA）或N-甲基-2-吡咯啶酮（NMP）。因此，这些极性非质子性溶剂通常单独或呈与较低极性的溶剂（例如四氢呋喃（THF））的混合物形式用作LPPS中的反应溶剂。
另一方面，对LPPS使用极性非质子性溶剂存在许多缺点。因为极性非质子性溶剂具有高沸点，因此难以通过蒸发来浓缩反应混合物。此外，不能通过用水溶液萃取来直接处理反应混合物，因为极性非质子性溶剂可与水混溶。
当按工业规模进行LPPS时，通常通过在各偶合步骤之后从反应混合物中直接沉淀来分离中间物胜肽，以便可分离杂质，例如未反应的起始物质、副产物以及过量偶合试剂及碱等。在完成胜肽偶合反应之后，典型地将反应混合物倾入反溶剂（例如***或水）中，从而发生胜肽沉淀析出现象。不幸的是，已获悉将反应混合物转移至反溶剂中会引发凝胶形成问题。
此外，极性非质子性溶剂通常干扰胜肽沉淀过程，从而所获得的沉淀胜肽呈黏稠胶状固体形式，其难以过滤且难以干燥。在有些情况下，不能过滤沉淀胜肽或甚至不能将沉淀胜肽转移至过滤器上。特定言之，按工业规模进行的胜肽沉淀通常难以进行且极其耗时，其中过滤时间决定前置时间（lead time）。此问题可通过在沉淀过程中增加反溶剂:极性非质子性溶剂的体积比来部分克服，从而实际上需要大量适合反溶剂来获得呈可过滤形式的沉淀胜肽。
此外，已知沉淀胜肽中所存在的极性非质子性溶剂残余物干扰后续脱除保护基的步骤，该步骤涉及三氟乙酸（TFA）。因此，在可使酸可裂解型PG（例如叔丁氧基羰基（Boc）、三苯甲基（Trt）、第三丁基（tBu）及叔丁氧基（OtBu））裂解之前，必需另一通过用更具挥发性的溶剂洗涤沉淀胜肽来移除极性非质子性溶剂残余物的步骤。
现有技术
WO2005/081711是关于药物-连接符-配位体结合物及药物-连接符化合物以及使用其治疗癌症、自体免疫疾病或传染病的方法。该文献尤其揭示制备基于胜肽的药物的方法以及使用乙酸乙酯、二氯甲烷及tBuOH/CHCl3混合物萃取胜肽的方法。
US5,869,454关于精胺酸酮酰胺酶抑制剂。该文献尤其揭示这些抑制剂的合成及用乙酸乙酯萃取。
US2005/0165215涉及合成胜肽的方法及在合成过程中分离胜肽的方法。该文献进一步涉及大规模合成胜肽的改良。该文献提出，适用于胜肽萃取的溶剂包括卤化有机溶剂，例如二氯丙烷、二氯乙烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氟氯碳化物、氯氟烃及其混合物。优选溶剂为二氯甲烷。
C.H.Schneider等人（Int.J.Peptide Protein Res.1980,15,第411至419页）描述一种基于用于纯化中间物的液-液萃取（双相法）在溶液中合成胜肽的程序。该胜肽萃取采用二氯甲烷作为溶剂。
J.W.van Nispen（Pure and Appl.Chem.1987,第59卷,第3期,第331-344页）提供关于(聚)胜肽的合成及分析的概述。该文献启示，为了发现胜肽组分的最佳分离法，有可能尝试具有广泛不同的性质的溶剂的许多组合。为此目的，通常采用所谓Craig机器，其中在乘法分布时，下层相保持其位置，而上层相则可移动。
US2010/0184952揭示一种从通过经Fmoc基团保护的胺基酸化合物与胺反应所获得的反应混合物中移除二苯富烯及/或二苯富烯胺加合物以脱除保护基的方法，该方法包含搅拌该反应混合物且使其分配在碳数为5或5以上的烃溶剂与不可与该烃溶剂混溶的极性有机溶剂（不包括有机酰胺溶剂）之间，且移除烃溶剂层，其中二苯富烯及/或二苯富烯胺加合物为溶解于该烃溶剂层中。在此方法期间，将胺基酸酯或胜肽转移至极性有机溶剂中。该等极性有机溶剂的实例包括乙腈、甲醇、丙酮及其类似物及其混合溶剂，优选为乙腈及甲醇。
L.A.Carpino等人（Organic Process Research&Development2003,7,第28-37页）描述一种快速连续的溶液相胜肽合成。据显示，在参(2-胺基乙基)胺存在下脱除胜肽片段的Fmoc及Bsmoc保护基的方法适用于以克（gram）规模快速连续地在溶液中合成短胜肽以及合成相对较长（22聚体）的片段（hPTH13-34）。在后一情况下，据报导，粗产物与经固相方案获得的样品相比具有显著更大的纯度。通过一项新技术优化Bsmoc方法，该技术涉及在各偶合脱除保护基周期中经短硅胶柱过滤逐渐部分脱除保护基的胜肽。
然而，由L.A.Carpino等人所述的方法具有若干限制性。此方法采用DCM作为反应溶剂且因此，无法应用于制备在DCM中显示不良溶解度的胜肽。此外，其采用大量高成本的参(2-胺基乙基)胺（TAEA），这进一步限制了此方法工业规模化的适用性。
因此，强烈需要一种用于制备胜肽（尤其按工业规模制备胜肽）的具有时间及成本效益的合成方法。该方法必须克服由在LPPS期间使用DCM及极性非质子性溶剂（例如DMF、DMA及NMP）所产生的缺点。
发明内容
本发明的作者意外发现大量结构不同的胜肽在优选与选自由正庚烷、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈或四氢呋喃组成的组（此组称为有机溶剂1）的有机溶剂组合的甲苯中具有极佳溶解度。尤其是，胜肽在甲苯与有机溶剂1的组合中的溶解度一般高于在纯甲苯中的溶解度。此外，其发现常用极性非质子性溶剂在很大程度上分配于包含水及甲苯或甲苯与有机溶剂1的组合的两相***中的水层中。
因此，水及纯甲苯或甲苯与有机溶剂1的组合非常适用于从含有极性非质子性溶剂的混合物中萃取胜肽。在本发明具体实例之一中，将含有胜肽的所得有机层部分蒸发，且在添加适合反溶剂（此溶剂组称为有机溶剂2）后使其中所溶解的胜肽沉淀。因为在胜肽沉淀过程中实质上不存在极性非质子性溶剂，因此可容易地过滤所得胜肽。通过应用本发明的萃取方法，可显著减少胜肽过滤所需的时间。因此，通过应用此种萃取方法，可成功克服在LPPS期间使用极性非质子性溶剂所致的缺点。
本发明涉及一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法，该反应混合物含有该胜肽及选自由N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组的极性非质子性溶剂，其中该方法包含步骤a）及步骤b）：
步骤a）包含向该反应混合物中添加组分a1）及组分a2），其中：
组分a1）为甲苯；
组分a2）为水；
从而获得具有有机层及水层的两相***；
步骤b）包含分离含有该胜肽的有机层与水层，其中：
步骤a）中所获得的该两相***的特征在于以下体积比：
极性非质子性溶剂:甲苯=1:20至1:2；且
极性非质子性溶剂:水=1:20至1:2。
本发明的优选具体实例之一涉及一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法，该反应混合物含有该胜肽及选自由N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组的极性非质子性溶剂，其中该方法包含步骤a）及步骤b）：
步骤a）包含添加组分a1）、组分a2）及组分a3），其中：
组分a1）为甲苯；
组分a2）为水；
组分a3）为有机溶剂1，该有机溶剂1选自由正庚烷、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈及四氢呋喃组成的组；
从而获得具有有机层及水层的两相***；
步骤b）包含分离含有该胜肽的有机层与水层，其中：
步骤a）中所获得的该两相***的特征在于以下体积比：
极性非质子性溶剂:甲苯=1:20至1:2；
极性非质子性溶剂:有机溶剂1=1:5至30:1；
极性非质子性溶剂:水=1:20至1:2；且
甲苯:有机溶剂1=50:1至1:1。
在一个优选具体实例中，步骤a）中所获得的该两相***的特征在于以下体积比：
极性非质子性溶剂:甲苯=1:6至1:3；
极性非质子性溶剂:有机溶剂1=1:1至4:1；
极性非质子性溶剂:水=1:5至1:3；且
甲苯:有机溶剂1=10:1至2:1。
在一个尤其优选的具体实例中，极性非质子性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯啶酮。
在本发明的又一具体实例中，两相***中不存在有机溶剂1。
在本发明的优选具体实例之一中，萃取胜肽而不是使其沉淀。作为替代，使胜肽的一个或若干个保护基裂解，且萃取所产生的部分未受保护的胜肽，且将包含该胜肽的有机层用于后续胜肽偶合反应。因此，本发明提供一种用于连续LPPS的有效合成方法，该方法适合于按工业规模制备胜肽。
本发明的连续LPPS非常适用于在使用Boc、Fmoc及Bzl作为保护基时的胜肽合成，正如下文的实施例所说明。
萃取方法
本发明涉及一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法，该反应混合物含有该胜肽及极性非质子性溶剂，其中该方法包含步骤a）及步骤b）：
步骤a）包含向该反应混合物中添加组分a1）及组分a2），其中：
组分a1）为甲苯；
组分a2）为水；
从而获得具有有机层及水层的两相***；
步骤b）包含随后分离含有该胜肽的有机层与水层。
本发明的优选具体实例之一涉及一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法，该反应混合物含有该胜肽及选自由DMF、DMA及NMP组成的组的极性非质子性溶剂，其中该方法包含步骤a）及步骤b）：
步骤a）包含添加组分a1）、组分a2）及组分a3），其中：
组分a1）为甲苯；
组分a2）为水；
组分a3）为有机溶剂1，该有机溶剂1选自由正庚烷、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈及四氢呋喃组成的组；
从而获得具有有机层及水层的两相***；
步骤b）包含分离含有该胜肽的有机层与水层。
视情况将组分a1）、组分a2）及组分a3）彼此混合，其中此步骤可以任何顺序进行。三种组分也可以以两种组分或所有组分的预混合混合物形式添加，只要在萃取过程中不发生胜肽沉淀即可。
含有极性非质子性溶剂的混合物优选为由胜肽偶合反应所产生的粗反应混合物。此混合物优选不含可充当界面活性剂且在萃取过程中干扰相分离的任何化合物。在一个尤其优选的具体实例中，该混合物不含现有技术中已知的任何界面活性剂，例如阳离子型表面活性剂及非离子型表面活性剂。
向含有胜肽及极性非质子性溶剂的混合物中添加组分a1）、组分a2）及组分a3）可以任何顺序进行，只要在萃取过程中不发生胜肽沉淀即可。举例而言，可能组合含有胜肽及极性非质子性溶剂的混合物与甲苯，向其中添加水，且最后添加有机溶剂1。也可以将含有胜肽及极性非质子性溶剂的混合物转移至水及甲苯中，然后向其中添加有机溶剂1。
在本发明的尤其优选的具体实例中，将含有胜肽及极性非质子性溶剂的混合物与甲苯及有机溶剂1组合，其中可以以任何顺序添加甲苯及有机溶剂1。随后向其中添加水。
应了解，所添加的水（组分a2））可含有溶解的组分，例如盐，例如无机盐。
优选的是用力搅拌所获得的两相***。可使用技术现状下已知且常用于萃取的混合设备来进行搅拌所获得的两相***的过程。举例而言，在分批萃取的情况下，可采用喷射型或搅拌器型混合器来搅拌两相***。
适合萃取设备的选择主要视所进行的萃取方法的规模以及萃取温度而定。可通过使用分批萃取或连续萃取来进行萃取过程。需要时也可重复萃取过程若干次，从而达成对胜肽的最佳萃取。
在进行搅拌过程之后，优选允许进行相分离，其中形成两个液体层：有机层及水层。有机层与水层相比具有低密度。可使用沉降槽或利用离心来实现相分离。相分离所需的时间视所进行的萃取方法的规模及所用设备而定。相分离优选需要不到1小时，更优选为不到10分钟，尤其优选为不到1分钟。
在进行相分离之后，胜肽主要位于有机层中，有机层另外含有甲苯及视情况存在的有机溶剂1。将含有胜肽的上层有机层与水层分离。优选在萃取过程之后，超过90重量%的胜肽位于有机层中，且少于10重量%的胜肽位于水层中。进一步更优选在萃取过程之后，超过98重量%的胜肽位于有机层中，且少于2重量%的胜肽位于水层中。尤其优选在萃取过程之后，超过99重量%的胜肽位于有机层中，且少于1重量%的胜肽位于水层中。
本发明的萃取方法允许从由胜肽偶合反应所产生的粗反应混合物中有效萃取胜肽。极性非质子性溶剂在有机层中的溶解度显著低于在水层中的溶解度。因此，在萃取之后，含有胜肽的有机层仅另外含有低量极性非质子性溶剂。
优选在萃取过程之后，少于15体积%极性非质子性溶剂位于有机层中，且超过85体积%极性非质子性溶剂位于水层中。然而，更优选在萃取过程之后，少于5体积%极性非质子性溶剂位于有机层中且超过95体积%极性非质子性溶剂位于水层中。尤其优选在萃取过程之后，少于2体积%极性非质子性溶剂位于有机层中且超过98体积%极性非质子性溶剂位于水层中。此可能需要重复萃取。
重要的是，根据本发明的萃取方法不仅允许使胜肽与很大一部分的极性非质子性溶剂分离，而且可与起源于偶合试剂（脲类、四氟硼酸盐等）的盐及副产物分离。若在添加疏水性反溶剂（例如正庚烷或***）后从由胜肽偶合反应所产生的粗反应混合物中直接沉淀，则通常无法移除这些盐及副产物。然而，已知这些盐及副产物会降低用于胜肽下游处理的层析管柱的容量。若所制备的胜肽用作活性医药成分，则有必要通过管柱层析法进行此额外纯化。
因此，在有需要时，随后可通过管柱层析法来纯化沉淀胜肽。在胜肽用作活性医药成分的情况下，使用这些额外纯化步骤。因此，根据本发明的萃取方法与使用从反应混合物中直接沉淀的方法相比允许以更高纯度分离胜肽。
在萃取过程中所获得的两相***的组成对胜肽及极性非质子性溶剂在有机层与水层的间的分布系数有极大影响。在下文中，以体积:体积比率形式提供比率。
优选极性非质子性溶剂:甲苯的体积比在1:20至1:2范围内。优选此体积比在1:10至1:2范围内。尤其优选此体积比在1:6至1:3范围内。
据显示，胜肽在甲苯与有机溶剂1的组合中的溶解度高于在纯甲苯中的溶解度。因此，当有机溶剂1的用量足够高时，在萃取过程中所获得的胜肽在有机层中的溶解度尤其高。优选极性非质子性溶剂:有机溶剂1的体积比在1:5至30:1范围内。优选此体积比在1:3至10:1范围内。尤其优选此体积比在1:1至4:1范围内。
优选甲苯:有机溶剂1的体积比在50:1至1:1范围内。优选此体积比在20:1至2:1范围内优选。尤其优选此体积比在10:1至2:1范围内。
极性非质子性溶剂:水的体积比对萃取过程的效率及胜肽于水层中的溶解度有显著影响。详言之，如果两相***中的极性非质子性溶剂:水体积比高于1:2，也即如果水层含有超过34体积%极性非质子性溶剂，则胜肽在水层中具有显著较高的溶解度。因此，优选极性非质子性溶剂:水的体积比在1:20至1:2范围内。优选此体积比在1:10至1:3范围内。尤其优选此体积比在1:5至1:3范围内。
含有胜肽的混合物中所存在的极性非质子性溶剂优选选自由DMF及NMP组成的组。
因此，纯甲苯及甲苯与有机溶剂1的组合尤其适用于胜肽萃取方法。甲苯为容易再循环的低成本溶剂，其对人类及水生生物的毒性相对较低。因此，本发明宜按工业规模使用。
若有机溶剂1选自由正庚烷、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯（EtOAc）、乙酸异丙酯、乙腈（ACN）及四氢呋喃（THF）组成的组，更优选选自由EtOAc、乙酸异丙酯、ACN及THF组成的组，尤其优选选自由ACN及THF组成的组，则胜肽在甲苯与有机溶剂1的组合中的溶解度尤其高。在胜肽萃取方法的一个尤其优选的具体实例中，有机溶剂1选自由ACN及THF组成的组。
对胜肽萃取方法所用的组分a2）可仅由水组成。然而，若组分a2）另外含有至少一种无机盐，则会显著降低组分a2）中的甲苯及有机溶剂1的可混溶性，且因此显著降低胜肽于水层中的溶解度。此外，若组分a2）含有至少一种无机盐，则降低有机层中的水含量。
在优选具体实例之一中，组分a2）含有至少一种选自由氯化钠、硫酸氢钠、硫酸氢钾、碳酸氢钠及磷酸氢钠组成的组的无机盐。在其他具体实例中，组分a2）也可含有其他化合物，例如酸。
特定而言，组分a2）可含有在2至11的pH值范围内不充当缓冲剂的无机盐。添加该等无机盐可降低胜肽于水层中的溶解度且减少萃取过程中的相分离所需的时间。举例而言，组分a2）可含有氯化钠或硫酸钠。组分a2）中所存在的无机盐的浓度优选在1重量%至20重量%范围内，进一步更优选为5重量%至15重量%。使用盐（如氯化钠）来促进两相分离，且使用充当缓冲剂的盐来选择性地萃取水层中的酸或碱。
组分a2）的pH值可对胜肽的溶解度以及水层中有些杂质的溶解度具有极大影响。此外，组分a2）的pH值的选择视胜肽的化学稳定性以及其PG的化学稳定性而定。组分a2）的pH值优选在2至11范围内，尤其优选为5至8，从而用于胜肽偶合反应的叔碱在萃取过程中主要留在水层中。可通过添加酸或碱及/或使用缓冲剂来调节组分a2）的pH值。
可用于调节组分a2）的pH值的酸的选择不受特别限制，只要组分a2）中所存在的酸不干扰胜肽萃取过程且不引起胜肽降解即可。举例而言，布氏酸（
Figure GDA0000462857840000111
acid）可用于此目的，例如有硫酸、盐酸、磷酸、三氟乙酸或柠檬酸。
可用于调节组分a2）的pH值的碱的选择不受特别限制，只要组分a2）中所存在的碱不干扰胜肽萃取过程且不引起胜肽降解即可。举例而言，碱金属氢氧化物适用于调节组分a2）的pH值，例如有氢氧化钠、氢氧化钾及氢氧化锂。
组分a2）优选含有缓冲剂，以便在萃取过程中将水层的pH值保持在所要范围内。缓冲剂优选选自由氯化铵、硫酸氢钠、硫酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸氢钠、磷酸二氢钠及磷酸钠组成的组。组分a2）中所存在的缓冲剂的浓度优选在1重量%至10重量%范围内，进一步更优选为3重量%至8重量%。
所获得的含有胜肽的有机层视情况可另外用水溶液洗涤至少一次。用于此目的的水溶液的pH值优选在2至11范围内。
视胜肽偶合反应条件及所用试剂而定，有机层可含有呈杂质形式的具有自由伯胺基、仲胺基或三级胺基的化合物，例如具有不受保护的N末端胺基的胜肽或叔碱。在该等情况下，优选用pH值为2至7的水溶液洗涤有机层。
在其他情况下，有机层可含有具有自由羧酸基的化合物，例如具有不受保护的C末端羧酸基的胜肽。在这些情况下，优选用pH值为7至11的水溶液洗涤有机层。
适于进行胜肽萃取过程所处的温度（在下文中称为萃取温度）视所用溶剂的选择以及胜肽的性质而定。萃取温度对所用溶剂的可混溶性及胜肽于有机层及水层中的溶解度具有极大影响。因此，以一定方式选择萃取温度，从而在萃取过程中形成两相***且胜肽于有机层中的溶解度足够高。胜肽萃取过程优选在0℃至60℃的萃取温度下进行。萃取温度在20℃至30℃范围内尤其优选。
视胜肽偶合反应条件及所用偶合试剂而定，可在萃取过程之前及/或期间形成固体。举例而言，若使用碳二亚胺作为偶合试剂，则可能如此。为此，可能需要在组合含有胜肽、极性非质子性溶剂的混合物、甲苯、视情况选用的有机溶剂1及组分a2）之后，对所获得的两相***进行过滤。因此，在本发明具体实例之一中，在分离含有胜肽的有机层之前对两相***进行过滤。
通过本发明萃取方法萃取的胜肽可为任何胜肽。通过该萃取方法萃取的胜肽优选包含100或100个以下胺基酸残基，更优选包含50或50个以下胺基酸残基，最佳包含20或20个以下胺基酸残基。胜肽的胺基酸可为D-α-胺基酸及/或L-α-胺基酸、D-β-胺基酸及/或L-β-胺基酸以及含有至少一个伯胺基及/或仲胺基及至少一个羧酸基的其他有机化合物。胺基酸优选为α-胺基酸，进一步更优选为L-α-胺基酸，其中蛋白型胺基酸尤其优选。
制备胜肽
本发明的另一状态涉及一种在液相中制备胜肽的方法，该方法包含步骤aa）、步骤bb）及步骤cc）：
在步骤aa）中，在存在偶合试剂及视情况选用的叔碱的情况下，在选自由N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组的极性非质子性溶剂中进行胜肽偶合反应；
在步骤bb）中，根据上述方法萃取所产生的胜肽；及
在步骤cc）中，将步骤bb）中所获得的有机层的至少一部分蒸发。
作为用于根据步骤aa）的胜肽偶合反应的起始物质，采用两种部分受保护的胺基酸的组合、两种部分受保护的胜肽的组合或部分受保护的胺基酸与部分受保护的胜肽的组合。
根据本发明的在液相中制备胜肽的方法非常适合液相胜肽合成（LPPS）。在本发明具体实例之一中，根据步骤aa）的胜肽偶合反应采用通过SPPS制备的两种部分受保护的胜肽的组合。因此，本发明方法允许偶合胜肽片段且可与SPPS组合使用。
使用典型用于胜肽偶合反应的熟知过程参数及试剂进行根据步骤aa）的胜肽偶合反应。
胜肽偶合反应熟知在极性非质子性溶剂中且使用一或多种偶合试剂，优选在存在一或多种偶合添加剂的情况下且优选在存在一或多种叔碱的情况下来进行。
以一定方式选择用于胜肽偶合反应的偶合试剂，从而偶合试剂在胜肽偶合反应条件下不与极性非质子性溶剂反应，且与活性羧酸基相邻的立体对称中心不发生实质性差向异构化。因此，优选偶合试剂为O-1H-苯并***的鏻盐或脲盐及碳二亚胺偶合试剂。
鏻盐及脲盐优选选自由以下组成的组：
BOP（六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-参-(二甲基胺基)-鏻)；
PyBOP（六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-参吡咯啶鏻）；
HBTU（六氟磷酸O-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲）；
HCTU（六氟磷酸O-(1H-6-氯-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲）；
TCTU（四氟硼酸O-(1H-6-氯苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲）；
HATU（六氟磷酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲）；
TATU（四氟硼酸O-(7-氮杂苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲）；
TBTU（四氟硼酸O-(苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲脲）；
TOTU（四氟硼酸O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基胺基]-1,1,3,3-四甲脲）；
HAPyU（六氟磷酸O-(苯并***-1-基)氧基双-(吡咯啶基)-脲）；
PyAOP（六氟磷酸苯并***-1-基-氧基-参-吡咯啶鏻）；
COMU（六氟磷酸1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-侧氧基亚乙基胺基氧基)-二甲基胺基-吗啉基亚甲基)]-甲铵）；
PyClock（六氟磷酸6-氯-苯并***-1-基-氧基-参-吡咯啶鏻）；
PyOxP（六氟磷酸O-[(1-氰基-2-乙氧基-2-侧氧基亚乙基)胺基]-氧基三(吡咯啶-1-基)-鏻）；及
PyOxB（四氟硼酸O-[(1-氰基-2-乙氧基-2-侧氧基亚乙基)胺基]-氧基三(吡咯啶-1-基)-鏻）。
选自鏻或脲偶合试剂的优选偶合试剂为TBTU、TOTU及PyBOP。
碳二亚胺偶合试剂优选选自由二异丙基碳二亚胺（DIC）、二环己基碳二亚胺（DCC）及例如1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亚胺（EDC）的水溶性碳二亚胺（WSCDI）组成的组。
水溶性碳二亚胺作为碳二亚胺偶合试剂尤其优选，其中EDC最优选。
胜肽偶合反应中所用的叔碱优选与胜肽及偶合试剂相溶，且通过充当界面活性剂而不干扰萃取过程。
胜肽偶合反应中所用的该叔碱的共轭酸优选具有7.5至15、更优选为7.5至10的pKa值。该叔碱优选选自由以下组成的组：三烷基胺，例如N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）或三乙胺（TEA）；另外有N,N-二-C1-4烷基苯胺，例如N,N-二乙苯胺；2,4,6-三-C1-4烷基吡啶，例如柯林碱（2,4,6-三甲基吡啶）；或N-C1-4烷基吗啉，例如N-甲基吗啉，其中任何C1-4烷基相同或不同且彼此独立地为直链或分支链C1-4烷基。DIPEA、TEA及N-甲基吗啉作为用于胜肽偶合反应的叔碱尤其优选。
偶合添加剂优选为能够形成活性酯、更优选具有酸性亲核性N-羟基官能团的亲核性羟基化合物，其中N为酰亚胺或为N-酰基或N-芳基取代的三氮烯基，该三氮烯基型偶合添加剂优选为N-羟基苯并***衍生物（或1-羟基苯并***衍生物）或N-羟基苯并三嗪衍生物。这些偶合添加剂已描述于WO94/07910及EP0410182中。
优选偶合添加剂选自由以下组成的组：N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）、6-氯-1-羟基苯并***（Cl-HOBt）、N-羟基-3,4-二氢-4-侧氧基-1,2,3-苯并三嗪（HOOBt）、1-羟基-7-氮杂苯并***（HOAt）、1-羟基苯并***（HOBt）及2-氰基-2-羟基亚胺基乙酸乙酯（CHA）。CHA可以商标名
Figure GDA0000462857840000151
获得。CHA已被证明是有效耦合添加剂，因为与基于苯并***的偶合添加剂相比，对活性羧酸立体对称中心的差向异构化的抑制程度更高。此外，CHA与例如HOBt或Cl-HOBt相比***性较低，从而其处理较为有利，且作为另一优势，可通过反应混合物的颜色变化在视觉上监测偶合进展情况。HOBt优选用作胜肽偶合反应的偶合添加剂。
在本发明的优选具体实例中，胜肽偶合反应中的试剂组合选自由TBTU/HOBt/DIPEA、PyBOP/TEA、EDC/HOBt及EDC/HOBt/DIPEA组成的组。
用于胜肽偶合反应的反应溶剂选自由DMF、DMA、NMP或其混合物组成的组。胜肽偶合反应的尤其优选的反应溶剂选自由DMF及NMP组成的组。
反应溶剂优选实质上不含水。反应溶剂优选含有少于1重量%的水，更优选含有少于0.1重量%的水，进一步更优选含有少于0.01重量%的水，且尤其优选含有少于0.001重量%的水。溶剂中的水含量可通过卡尔费雪滴定（KarlFischer titration）根据先前技术中已知的标准测试方法ASTM E203-8来测定。
用于胜肽偶合反应的反应溶剂优选实质上不含选自由伯胺及仲胺、羧酸及脂族醇组成的组的杂质。若以低于化学计算量的量或化学计算量使用的任何起始物质中少于1摩尔%在胜肽偶合反应期间与这些杂质发生不需要的反应，则用于胜肽偶合反应的反应溶剂被视为实质上不含这些杂质。
适当反应温度的选择视所用偶合试剂以及胜肽稳定性而定。胜肽偶合反应优选在-15℃至50℃、更优选为-10℃至30℃、进一步更优选为0℃至25℃的反应温度下进行。
胜肽偶合反应优选在大气压下进行。然而，也可在高于大气压或稍低于大气压的压力下进行胜肽偶合反应。
优选在环境氛围下进行胜肽偶合反应。然而，例如氮气或氩气的保护性气体氛围也优选。
在本申请案中，术语“反应时间”是指直至实质上完成反应转化所需的时间。以低于化学计算量的量或化学计算量使用的起始物质的量降至其初始量的5摩尔%以下、优选降至其初始量的2摩尔%以下之后，认为反应转化实质上完成。可通过此项技术中已知的分析方法来监测反应进展情况，例如有分析型高效液相层析（HPLC）、薄层层析（TLC）、质谱（MS）或HPLC-MS，其中HPLC尤其适宜用于此目的。
胜肽偶合反应的反应时间优选在15分钟至20小时范围内，更优选为30分钟至5小时，进一步更优选为30分钟至2小时。
在有关胜肽偶合反应的反应条件的描述中，术语“份”意思是用作胜肽偶合反应的起始物质的胜肽及/或胺基酸的总重量的重量份数因子。优选使用1至30份，更优选使用5至10份反应溶剂。
优选使用0.9至5摩尔当量，更优选使用1至1.5摩尔当量的偶合试剂，摩尔当量为基于反应性C末端羧酸基的摩尔数。
优选使用0.1至5摩尔当量，更优选使用0.5至1.5摩尔当量的偶合添加剂，摩尔当量为基于偶合试剂的摩尔数。
优选使用1至10摩尔当量，更优选使用2至3摩尔当量的叔碱，摩尔当量为基于偶合试剂的摩尔数。
任何胜肽均可通过本发明的在液相中制备胜肽的方法来获得。
由本发明的在液相中制备胜肽的方法所获得的胜肽优选包含100或100个以下胺基酸残基，更优选包含50或50个以下胺基酸残基，最优选包含20或20个以下胺基酸残基。胜肽的胺基酸可为D-α-胺基酸及L-α-胺基酸、D-β-胺基酸及L-β-胺基酸以及含有至少一个伯胺基及/或仲胺基及至少一个羧酸基的其他有机化合物。由本发明的在液相中制备胜肽的方法所获得的胜肽的胺基酸优选为α-胺基酸，进一步更优选为L-α-胺基酸，其中蛋白型胺基酸尤其优选。
在萃取过程之后，优选将含有胜肽的有机层部分蒸发。在本申请案中，所获得的层因此被称为“经部分蒸发的有机层”。进行部分蒸发所处的温度不受特别限制，且可根据胜肽的热稳定性以及甲苯或甲苯与有机溶剂1的混合物的性质加以选择。优选在30℃至50℃的温度下部分蒸发有机层。在有需要时在20毫巴至1000毫巴（20hPa至1000hPa）的减压下，优选在50毫巴至200毫巴（50hPa至200hPa）的减压下部分蒸发有机层。熟知此项技术者知道，优选根据所要蒸发温度来调节部分蒸发有机层所处的压力。
因为甲苯及有机溶剂1具有足够挥发性，因此可容易地部分蒸发含有胜肽的有机层。
在本发明具体实例之一中，直接蒸发含有胜肽的有机层直至干燥，且将剩余残余物溶解于与甲苯及有机溶剂1不同的溶剂中。然而，若含有胜肽的有机层包含超过30体积%的选自由MeTHF及THF组成的组的溶剂，则出于安全原因优选避免完全蒸发直至干燥。作为替代，可部分蒸发含有胜肽的有机层，接着添加甲苯，随后蒸发直至干燥。
由于有机层中所存在的甲苯与水形成共沸物，因此在部分蒸发过程中有效移除含有胜肽的有机层中的痕量水。
在优选具体实例之一中，在组合经部分蒸发的有机层与有机溶剂2时，较大部分胜肽沉淀。
在本发明的另一优选具体实例中，直接蒸发含有胜肽的有机层直至干燥，且将剩余残余物溶解于与甲苯及有机溶剂1不同的溶剂中。随后将所获得的溶液与有机溶剂2组合，从而发生胜肽沉淀。
在胜肽沉淀过程中所用的经部分蒸发的有机层:有机溶剂2的体积比对沉淀过程的完成程度及沉淀胜肽的性质具有极大影响。在下文中，以体积:体积比率形式提供比率。
经部分蒸发的有机层:有机溶剂2的体积比在1:20至1:1范围内优选。此体积比在1:12至1:2范围内优选。此体积比在1:6至1:3范围内尤其优选。
有机溶剂2优选选自在大气压下的沸点低于160℃的有机溶剂。胜肽在有机溶剂2中的溶解度优选低于在甲苯及/或甲苯与有机溶剂1的混合物中的溶解度。有机溶剂2优选选自由乙腈、***、二异丙醚及正庚烷组成的组，更优选选自由乙腈、***及二异丙醚组成的组，尤其优选选自由二异丙醚及正庚烷组成的组。
由于经部分蒸发的含有胜肽的有机层实质上不含极性非质子性溶剂，因此使胜肽沉淀所需的有机溶剂2的量显著低于先前技术的沉淀方法，现有技术的沉淀方法使用由胜肽偶合反应所产生的粗反应混合物。此外，与现有技术的沉淀方法相反，沉淀胜肽为无黏性固体物质。
优选在沉淀过程中，经部分蒸发的有机层中所存在的胜肽的至少80重量%以固体物质形式沉淀析出。进一步更优选经部分蒸发的有机层中所存在的胜肽的至少90重量%以固体物质形式沉淀析出。进一步更优选经部分蒸发的有机层中所存在的胜肽的至少95重量%以固体物质形式沉淀析出。尤其优选经部分蒸发的有机层中所存在的胜肽的至少98重量%以固体物质形式沉淀析出。
进行沉淀过程所处的温度（此温度在下文中称为沉淀温度）视经部分蒸发的有机层的组成、有机溶剂2的选择及胜肽的性质而定。
沉淀温度对胜肽沉淀的完全程度及沉淀胜肽的物理性质具有极大影响。优选在-10℃至60℃的沉淀温度下进行沉淀过程，其中进一步更优选-10℃至30℃的沉淀温度。然而，尤其优选沉淀温度在-10℃至0℃范围内。
由于经部分蒸发的含有胜肽的有机层实质上不含极性非质子性溶剂，因此可容易地通过过滤来分离沉淀胜肽。因此，显著缩短过滤过程所需的时间。优选通过过滤分离沉淀胜肽且在减压下干燥。
然而，也可通过离心来分离沉淀胜肽。
必要时可对过滤期间所收集的滤液再次进行部分蒸发，随后沉淀，从而可收集第二批沉淀胜肽。
在本发明的另一具体实例中，直接用可裂解胜肽的一个或若干个PG的试剂处理经部分蒸发的含有胜肽的有机层。由于经部分蒸发的含有胜肽的有机层实质上不含极性非质子性溶剂，因此用于裂解胜肽的一个或若干个PG的试剂的选择不受特别限制。举例而言，可用酸解试剂处理经部分蒸发的含有胜肽的有机层，其中未发生酸解试剂与极性非质子性溶剂的间的不需要的反应或未对裂解有抑制。如果胜肽的N末端PG为叔丁氧基羰基（Boc），则本发明的此具体实例尤其优选。
在本发明的其他具体实例中，经部分蒸发的有机层用于进行其他反应，例如二硫键形成。
在本发明的另一具体实例中，直接向由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中添加可裂解胜肽的一个或若干个PG的试剂。在目标PG的裂解完成之后，从反应混合物中萃取所产生的胜肽。若胜肽的N末端PG为芴基-9-甲氧基羰基（Fmoc），则本发明的此具体实例尤其适合。
在一个特定具体实例中，在PG裂解之后用甲苯或用甲苯与有机溶剂1的混合物萃取胜肽。此典型地为经Fmoc保护的胜肽难以保持在不含NMP或DMF的溶液中的情况。在Fmoc裂解之后，可将这些胜肽萃取于含有甲苯及视情况存在的有机溶剂1的有机层中。
在经Boc保护的胜肽的情况下，相反的是，必须在Boc裂解之前移除NMP及DMF，但这些胜肽通常在存在TFA>5体积%的情况下可溶于甲苯、乙酸乙酯或可能存在的庚烷中。
在本发明的又一具体实例中，如上文所述将含有胜肽的有机层蒸发直至干燥，将剩余残余物溶解于与甲苯及有机溶剂1不同的溶剂中，然后向其中添加可裂解胜肽的一个或若干个PG的试剂。
保护基
出于本发明的目的，将用于保护胺基酸或胜肽侧链中的官能团或用于保护胺基酸或胜肽的N末端胺基或C末端羧酸基的保护基（PG）分类为4个不同组：
1.可在碱性裂解条件下裂解的PG，在下文中称为“碱型PG”；
2.可在强酸性裂解条件下裂解而在中等酸性裂解条件下不可裂解的PG，在下文中称为“强型PG”；
3.可在中等酸性裂解条件下裂解的PG，在下文中称为“弱型PG”；
4.可在还原性裂解条件下裂解的PG，在下文中称为“还原型PG”；及
5.可在皂化裂解条件下裂解的PG，在下文中称为“皂化型PG”。
熟知用于本发明的在液相中制备胜肽的方法的PG及用于裂解PG的典型反应条件、参数及试剂在此项技术中为已知的，例如T.W.Greene,P.G.M.Wuts“Greene's Protective Groups in Organic Synthesis”John Wiley&Sons公司,2006；或P.Lloyd-Williams,F.Albericio,E.Giralt,“Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins”CRC:Boca Raton,Florida,1997。
碱性裂解条件涉及用碱性裂解溶液处理胜肽。碱性裂解溶液优选由碱性试剂及溶剂组成。用于本发明的碱性试剂优选为仲胺，碱性试剂更优选选自由二乙胺（DEA）、哌啶、4-(胺基甲基)哌啶、参(2-胺基乙基)胺（TAEA）、吗啉、二环己胺、1,3-环己烷双(甲胺)-哌嗪、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯及其混合物组成的组。本发明的在液相中制备胜肽的方法中所用的碱性试剂甚至更优选选自由DEA、TAEA及哌啶组成的组。
碱性裂解溶液也可包含优选选自由6-氯-1-羟基-苯并***、1-羟基-7-氮杂苯并***、1-羟基苯并***及2-氰基-2-羟基亚胺基乙酸乙酯及其混合物组成的组的添加剂。
碱性裂解溶液的溶剂优选与胜肽偶合反应所采用的极性非质子性溶剂相同。因此，碱性裂解溶液的溶剂优选选自由DMF、DMA及NMP组成的组。或者，通过从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法所获得的含有胜肽的有机层可如上文所述被蒸发直至干燥。可将剩余残余物溶解于选自由DMF、DMA、吡啶、NMP、乙腈或其混合物组成的组的溶剂之一中，随后用碱性裂解溶液处理。可能必需用DMF或NMP将胜肽以溶液形式保持在Fmoc裂解反应混合物中，如实施例1中所示。
在有关碱性、强酸性、中等酸性及还原性裂解条件的描述中，术语“份”及“重量%”意思是携带正被裂解的相应基团PG的胜肽的重量份数因子。举例而言，表述“使用5份碱性裂解溶液”意思是使用5g碱性裂解溶液来处理各1g携带碱型PG的胜肽。
优选使用5至20份、更优选为5至15份碱性裂解溶液。碱性试剂的量优选在1重量%至30重量%范围内，更优选为10重量%至25重量%，进一步更优选为15重量%至20重量%，其中重量%为基于碱性裂解溶液的总重量。
如本发明中所定义的强酸性裂解条件涉及用强酸性裂解溶液处理胜肽。强酸性裂解溶液包含酸解试剂。酸解试剂优选选自由以下组成的组：布氏酸，例如TFA、盐酸（HCl）、盐酸水溶液（HCl）、液体氢氟酸（HF）或三氟甲磺酸；路易斯酸（Lewis acid），例如三氟硼酸***加合物或溴化三甲基硅烷；及其混合物。
强酸性裂解溶液优选包含一或多种选自由二硫苏糖醇、乙二硫醇、二甲基硫醚、三异丙基硅烷、三乙基硅烷、1,3-二甲氧基苯、苯酚、苯甲醚、对甲酚及其混合物组成的组的清除剂。强酸性裂解溶液也可包含水、溶剂或其混合物，该溶剂在强裂解条件下稳定。
强酸性裂解溶液的溶剂优选与经部分蒸发的含有胜肽的有机层中所存在的溶剂相同。因此，强酸性裂解溶液的溶剂为甲苯或甲苯与有机溶剂1的组合。或者，可如上文所述将含有胜肽的有机层蒸发直至干燥且可将剩余残余物溶解于选自由ACN、甲苯、DCM、TFA及其混合物组成的组的溶剂之一中。因为甲苯及有机溶剂1具有足够挥发性，因此可容易地蒸发有机层。
优选使用10至30份、更优选为15至25份、进一步更优选为19至21份强酸性裂解溶液。酸解试剂的量优选在30重量%至350重量%范围内，更优选为50重量%至300重量%，进一步更优选为70重量%至250重量%，尤其为100重量%至200重量%，其中重量%为基于强酸性裂解溶液的总重量。优选使用占总量的1重量%至25重量%、更优选为5重量%至15重量%的清除剂，其中重量%为基于强酸性裂解溶液的总重量。
根据本发明的中等酸性裂解条件涉及用弱酸性裂解溶液处理胜肽。弱酸性裂解溶液包含酸解试剂。酸解试剂优选选自由以下组成的组：布氏酸，例如TFA、三氟乙醇、盐酸（HCl）、乙酸（AcOH）、其混合物及/或与水的混合物。
弱酸性裂解溶液也可包含水、溶剂或其混合物，该溶剂在弱裂解条件下稳定。弱酸性裂解溶液的溶剂优选与经部分蒸发的含有胜肽的有机层中所存在的溶剂相同。因此，弱酸性裂解溶液的溶剂为甲苯或甲苯与有机溶剂1的组合。或者，可如上文所述将含有胜肽的有机层蒸发直至干燥且可将剩余残余物溶解于选自由ACN、甲苯、DCM、TFA及其混合物组成的组的溶剂之一中。
优选使用4至20份、更优选为5至10份弱酸性裂解溶液。酸解试剂的量优选在0.01重量%至5重量%范围内，更优选为0.1重量%至5重量%，进一步更优选为0.15重量%至3重量%，其中重量%为基于弱酸性裂解溶液的总重量。
本发明具体实例之一中所用的还原性裂解条件涉及用还原性裂解混合物处理胜肽。还原性裂解混合物包含催化剂、还原剂及溶剂。
用于还原性裂解条件的催化剂选自由Pd(0)衍生物、Pd(II)衍生物及含有金属钯的催化剂组成的组，更优选选自由Pd[PPh3]4、PdCl2[PPh3]2、Pd(OAc)2及钯/碳（Pd/C）组成的组。Pd/C尤其优选。
还原剂优选选自由Bu4N+BH4 -、NH3BH3、Me2NHBH3、tBu-NH2BH3、Me3NBH3、HCOOH/DIPEA、亚磺酸（包含PhSO2H、tolSO2Na及i-BuSO2Na）及其混合物以及分子氢组成的组；还原剂更优选为tolSO2Na或分子氢。
在还原性裂解条件下所用的溶剂优选与经部分蒸发的含有胜肽的有机层中所存在的溶剂相同。因此，在还原性裂解条件下所用的溶剂优选为甲苯或甲苯与有机溶剂1的组合。或者，可如上文所述将含有胜肽的有机层蒸发直至干燥且可将剩余残余物溶解于选自由NMP、DMF、DMA、吡啶、ACN及其混合物组成的组的溶剂的一中；溶剂更优选为NMP、DMF或其混合物。胜肽优选可溶且将其溶解于还原性裂解条件下所用的溶剂中。
优选使用4至20份、更优选为5至10份还原性裂解溶液。
皂化裂解条件涉及用皂化裂解溶液处理胜肽。皂化裂解溶液优选由皂化试剂及溶剂组成。本发明所用的皂化试剂优选为碱金属及碱土金属的氢氧化物，皂化试剂更优选选自由氢氧化钠、氢氧化锂及氢氧化钾组成的组。本发明的在液相中制备胜肽的方法中所用的皂化试剂甚至更优选为氢氧化钠。
皂化裂解溶液的溶剂优选包含水与选自由THF、MeTHF、乙醇、甲醇及二恶烷组成的组的溶剂的混合物。
根据本发明，碱型PG在强酸性或中等酸性裂解条件下不可裂解。碱型PG优选在强酸性裂解条件、弱裂解条件或还原性裂解条件下不可裂解。
术语“强型PG”应理解为在中等酸性裂解条件或碱性裂解条件下不可裂解的保护基。强型PG优选在中等酸性裂解条件、碱性裂解条件或还原性裂解条件下不可裂解。强酸性PG（如Bzl）通常通过氢化来裂解。典型地通过在非常温和的条件下进行氢化来整体脱除胜肽的保护基。
弱型PG在碱性裂解条件下不可裂解，但其可在强酸性裂解条件下裂解。弱型PG优选在碱性裂解条件或还原性裂解条件下不可裂解，但其可在强酸性裂解条件下裂解。
根据本发明具体实例之一，碱型PG优选为Fmoc。强型PG优选选自由Boc、tBu、OtBu及Cbz组成的组。弱型PG优选选自由Trt及2-氯苯基二苯基甲基组成的组。还原型PG优选选自由Bzl、N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-胺基及Cbz组成的组。皂化型PG优选为OMe。
在本发明的在液相中制备胜肽的方法中，在脱除保护基的反应中移除胜肽的N末端PG，接着进行后续胜肽偶合反应。根据本发明，N末端PG优选为Fmoc及Boc。
在本发明具体实例之一中，Fmoc在LPPS中作为N末端PG高度优选，因为其可在碱性条件下容易地移除。此外，Fmoc作为胜肽N末端的PG与侧链PG兼容以表示正交***。术语“正交***”定义于G.Baranay及R.B.Merrifield(JACS,1977,99,22,第7363-7365页)中。
在本发明的又一具体实例中，Boc作为胜肽N末端PG用于在液相中制备胜肽的方法高度优选。其移除可在强酸性条件下进行。使用N末端Boc PG也与侧链PG兼容以表示正交***。
根据本发明，在最终脱除保护基的步骤中移除胜肽的C末端PG。
优选C末端PG为OtBu、Blz、OMe、NH2以及2-氯苯基-二苯基甲酯或N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-酰胺。
在本发明具体实例之一中，Bzl作为C末端PG用于在液相中制备胜肽的方法高度优选，因为其可在上述还原性裂解条件下容易地移除。此外，C末端Bzl PG与侧链PG兼容以表示正交***。
在本发明的另一具体实例中，OtBu作为C末端PG用于在液相中制备胜肽的方法。其移除可在如上文所述的强酸性裂解条件下进行。使用C末端OtBuPG也与侧链PG兼容以表示正交***。
在本发明的另一具体实例中，OMe作为C末端PG用于在液相中制备胜肽的方法。OMe可通过皂化容易地裂解且若胜肽的N末端PG为Boc，则尤其适用。
在本发明的又一具体实例中，可另外通过对胜肽C末端使用疏水性PG来增加胜肽在有机层中的溶解度。为此目的，胜肽的C末端羧酸基可用弱型PG加以保护，该等弱型PG可在中等酸性条件下裂解，例如2-氯苯基二苯基甲酯或N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-酰胺。这些PG尤其适用于合成胜肽片段，而胜肽片段又可用于汇集型胜肽合成。这些C末端羧酸保护基具有另一重要优势：其在中等酸性条件下裂解，从而允许液相合成受保护的胜肽，作为SPPS的一项替代方案，该等受保护的胜肽可用作汇集型合成策略中的胜肽片段。实际上，2-氯苯基二苯基甲酯及N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-酰胺的化学功能为用作SPPS树脂上的连接符以用于合成受保护的胜肽片段。
根据本发明，需要用适合PG保护通过在液相中制备胜肽的方法所获得的胜肽的胺基酸侧链的羟基-、胺基-、硫基-及羧酸基，以便避免不需要的副反应。此外，使用侧链PG一般可改良胜肽在极性非质子性溶剂中以及在甲苯中或/及在甲苯与有机溶剂1的组合中的溶解度。
一般而言，以一定方式选择侧链PG，从而其在于液相中制备胜肽的方法中的脱除N末端胺基保护基的期间不会被移除。因此，N末端胺基或C末端羧酸基的PG及任何侧链PG典型地不同，其优选表示正交***。
根据本发明，优选侧链基团为tBu、Trt、Boc、OtBu及Cbz。
一旦通过在液相中制备胜肽的方法所获得的胜肽的胺基酸序列与目标胜肽的胺基酸序列一致后，优选移除N末端PG、C末端PG及任何侧链PG以便获得不受保护的目标胜肽。此步骤称为整体脱除保护基。在液相中制备胜肽的方法中所用的PG优选经选择以允许在如上文所定义的中等酸性、强酸性或还原性裂解条件下进行整体脱除保护基，此视PG的本质而定。
典型地保留任何侧链PG，直至LPPS结束。整体脱除保护基可在适用于已使用的各种侧链PG的条件下进行。在选择不同类型的侧链PG的情况下，其可相继裂解；例如此为合成分枝胜肽时的情况。宜用使侧链PG可同时裂解且更宜伴随由LPPS制备的胜肽的N末端PG或C末端PG的方式选择侧链PG。
在本发明具体实例之一中，可直接移除经部分蒸发的有机层中的胜肽的N末端PG。因此，在此情况下，不需要使用有机溶剂2来使胜肽沉淀，且可在不分离中间物胜肽的情况下进行本发明的LPPS，例如呈连续LPPS形式。
视胜肽N末端PG的本质而定，可针对此步骤选择适当裂解条件。
若胜肽的N末端PG为如上文所定义的强型PG或弱型PG，则优选用TFA或HCl处理含有胜肽的有机层。由于含有胜肽的有机层实质上不含极性非质子性溶剂，因此移除胜肽的N末端PG不因TFA或HCl与极性非质子性溶剂之间不合需要的反应而受抑制。在本发明具体实例之一中，胜肽的N末端PG为Boc基团。
若胜肽的N末端PG为如上文所定义的碱型PG，则胜肽可使用有机碱来脱除保护基，如先前技术中所知。为此目的，优选直接用选自由DEA、TAEA及哌啶组成的组的碱性试剂处理由胜肽偶合反应所产生的反应混合物，且从此反应混合物中萃取具有不受保护的N末端的胜肽。或者，用碱性试剂处理含有胜肽的有机层。或者，可如上文所述将含有胜肽的有机层蒸发直至干燥且可将剩余残余物溶解于选自由DMF、DMA、吡啶、NMP或其混合物组成的组的溶剂之一中，随后用碱性试剂处理。
在本发明优选具体实例之一中，胜肽的N末端PG为芴基-9-甲氧基羰基（Fmoc）。胜肽的Fmoc基团裂解伴随二苯富烯形成。若使用DEA或哌啶作为碱性试剂且碱性裂解溶液的溶剂为乙腈，则随后用烃（例如正庚烷）洗涤含有具有不受保护的N末端的胜肽的所得溶液，以便实质上移除二苯富烯。若使用TAEA作为裂解Fmoc基团的碱性试剂，则随后对所得溶液进行本发明的萃取方法。因此，含有具有不受保护的N末端的胜肽的溶液在进行后续胜肽偶合反应之前实质上不含二苯富烯。
在使胜肽N末端PG裂解之后，可将含有具有不受保护的N末端的胜肽的溶液至少部分蒸发且用于后续胜肽偶合反应，或者用于整体脱除保护基的步骤。
因此，本发明提供连续LPPS方法，该方法与常用SPPS方法相比具有许多优势。
在本发明的连续LPPS的情况下，在胜肽偶合反应及脱除保护基的反应期间反应混合物中所存在的试剂浓度高于SPPS的情况。因此，相应反应时间较短，且可使用具有较小容量的分批反应器来合成指定量的目标胜肽。通过本发明的连续LPPS来合成胜肽所需的总时间与使用SPPS进行其合成时所需的总时间几乎相同。因此，使用本发明的连续LPPS可降低操作成本。
与SPPS中的相应胜肽偶合反应（1.5当量或1.5当量以上）相比，本发明LPPS中的胜肽偶合反应需要较低过量的胺基酸或具有不受保护的C末端羧酸基的胜肽（1.1当量至1.2当量）。此外，SPPS另外需要大量溶剂用于在各胜肽偶合步骤之后冲洗树脂。因此，在SPPS情况下所需的溶剂量显著高于本发明连续LPPS的情况。因此，与使用SPPS相比，使用本发明的连续LPPS可显著降低材料成本。
除此以外，已知按比例扩大本发明的连续LPPS方法的规模与按比例扩大相应SPPS方法的规模相比更容易，且通过本发明的连续LPPS制备的目标胜肽与由SPPS制备的相应胜肽相比具有更高纯度。
总之，本发明的连续LPPS与现有技术中已知的其他胜肽合成方法相比提供许多优势，且尤其适用于按工业规模制备胜肽。
附图说明
图1说明残余DMF对胜肽Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl的Boc保护基的移除速率的影响。
图2展示不存在DMF时所沉淀的胜肽Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)的影像。
具体实施方式
实施例
以下非限制性实施例将详细说明本发明的代表性具体实例。
若未另外规定，则所有实验均在20±3℃的室温及1013±50kPa的大气压力下进行。
方法描述
A）HPLC分析
利用UV光电二极管数组检测器来进行HPLC方法A中的检测。
步骤1样品制备：
移动相A：0.1体积% TFA/水
移动相B：0.085体积% TFA/ACN
步骤2层析条件：
方法MIH-009-2TG11
管柱：        Purospher Star RP18 55×4 mm
炉温：        40℃
流速：        2.0mL/min
检测器波长：  215nm
梯度运作时间：    15min
梯度组成：2%至78%B，5min；78%至98%B，10min
步骤3层析图分析：
通过测量所有层析峰的面积来确定所分离产物的组成。预期产物的所测定纯度对应于相应产物峰的面积%。
1.装置及设备
气相层析仪：装备火焰电离检测器及从动注射器***且与数据采集软件耦合的GC
分析型GC管柱：熔融二氧化硅管柱，长度50m；0.53mm内径；固定相：CP SIL8CB DF=5.0μm
试剂：               甲醇（分析级）
2.样品制备
测试溶液及参考溶液
在10mL容量瓶中，精确添加400μL样品且用甲醇补足体积。
3.层析条件
载气：                氦气30kPa
炉温：      35℃，14分钟，5℃/min，55℃，3分钟，5℃/min，110℃，5分钟，10℃/min，225℃，5分钟
注射器温度：    225℃
检测器温度：    260℃
注射体积：      1μL
注射模式：      分流
分流流速：      85mL/min
比率：          24
过滤性测量
将含有沉淀胜肽的混合物转移至装备20μm孔径过滤器的2.7cm直径过滤管柱中。在20℃下在50毫巴的压力下进行过滤。测量流速及滤饼高度且如下计算过滤性系数K：
K=母液体积（mL）×滤饼高度（cm）/过滤器表面（cm2）/压力（巴）/过滤时间（min）。
实施例1萃取***MeTHF/THF/NaCl溶液、EtOAc/THF/NaCl溶液及甲苯/THF/NaCl溶液中的NMP
将溶剂组合甲苯/THF（根据本发明）的萃取性质与组合MeTHF/THF及EtOAc/THF（比较）的萃取性质相比较。用含有150g/L NaCl的水溶液进行实验。本实施例的***中不存在胜肽。
体积比如下：
NMP:EtOAc:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
NMP:MeTHF:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
NMP:甲苯:THF:NaCl溶液=1:3:3:3
通过GC测定水层中的NMP分数。实验结果汇总于以下表1中。
溶剂组合 水层中的NMP分数
EtOAc/THF 0.857
MeTHF/THF 0.881
甲苯/THF 0.911
表1.萃取两相***NMP/溶剂1/溶剂2/NaCl溶液（150g/L NaCl）中的NMP。
如从以上表1中可注意到，与使用EtOAc/THF及MeTHF/THF进行萃取相比，用组合甲苯/THF萃取使得水层中的NMP分数更高。因此，与用MeTHF/THF或EtOAc/THF萃取之后相比，用甲苯/THF萃取之后，有机层中的NMP含量较低。
实施例2合成H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
实施例2.1Boc-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl的LPPS
在20℃下将Boc-Tyr(Bzl)-OH（4.7g，12.7mmol）及H-Leu-OBzl·Tos（5.0g，12.7mmol）溶解于DMF（25mL）中。将反应混合物冷却至-8℃，接着添加HOBt·H2O（2.0g，13.1mmol，1.0当量）及EDC·HCl（2.8g，14.6mmol）。将反应温度保持在-5℃至-10℃范围内直至反应完成，如通过HPLC所测定。通过以下方法监测反应进展：根据上述方法MIH-009-2TG11对在乙酸:水（9:1）中稀释50倍的5μL反应混合物样品进行分析。
实施例2.2Boc裂解：H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
向根据实施例2.1制备的混合物中添加甲苯（90mL）且用以下各物相继萃取反应混合物：
1）含有20g/L NaCl的水溶液（90mL）
2）含有150g/L NaCl及50g/L NaHCO3的水溶液（90mL）
3）含有20g/L NaCl及50g/L NaHCO3的水溶液（90mL）
4）含有20g/L NaCl及50g/L NaHCO3的水溶液（90mL）
5）含有150g/L NaCl的水溶液（90mL）。
接着在减压下在35℃下浓缩所合并的有机层，以便将所合并的有机层的体积减至20mL。
通过在15℃下添加苯酚（0.25g，2.6mmol）及TFA（20mL）来移除Boc保护基。在反应完成（如通过HPLC所测定）之后，在减压下在35℃下蒸发反应混合物。通过与甲苯（3×25mL）一起共同蒸发来移除残余TFA。通过以下方法监测反应进展：将5μL反应混合物样品在甲醇中稀释30倍且根据上述方法MIH-009-2TG11进行分析。
实施例3（比较）残余DMF对移除Boc保护基的影响。H-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
将Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-OH（3.5g）、H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl（5.0g）及HOBt（0.88g）溶解于DMF（20mL）中。在-6℃至0℃下在搅拌下用EDC·HCl（1.2g）及TEA（1.5mL）进行偶合反应隔夜。通过HPLC（方法MIH-009-2TG11）验证反应完成。
过滤反应混合物以移除不溶性盐。将1mL反应混合物样品与以下表2中所示的有机溶剂混合，接着用3mL NaCl（15%w/v）及Na2CO3（2.5%w/v）的水溶液萃取。通过GC测定有机层中的DMF含量。
Figure GDA0000462857840000301
表2.萃取Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl
用EtOAc萃取（测试2）使得有机层中的DMF含量与用DCM萃取（测试1）相比较低。
进一步处理测试1及测试2的所获得产物。分离有机层，且通过与甲苯一起共同蒸发三次（浴液温度=40℃，压力=50毫巴）来交换溶剂。完全蒸发挥发性溶剂之后，向蒸发残余物中添加甲苯（4mL）及苯酚（0.05g）。在0℃下，通过添加3.5mL TFA来进行Boc裂解。通过HPLC（方法MIH-009-2TG11）监测反应。
所获得的结果汇总于表3中且图解呈现于图1中。
Figure GDA0000462857840000302
表3.脱除Boc-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl的保护基
结果
这些物质中的痕量DMF显著抑制Boc保护基的移除。因此，与在通过用EtOAc萃取所获得的物质的情况下相比，通过用DCM萃取所获得的物质的Boc裂解显著较慢。
本发明的萃取方法允许有效分离极性非质子性溶剂（例如DMF）与所分离胜肽。因此，预期通过本发明的萃取方法分离的胜肽物质的酸解裂解可顺利进行。
实施例4（比较）使Boc-Ser(OBzl)-OH与H-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)偶合
在20℃下将Boc-Ser(OBzl)-OH（1.62g，5.5mmol）溶解于DMF（25mL）中，且添加至粗制H-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr-Leu(OBzl)中。向其中添加HOBt·H2O（0.89g，5.8mmol）及EDC·HCl（1.2g，6.3mmol），且将反应混合物冷却至5℃。将反应混合物保持在此温度下直至通过HPLC证实完全转化。通过以下方法监测反应进展：将5μL反应混合物样品在乙酸:水（9:1）中稀释50倍且根据上述方法MIH-009-2TG11进行分析。
a）用MeTHF萃取及在DIPE中沉淀
将含有5g Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)的25mL反应混合物与MeTHF（75mL）及含有100g/L NaCl的水溶液（75mL）组合。在充分混合且进行相分离（约4分钟）之后，移除下层水层。用含有100g/L NaCl的水溶液（3×75mL）将上层有机层再萃取三次。最后分离有机层且在30℃、60毫巴下部分蒸发至残余体积为10mL。在0℃下，在搅拌下将经部分蒸发的有机层逐滴添加至DIPE（250mL）中，其中发生胜肽沉淀。将所得混合物转移至装备20μm孔径过滤器的2.7cm直径过滤管柱中。在50毫巴的压力下进行过滤。在3分钟45秒内过滤全部的沉淀母液（260mL）。过滤后的滤饼高度为3.5cm，得到过滤性系数K=848。收集固体且在减压下干燥。分离呈固体物质形式的4.5g胜肽。
分离的胜肽的影像如图2中所示（40倍放大）。
通过HPLC分析由萃取过程产生的水层及沉淀母液。其中所检测的胜肽量低于由实施例4产生的25mL反应混合物中所存在的胜肽总量的0.5重量%。
b）比较实施例：向沉淀母液中添加DMF的影响
如以上a）所述进行萃取及沉淀程序，但在进行胜肽过滤之前向沉淀混合物中添加DMF（2.5mL）。固体沉淀物立即变成不可过滤的胶状固体。
c）比较实施例：在DIPE中直接沉淀
在0℃下，在搅拌下将实施例4中所获得的含有5g Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)的25mL反应混合物逐滴添加至DIPE（250mL）中以进行沉淀。胜肽以黏稠胶状固体形式沉淀。倾析之后，将清液抽出且用第二批DIPE（250mL）替代。将所得混合物搅拌1小时以便将黏稠胶状固体解聚集。倾析之后，再次用第三批DIPE（250mL）替代清液。将混合物再搅拌1小时且最后将其转移至过滤管柱中。然而，大部分固体仍呈黏稠胶状固体形式黏着于沉淀容器上且因此无法转移。在2分钟30秒内过滤母液，产生1.75cm高的滤饼。此获得过滤系数K=636。在减压下干燥所收集的固体。
分离2.45g胜肽。
d）比较实施例：在水中直接沉淀。
在0℃下，在搅拌下将由实施例4产生且含有5g Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)的25mL反应混合物逐滴添加至水（250mL）中以进行沉淀。此产生极薄沉淀物，随后将其转移至过滤管柱中。过滤速率极低（<3mL/h），大量沉淀物在过滤初期通过过滤器且在约65分钟之后，过滤器明显堵塞。此外，未明显倾析沉淀物。因此，不能收集所获得的沉淀物。
结果
胜肽Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)在DMF存在下沉淀（实施例b）至实施例d））产生难以处理的胶状固体。在实施例a）中，在已通过萃取实质上移除痕量DMF之后，进行胜肽Boc-Ser(Bzl)-Phe-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu(OBzl)的沉淀。所得产物可以良好产率分离且容易过滤。
本发明的萃取方法允许有效分离极性非质子性溶剂（例如DMF）与胜肽。因此，可排除在胜肽沉淀方法中极性非质子性溶剂的不合需要的干扰。
Figure IDA0000462927210000011
Figure IDA0000462927210000021

Claims (16)

1.一种从由胜肽偶合反应所产生的反应混合物中萃取胜肽的方法，所述反应混合物含有所述胜肽及选自由N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组的极性非质子性溶剂，其中所述方法包含步骤a）及步骤b）：
步骤a）包含向所述反应混合物中添加组分a1）及组分a2），其中：
组分a1）为甲苯；
组分a2）为水；
从而获得具有有机层及水层的两相***；
步骤b）包含分离含有所述胜肽的所述有机层与所述水层，
其中：
步骤a）中所获得的所述两相***的特征在于以下体积比：
极性非质子性溶剂:甲苯=1:20至1:2；及
极性非质子性溶剂:水=1:20至1:2。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a）中，向所述反应混合物中添加另一组分a3），
组分a3）为有机溶剂1，所述有机溶剂1选自由正庚烷、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙腈及四氢呋喃组成的组；
从而获得具有有机层及水层的两相***；
其中
步骤a）中所获得的所述两相***的特征在于以下体积比：
极性非质子性溶剂:甲苯=1:20至1:2；
极性非质子性溶剂:有机溶剂1=1:5至30:1；及
极性非质子性溶剂:水=1:20至1:2。
3.如权利要求2所述的方法，其中步骤a）中所获得的所述两相***的特征在于以下体积比：
极性非质子性溶剂:甲苯=1:6至1:3；
极性非质子性溶剂:有机溶剂1=1:1至4:1；及
极性非质子性溶剂:水=1:5至1:3。
4.如权利要求1至3中一项或多项所述的方法，其中所述极性非质子性溶剂选自由N,N-二甲基甲酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组。
5.如权利要求2至4中一项或多项所述的方法，其中所述有机溶剂1选自由乙腈及四氢呋喃组成的组。
6.如权利要求1至5中一项或多项所述的方法，其中所述组分a2）含有至少一种选自由氯化钠、硫酸氢钠、硫酸氢钾、碳酸氢钠及磷酸氢钠组成的组的无机盐。
7.如权利要求1至6中一项或多项所述的方法，其中所述组分a2）的pH值在5至8范围内。
8.如权利要求1至7中一项或多项所述的方法，其中在步骤b）之前对步骤a）中所获得的所述两相***进行过滤。
9.如权利要求1至8中一项或多项所述的方法，其中在20℃至30℃的温度下进行步骤a）及步骤b）。
10.一种在液相中制备胜肽的方法，所述方法包含步骤aa）、步骤bb）及步骤cc）：
在步骤aa）中，在选自由N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺及N-甲基-2-吡咯啶酮组成的组的极性非质子性溶剂中且在存在偶合试剂的情况下进行胜肽偶合反应；
在步骤bb）中，根据权利要求1至10中一项或多项所述的方法萃取所产生的胜肽；及
在步骤cc）中，将步骤bb）中所获得的有机层的至少一部分蒸发。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述偶合试剂选自由O-1H-苯并***的脲盐、鏻盐及碳二亚胺偶合试剂组成的组。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中叔碱选自由N,N-二异丙基乙胺、三乙胺及N-甲基吗啉组成的组，且所述叔碱存在于步骤aa）的所述胜肽偶合反应中。
13.如权利要求10至12中一项或多项所述的方法，其另外包含进一步的步骤dd）、步骤ee）及步骤ff），其中
在步骤dd）中，将步骤cc）中所获得的所述有机层与选自由乙腈、***、二异丙醚及正庚烷组成的组的有机溶剂2组合；
在步骤ee）中，使至少很大一部分的所述胜肽沉淀；及
在步骤ff）中，通过过滤分离所述沉淀的胜肽。
14.如权利要求10至12中一项或多项所述的方法，其中在所述胜肽的N末端保护基为叔丁氧基羰基保护基的情况下，用三氟乙酸处理步骤cc）中所获得的所述有机层，所述叔丁氧基羰基保护基为通过所述三氟乙酸处理来移除。
15.如权利要求10至12中一项或多项所述的方法，其中在所述胜肽的N末端保护基为芴基-9-甲氧基羰基保护基的情况下，用哌啶处理由所述胜肽偶合反应产生且在步骤aa）中获得的所述反应混合物，所述芴基-9-甲氧基羰基保护基为通过所述哌啶处理来移除。
16.如权利要求10至15中一项或多项所述的方法，其中所述胜肽的C末端羧酸基经保护而呈2-氯苯基二苯基甲酯或N-甲基-9H-二苯并哌喃-9-酰胺形式。
CN201280029518.7A 2011-06-16 2012-06-14 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用 Pending CN103703017A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161497642P 2011-06-16 2011-06-16
US61/497,642 2011-06-16
EP11170094 2011-06-16
EP11170094.4 2011-06-16
US201161498100P 2011-06-17 2011-06-17
US61/498,100 2011-06-17
PCT/EP2012/061266 WO2012171987A1 (en) 2011-06-16 2012-06-14 A process for extraction of peptides and its application in liquid phase peptide synthesis

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103703017A true CN103703017A (zh) 2014-04-02

Family

ID=47356558

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280029518.7A Pending CN103703017A (zh) 2011-06-16 2012-06-14 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用
CN201280029575.5A Pending CN103764666A (zh) 2011-06-16 2012-06-14 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用
CN201280029684.7A Pending CN103717610A (zh) 2011-06-16 2012-06-14 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280029575.5A Pending CN103764666A (zh) 2011-06-16 2012-06-14 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用
CN201280029684.7A Pending CN103717610A (zh) 2011-06-16 2012-06-14 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用

Country Status (6)

Country Link
US (3) US20140128572A1 (zh)
EP (3) EP2721050A1 (zh)
JP (3) JP2014519520A (zh)
CN (3) CN103703017A (zh)
IL (3) IL229360A0 (zh)
WO (3) WO2012171984A1 (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102479601B1 (ko) 2015-12-21 2022-12-22 텍사스 테크 유니버시티 시스템 용액상 gap 펩타이드 합성을 위한 시스템 및 방법
EP3433267B1 (en) 2016-03-23 2022-08-24 Bachem Holding AG Method for preparing glucagon-like peptides
KR102610527B1 (ko) * 2017-06-09 2023-12-05 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 N-치환 아미노산을 포함하는 펩타이드의 합성 방법
US12024537B2 (en) 2018-05-31 2024-07-02 Sederma Compositions and methods for chemical synthesis
WO2019231760A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 Gap Peptides Llc Method for solution-phase peptide synthesis and protecting strategies therefore
CN113056475A (zh) 2018-11-30 2021-06-29 中外制药株式会社 用于肽化合物或酰胺化合物的脱保护方法和在固相反应中的树脂脱除方法以及用于生产肽化合物的方法
FR3090008B1 (fr) * 2018-12-17 2023-03-31 Pennakem Europa Procédé de production d'une huile brute riche en polyphénol par extraction solide/liquide
BR112021011290A2 (pt) 2018-12-18 2021-11-03 Novartis Ag Formulação de solução de proteína contendo alta concentração de um anticorpo anti-vegf
EP3914605B1 (en) 2019-01-24 2022-12-07 DSM IP Assets B.V. Peptide precipitation method
US11827660B2 (en) 2019-02-01 2023-11-28 Sederma Synthesis strategy for gap protecting group
JPWO2022145444A1 (zh) * 2020-12-28 2022-07-07
AR125800A1 (es) * 2021-05-07 2023-08-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Métodos para producir compuestos cíclicos que comprendan residuos de aminoácidos sustituidos con n
CA3210222A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-16 Cem Corporation Solid phase peptide synthesis processes

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869454A (en) * 1992-10-16 1999-02-09 Corvas International, Inc. Arginine keto-amide enzyme inhibitors
US20050165215A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-28 Bigelow Roger D. Peptide synthesis and deprotection using a cosolvent
WO2005081711A2 (en) * 2003-11-06 2005-09-09 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD290658A5 (de) 1989-07-07 1991-06-06 ��������@�K@�����������������@���@���k�� Mittel und verfahren zur schnellen peptidkupplung
SE9103612D0 (sv) * 1991-12-04 1991-12-04 Astra Ab New peptide derivatives
WO1994007910A1 (en) 1992-09-28 1994-04-14 Research Corporation Technologies, Inc. New reagents for peptide couplings
US6893868B2 (en) * 1997-02-20 2005-05-17 Onco Immunin, Inc. Homo-doubly labeled compositions for the detection of enzyme activity in biological samples
UA53716C2 (uk) * 1997-06-25 2003-02-17 Пфайзер Продактс Інк. Тартратна сіль заміщеного дипептиду, спосіб її одержання, проміжні сполуки та спосіб їх одержання, фармацевтична композиція (варіанти), спосіб підвищення рівнів ендогенного гормону росту та спосіб лікування або профілактики захворювань (варіанти)
US7473778B2 (en) * 2005-12-24 2009-01-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh 3-(4-piperidinyl)-2,3,4,5-tetrahydro-1,3-benzodiazepin-2(1H)-one
EP2181983A4 (en) 2007-07-25 2013-01-02 Ajinomoto Kk METHOD FOR THE SELECTIVE REMOVAL OF A DIBENZOFULVENE DERIVATIVE
EP2062909A1 (en) * 2007-11-21 2009-05-27 SOLVAY (Société Anonyme) Peptide production and purification process
WO2012036962A2 (en) * 2010-09-13 2012-03-22 Amylin Pharmaceuticals, Inc. C-terminal amidation of polypeptides
US9496454B2 (en) * 2011-03-22 2016-11-15 Micron Technology, Inc. Solid state optoelectronic device with plated support substrate
US20130074916A1 (en) * 2011-03-24 2013-03-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for the production of a mwt silicon solar cell
NL2008329A (en) * 2011-03-29 2012-10-02 Asml Netherlands Bv Lithographic apparatus, method for measuring radiation beam spot position, device manufacturing method, and radiation detector system for a lithographic apparatus.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869454A (en) * 1992-10-16 1999-02-09 Corvas International, Inc. Arginine keto-amide enzyme inhibitors
WO2005081711A2 (en) * 2003-11-06 2005-09-09 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
US20050165215A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-28 Bigelow Roger D. Peptide synthesis and deprotection using a cosolvent

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARPINO L.A.,ET AL.: "Rapid, Continuous Solution-Phase Peptide Synthesis Application to Peptides of Pharmaceutical Interest", 《ORGANIC PROCESS RESEARCH & DEVELOPMENTG》 *
CARPINO L.A.,ET AL.: "Rapid, Continuous Solution-Phase Peptide Synthesis Application to Peptides of Pharmaceutical Interest", 《ORGANIC PROCESS RESEARCH & DEVELOPMENTG》, vol. 7, no. 1, 1 January 2003 (2003-01-01), pages 28 - 37, XP055008431, DOI: doi:10.1021/op0202179 *
JW VAN NISPEN: "Synthesis and analysis of (poly)peptides", 《PURE &APPI. CHEM.》 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012171984A1 (en) 2012-12-20
US20140213814A1 (en) 2014-07-31
IL229359A0 (en) 2014-01-30
EP2721049A1 (en) 2014-04-23
EP2721048A1 (en) 2014-04-23
CN103764666A (zh) 2014-04-30
IL229360A0 (en) 2014-01-30
US20140213759A1 (en) 2014-07-31
JP2014517023A (ja) 2014-07-17
IL229358A0 (en) 2014-01-30
WO2012171982A1 (en) 2012-12-20
JP2014517022A (ja) 2014-07-17
CN103717610A (zh) 2014-04-09
US20140128572A1 (en) 2014-05-08
EP2721050A1 (en) 2014-04-23
JP2014519520A (ja) 2014-08-14
WO2012171987A1 (en) 2012-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103703017A (zh) 萃取胜肽的方法及其在液相胜肽合成的应用
US8828938B2 (en) Method for the manufacture of degarelix
WO1998011125A1 (en) Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
CN102241739A (zh) 肽的生产和纯化方法
WO2011066386A1 (en) Process for production of degarelix
CN101357936B (zh) 固相多肽合成曲普瑞林的制备方法
AU2009335350A1 (en) Process for the production of bivalirudin
CN101835794A (zh) 使用固相和溶液相组合技术的促胰岛素肽合成法
CN104072585A (zh) 一种合成艾替班特的方法
US9150615B2 (en) Process for the preparation of leuprolide and its pharmaceutically acceptable salts
Lobo‐Ruiz et al. General Fmoc‐Based Solid‐Phase Synthesis of Complex Depsipeptides Circumventing Problematic Fmoc Removal
Johnson et al. Synthesis of oligophosphopeptides and related ATP. gamma.-peptide esters as probes for cAMP-dependent protein kinase
KISO et al. Efficient solid phase peptide synthesis on a phenacyl-resin by a methanesulfonic acid α-amino deprotecting procedure
CN107778355A (zh) 一种合成西曲瑞克的方法
Maruyama et al. A rapid and facile method for the preparation of peptide disulfides
CN110386964A (zh) 一种亮丙瑞林的固液合成方法
CN114945580B (zh) 用于合成南吉博肽的方法
TW201307379A (zh) 萃取胜肽之方法及其於液相胜肽合成之應用
CN109575117B (zh) [Pyr1]-apelin-13的制备方法
US20220064212A1 (en) Hplc free purification of peptides by the use of new capping and capture reagents
CA3238634A1 (en) Synthetic process for production of modified gcc receptor agonists
Botti et al. The Use of Crown Ethers in Peptide Chemistry–V. Solid‐phase Synthesis of Peptides by the Fragment Condensation Approach using Crown Ethers as Non‐covalent Protecting Groups
木曽良明 et al. Efficient solid phase peptide synthesis on a phenacyl-resin by a methanesulfonic acid. ALPHA.-amino deprotecting procedure.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1190728

Country of ref document: HK

C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140402

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1190728

Country of ref document: HK