CN103695394B - 一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用 - Google Patents

一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其应用，成熟甘露聚糖酶氨基酸序列中的第85位氨基酸亮氨酸（L）改为天冬氨酸（D），第103位氨基酸天冬酰胺（N）改为天冬氨酸（D）。改造后的甘露聚糖酶最适pH值6.0，与原始甘露聚糖酶（最适pH值7.0）相比有了较大改善，且耐酸性进一步提高，在pH4.0-7.0之间均可保持最大酶活力的80%以上，在pH3.0情况下也可保持40%的最大酶活力。本发明研究了改造后甘露聚糖酶的酶学性质，为酶的应用提供了较好的实验数据。

Description

一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用。
背景技术
β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶，来源比较广泛，绝大部分发现于微生物和一些植物的种子和果实等储藏器官中，甚至在某些低等动物体内也有存在。甘露聚糖酶因来源不同而性质有很大差异。一般来说，细菌中β-甘露聚糖酶的分子量多在35kD～55kD之间，最适pH值为弱酸性或中性，其中一些嗜碱性芽孢杆菌的最适pH值可达到9.0～10.0。而真菌来源的β-甘露聚糖酶分子量约为45kD～55kD，最适pH值为4.5～5.5。相对于细菌，真菌来源甘露聚糖酶的pH稳定性，最适pH值都偏低，耐热性也比细菌差。植物细胞产生的甘露聚糖酶分子量大约为35kD～45kD，最适反应pH为4.5～5.5，最适反应温度和耐热性比细菌和真菌都低。
到目前为止，已经发现近千种β-甘露聚糖酶，不同特色的甘露聚糖酶应用在饲料、食品、制浆及石油天然气行业中，其中在饲料行业中应用最为广泛。豆粕，棉粕，菜粕是最常用的植物蛋白原料，但是单胃家禽（包括猪和鸡）对豆粕的能量利用率仅有50-60％。这是因为豆粕中含有22.7％左右的半纤维素。而这些非淀粉多糖是不能被单胃动物消化。β-甘露聚糖在豆粕中的含量比其它的常用饲料都高，作为一种抗营养因子β-甘露聚糖在动物的消化道内形成凝胶状，使消化道内容物具有较强的黏性，从而影响动物的营养吸收。甘露聚糖酶的添加主要作用是降低食糜粘度，提高动物对饲料的利用率等。由于单胃家禽等消化***对酶的一些性质如pH值有着特殊的要求，为了使甘露聚糖酶酶更好的在饲料中发挥作用，通常会选用最适作用pH与消化***的pH相接近的甘露聚糖酶，近些年，随着分子生物学和基因工程的发展，可以人为对甘露聚糖酶进行合理改造，使其更适合于饲料工业。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过定点突变得到的优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用，突变后的甘露聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，本发明通过定点突变甘露聚糖酶氨基酸序列来提高其耐酸性，本发明的另一目的是提供编码上述突变的耐酸性甘露聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供了包含上述突变得到耐酸性甘露聚糖酶基因MAN26gy的重组载体，优选为pET-30a-MAN26gy。将突变得到的耐酸性甘露聚糖酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的甘露聚糖酶基因***到质粒pET-30a上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET-30a-MAN26gy。
所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的制备方法，它包括以下步骤：
1)用含有甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因man26gy的的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN26gy。
本发明还提供了所述的耐高温甘露聚糖酶MAN26gy在制备饲料添加剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，通过定点突变提供一种具有较好耐酸性、适合于在饲料工业中应用的甘露聚糖酶。由于动物消化***对酶的一些性质如pH值有着特殊的要求，为了使本发明的甘露聚糖酶酶更适合于饲料工业，本发明通过定点突变枯草芽孢杆菌GH26β-甘露聚糖酶氨基酸序列，对该甘露聚糖酶耐酸性进行改造。
本发明模拟GH26β-甘露聚糖酶的蛋白空间结构，并进行多序列比对分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，具体的为将第85位的亮氨酸和103位天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将突变后的甘露聚糖酶基因连接至表达载体pET-30a，将连接后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了一株重组菌株pET-30a-MAN26gy/E.coliBL21(DE3)。得到的突变后的甘露聚糖酶MAN26gy具有以下性质：改造后的甘露聚糖酶最适pH值6.0，与原始甘露聚糖酶（最适pH值7.0）相比有了较大改善，且耐酸性进一步提高，在pH4.0-7.0之间均可保持最大酶活力的80%以上，在pH3.0情况下也可保持40%的最大酶活力。本发明研究了改造后甘露聚糖酶的酶学性质，为酶的应用提供了较好的实验数据。
结合阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的蛋白结构。
图2表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的蛋白电泳图谱。
图3表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的最适pH。
图4表明本发明原始甘露聚糖酶的最适pH。
图5表明本发明突变后重组甘露聚糖酶的pH稳定性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1
一、GH26β-甘露聚糖酶基因的定点突变
本发明所述甘露聚糖酶MAN26gy来源于枯草芽孢杆菌（来源于市售的枯草芽孢杆菌均可，如购于农业微生物菌种保藏中心，其编号为ACCC01779），甘露聚糖酶MAN26gy的氨基酸序列如下述SEQ ID No:1：
LFKKHTISLLILFLLASAVLAKPIEAHTVSPVNPNAQQTTKAVMNWLAHLPNRTENRVLSGAFGGYSHDTFSMAEADRIRSATGLSPAIYGCDYARGWLETANIEDSIDVSCNGDLISYWKNGGIPQISLHLANPAFQSGHFKTPITNDQYKKILDSSTAEGKRLNAMLSKIADGLQELENQGVPVLFRPLHEMNGEWFWWGLTSYNQKDNERISLYKQLYKKIYHYMTDTRGLDHLIWVYSPDANRDFKTDFYPGASYVLTALNKPFAFTEVGPQTANGSFDYSLFINAIKQKYPKTIYFLAWNDEWSPAVNKGASALYHDSWTLNKGEIWNGDSLTPIVE。
编码上述来源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因man26gy，其基因组序列如下述SEQ ID No:2：
Ttgtttaagaaacatacgatctctttgctcattttatttttacttgcgtctgctgttttagcaaaaccaattgaagcgcatactgtgtcgcctgtgaatcctaatgcacagcagacaacaaaagcagtgatgaactggcttgcgcacctgccgaaccgaacggaaaacagagtcctttccggagcgttcggaggttacagtcatgacacattttctatggctgaggctgatagaatccgaagcgccaccgggctatcgcctgctatttatggctgcgattatgccagaggatggcttgaaacagcaaatattgaagattcaatagatgtaagctgcaacggtgatttaatttcgtattggaaaaatggcggaattccgcaaatcagtttgcacctggcgaaccctgcttttcagtcagggcattttaaaacaccgattacaaacgatcagtataaaaaaatactagattcttcaacagcagaaggaaagcggctaaatgccatgctcagcaaaattgctgacggacttcaagagctggagaaccaaggtgtgcctgttctgttcaggccactgcatgaaatgaacggcgaatggttttggtggggacttacatcatataaccaaaaggataatgaaagaatctctctatataaacagctctacaagaaaatctatcattatatgaccgacacaagaggacttgatcatttgatttgggtttactcacccgacgccaaccgagattttaaaactgatttttacccgggagcgtcttacgtgctaacagcgcttaataaaccatttgcttttacagaagtcggcccgcaaacagcaaacggcagcttcgattacagcctgttcatcaatgcaataaaacaaaaatatcctaaaaccatttactttctggcatggaatgatgaatggagcccagcagtaaacaagggtgcttcagctttatatcatgacagctggacactcaacaagggagaaatatggaatggtgattctttaacgccaatcgttgaatga。
1、引物的设计
根据上述GH26β-甘露聚糖酶的空间结构并结合多重序列比对分析，通过重叠PCR的方法进行定点突变，设计的引物如下：
表达引物：
EXPF：5'-GGGCATATGTTGTTTAAGAAACATACGATCTCTTTGC-3'（SEQ IDNO:5）；
EXPR：5'-GGGGCGGCCGCTCATTCAACGATTGGCGTTAAAG-3'（SEQ IDNO:6）；
突变引物
L85D F：5'-CCGAAGCGCCACCGGGGACTCGCCTGC-3'（SEQ ID NO:7）；
L85D R：5'-GTCCCCGGTGGCGCTTCGGATTCTATCAGC-3'（SEQ ID NO:8）；
N103D F：5'-GGATGGCTTGAAACAGCAGACATTGAAG-3'（SEQ ID NO:9）。
N103D R：5'-GTCTGCTGTTTCAAGCCATCCTCTGGCATAATCG-3'（SEQ IDNO:10）。
2、以pET-30a-man26为模板，利用上述提供的引物进行扩增，扩增条件为：95℃90sec；然后94℃30sec，60℃30sec，72℃4min30sec，重复30个循环；然后72℃10min；然后4℃60min。
扩增体系为ddH2O29μL，模板0.2μL，引物各0.9μL，FastPfu4μL，5×FastPfuBuffer10μL，dNTP5μL，扩增出相应的突变位点的PCR产物，并利用琼脂糖凝胶进行回收。
经定点突变，本发明获得了枯草芽孢杆菌来源的甘露聚糖酶氨基酸定点突变体MAN26gy，其成熟甘露聚糖酶氨基酸序列中的第85位氨基酸亮氨酸（L）改为天冬氨酸（D），第103位氨基酸天冬酰胺（N）改为天冬氨酸（D），突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
SEQ ID NO:3
LFKKHTISLLILFLLASAVLAKPIEAHTVSPVNPNAQQTTKAVMNWLAHLPNRTENRVLSGAFGGYSHDTFSMAEADRIRSATGDSPAIYGCDYARGWLETADIEDSIDVSCNGDLISYWKNGGIPQISLHLANPAFQSGHFKTPITNDQYKKILDSSTAEGKRLNAMLSKIADGLQELENQGVPVLFRPLHEMNGEWFWWGLTSYNQKDNERISLYKQLYKKIYHYMTDTRGLDHLIWVYSPDANRDFKTDFYPGASYVLTALNKPFAFTEVGPQTANGSFDYSLFINAIKQKYPKTIYFLAWNDEWSPAVNKGASALYHDSWTLNKGEIWNGDSLTPIVE。
编码上述突变后甘露聚糖酶的基因序列man26gy，具体地该基因序列如SEQ IDNO.4所示。
SEQ ID NO:4
ttgtttaagaaacatacgatctctttgctcattttatttttacttgcgtctgctgttttagcaaaaccaattgaagcgcatactgtgtcgcctgtgaatcctaatgcacagcagacaacaaaagcagtgatgaactggcttgcgcacctgccgaaccgaacggaaaacagagtcctttccggagcgttcggaggttacagtcatgacacattttctatggctgaggctgatagaatccgaagcgccaccggggactcgcctgctatttatggctgcgattatgccagaggatggcttgaaacagcagacattgaagattcaatagatgtaagctgcaacggtgatttaatttcgtattggaaaaatggcggaattccgcaaatcagtttgcacctggcgaaccctgcttttcagtcagggcattttaaaacaccgattacaaacgatcagtataaaaaaatactagattcttcaacagcagaaggaaagcggctaaatgccatgctcagcaaaattgctgacggacttcaagagctggagaaccaaggtgtgcctgttctgttcaggccactgcatgaaatgaacggcgaatggttttggtggggacttacatcatataaccaaaaggataatgaaagaatctctctatataaacagctctacaagaaaatctatcattatatgaccgacacaagaggacttgatcatttgatttgggtttactcacccgacgccaaccgagattttaaaactgatttttacccgggagcgtcttacgtgctaacagcgcttaataaaccatttgcttttacagaagtcggcccgcaaacagcaaacggcagcttcgattacagcctgttcatcaatgcaataaaacaaaaatatcctaaaaccatttactttctggcatggaatgatgaatggagcccagcagtaaacaagggtgcttcagctttatatcatgacagctggacactcaacaagggagaaatatggaatggtgattctttaacgccaatcgttgaatga。
二、重组质粒的构建及转化E.Coli BL21(DE3)
构建重组表达载体L85D/N103D-pET-30a，将上述制得的β-甘露聚糖酶基因PCR产物与表达质粒pET-30a同时用Nde I和Not I进行双酶切，琼脂糖凝胶进行产物回收纯化，进行连接，连接体系如下：
16℃保温18小时，取上述连接体系电击转化Trans-T1感受态细胞，转化方法为从低温冰箱中取Trans-T1感受态细胞至冰上溶解，加入8μL连接好的产物冰浴30min，37℃热激90sec，冰上放置2min，加入500μL液体LB，37℃震荡培养60min，震荡培养完毕后，5000rpm离心2min，弃去部分上清，将剩余约100μL的上清混匀菌体，均匀涂布于含有氨苄青霉素的固态LB平板上，37℃恒温培养箱中倒置约12h，待长出菌落后，挑菌进行验证。
取各突变体的阳性克隆子进行培养，分别提取表达质粒，转化至感受态细胞BL21(DE3)，转化方法同上（平板含有卡那霉素）。经验证后得到基因工程菌株L85D/N103D-pET-30a/E.Coli BL21(DE3)，L85D/N103D代表两个突变位点，数字前字母代表突变前氨基酸，数字后字母为突变后氨基酸。
三、重组菌株GH26β-甘露聚糖酶的纯化及最适pH值分析
取已验证后的突变基因工程菌株L85D/N103D-pET-30a/E.Coli BL21(DE3)，分别接种于300mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养2-3h后，加入终浓度0.6mMIPTG在30℃进行诱导4-6h。取发酵液进行初步酶活测定，待测得酶活后，进行发酵液浓缩。分别取浓缩后的各发酵液通过Ni-NTA柱进行纯化，纯化后的酶液进行SDS-PAGE检测，L85D/N103D-pET-30a/E.Coli BL21(DE3)纯化效果如图2所示。
甘露聚糖酶活性的测定：吸取2mL经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入2mL甘露聚糖溶液，震荡3s，50℃下温育30min。加入5mLDNS试剂，震荡均匀，沸水浴加热5min，冷却至室温，加水定容到25mL，在540nm处测定吸光度。
重组甘露聚糖酶的最适pH值测定：纯化的甘露聚糖酶液用不同的pH值(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的乙酸-乙酸钠(浓度为0.2M)缓冲液稀释，并用以上pH值的缓冲溶液配制甘露聚糖酶的底物进行酶促反应以测定其最适pH。L85D/N103D-pET-30a/E.Coli BL21(DE3)基因工程菌所产的MAN26gy甘露聚糖酶最适pH值为6.0（图3）较之原始的甘露聚糖酶MAN26最适pH值7.0（图4）降低了1.0个pH值。
四、重组菌株GH26β-甘露聚糖酶的耐酸性分析
吸取酶液0.5mL（液体直接取酶液，固体酶则称取固体原酶粉1.00g溶于80mL蒸馏水中；室温下磁力搅拌10min后用100mL容量瓶定容，离心后取上清液，待用），各自加入4.5mL的pH2.5、pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH7.0乙酸-乙酸钠缓冲液（0.2M），37℃条件下处理一个小时（注意密闭）处理完后，稀释成合适的待测酶液，以没有处理的原酶液在37℃条件下处理一小时为对照，计算处理一小时后剩余酶活。耐酸性分析(图5)表明：MAN26gy甘露聚糖酶在pH4.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理1h后剩余酶活性在80%以上。
对本发明所获得重组菌株进行发酵，并将发酵液离心后，上清经浓缩纯化，成功得到纯的突变型β-甘露聚糖酶，其特征在于通过对其进行酶学性质分析，与原始菌株的最适pH相比，由7.0下降到6.0，使得此酶更适合在饲料中应用。所述饲料为玉米-豆粕型日粮、小麦-豆粕型日粮、杂粮杂粕型日粮。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  青岛根源生物技术集团有限公司
 
<120>  一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy及其制备方法和应用
 
<160>  10   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  342
<212>  PRT
<213>  Bacillus subtilis
 
<400>  1
 
Leu Phe Lys Lys His Thr Ile Ser Leu Leu Ile Leu Phe Leu Leu Ala
1                    5                        10                       15     
 
Ser Ala Val Leu Ala Lys Pro Ile Glu Ala His Thr Val Ser Pro Val
                20                      25                       30         
 
Asn Pro Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Ala Val Met Asn Trp Leu Ala
           35                       40                        45             
  
His Leu Pro Asn Arg Thr Glu Asn Arg Val Leu Ser Gly Ala Phe Gly
     50                        55                        60                 
 
Gly Tyr Ser His Asp Thr Phe Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Arg
65                       70                       75                      80 
 
Ser Ala Thr Gly Leu Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Ala Arg
                     85                       90                       95     
 
 Gly Trp Leu Glu Thr Ala Asn Ile Glu Asp Ser Ile Asp Val Ser Cys
                100                     105                      110        
  
Asn Gly Asp Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Asn Gly Gly Ile Pro Gln Ile
           115                     120                      125            
  
Ser Leu His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Gln Ser Gly His Phe Lys Thr
    130                       135                      140                
 
Pro Ile Thr Asn Asp Gln Tyr Lys Lys Ile Leu Asp Ser Ser Thr Ala
145                     150                      155                     160
 
Glu Gly Lys Arg Leu Asn Ala Met Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu
                     165                        170                    175    
 
Gln Glu Leu Glu Asn Gln Gly Val Pro Val Leu Phe Arg Pro Leu His
                180                      185                      190        
 
Glu Met Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln
          195                       200                      205            
 
Lys Asp Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Gln Leu Tyr Lys Lys Ile
     210                      215                      220                
 
Tyr His Tyr Met Thr Asp Thr Arg Gly Leu Asp His Leu Ile Trp Val
225                      230                       235                    240
 
Tyr Ser Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly
                     245                      250                      255    
 
Ala Ser Tyr Val Leu Thr Ala Leu Asn Lys Pro Phe Ala Phe Thr Glu
                260                     265                      270        
  
Val Gly Pro Gln Thr Ala Asn Gly Ser Phe Asp Tyr Ser Leu Phe Ile
          275                      280                      285            
 
Asn Ala Ile Lys Gln Lys Tyr Pro Lys Thr Ile Tyr Phe Leu Ala Trp
      290                     295                    300                
  
Asn Asp Glu Trp Ser Pro Ala Val Asn Lys Gly Ala Ser Ala Leu Tyr
305                      310                      315                      320
 
His Asp Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asn Gly Asp Ser
                     325                       330                     335    
 
Leu Thr Pro Ile Val Glu
               340        
 
<210>  2
<211>  1029
<212>  DNA
<213>  Bacillus subtilis
 
<400>  2
ttgtttaaga aacatacgat ctctttgctc attttatttt tacttgcgtc tgctgtttta     60
 
gcaaaaccaa ttgaagcgca tactgtgtcg cctgtgaatc ctaatgcaca gcagacaaca    120
 
aaagcagtga tgaactggct tgcgcacctg ccgaaccgaa cggaaaacag agtcctttcc    180
 
ggagcgttcg gaggttacag tcatgacaca ttttctatgg ctgaggctga tagaatccga    240
 
agcgccaccg ggctatcgcc tgctatttat ggctgcgatt atgccagagg atggcttgaa    300
 
acagcaaata ttgaagattc aatagatgta agctgcaacg gtgatttaat ttcgtattgg    360
 
aaaaatggcg gaattccgca aatcagtttg cacctggcga accctgcttt tcagtcaggg    420
 
cattttaaaa caccgattac aaacgatcag tataaaaaaa tactagattc ttcaacagca    480
 
gaaggaaagc ggctaaatgc catgctcagc aaaattgctg acggacttca agagctggag    540
 
aaccaaggtg tgcctgttct gttcaggcca ctgcatgaaa tgaacggcga atggttttgg    600
 
tggggactta catcatataa ccaaaaggat aatgaaagaa tctctctata taaacagctc    660
 
tacaagaaaa tctatcatta tatgaccgac acaagaggac ttgatcattt gatttgggtt    720
 
tactcacccg acgccaaccg agattttaaa actgattttt acccgggagc gtcttacgtg    780
 
ctaacagcgc ttaataaacc atttgctttt acagaagtcg gcccgcaaac agcaaacggc    840
 
agcttcgatt acagcctgtt catcaatgca ataaaacaaa aatatcctaa aaccatttac    900
 
tttctggcat ggaatgatga atggagccca gcagtaaaca agggtgcttc agctttatat    960
 
catgacagct ggacactcaa caagggagaa atatggaatg gtgattcttt aacgccaatc   1020
 
gttgaatga                                                           1029
 
<210>  3
<211>  342
<212>  PRT
<213>  Bacillus subtilis
 
<400>  3
 
Leu Phe Lys Lys His Thr Ile Ser Leu Leu Ile Leu Phe Leu Leu Ala
1                     5                       10                        15     
 
Ser Ala Val Leu Ala Lys Pro Ile Glu Ala His Thr Val Ser Pro Val
                20                       25                      30         
 
Asn Pro Asn Ala Gln Gln Thr Thr Lys Ala Val Met Asn Trp Leu Ala
           35                        40                        45             
 
His Leu Pro Asn Arg Thr Glu Asn Arg Val Leu Ser Gly Ala Phe Gly
     50                        55                        60                 
  
Gly Tyr Ser His Asp Thr Phe Ser Met Ala Glu Ala Asp Arg Ile Arg
65                         70                      75                       80 
 
Ser Ala Thr Gly Asp Ser Pro Ala Ile Tyr Gly Cys Asp Tyr Ala Arg
                     85                       90                       95     
  
Gly Trp Leu Glu Thr Ala Asp Ile Glu Asp Ser Ile Asp Val Ser Cys
                100                      105                     110        
 
Asn Gly Asp Leu Ile Ser Tyr Trp Lys Asn Gly Gly Ile Pro Gln Ile
           115                     120                      125            
 
Ser Leu His Leu Ala Asn Pro Ala Phe Gln Ser Gly His Phe Lys Thr
    130                      135                      140                
 
Pro Ile Thr Asn Asp Gln Tyr Lys Lys Ile Leu Asp Ser Ser Thr Ala
145                     150                      155                     160
 
Glu Gly Lys Arg Leu Asn Ala Met Leu Ser Lys Ile Ala Asp Gly Leu
                      165                       170                    175    
 
Gln Glu Leu Glu Asn Gln Gly Val Pro Val Leu Phe Arg Pro Leu His
                180                      185                      190        
 
Glu Met Asn Gly Glu Trp Phe Trp Trp Gly Leu Thr Ser Tyr Asn Gln
           195                      200                      205            
 
Lys Asp Asn Glu Arg Ile Ser Leu Tyr Lys Gln Leu Tyr Lys Lys Ile
     210                      215                      220                
 
Tyr His Tyr Met Thr Asp Thr Arg Gly Leu Asp His Leu Ile Trp Val
225                      230                       235                     240
 
Tyr Ser Pro Asp Ala Asn Arg Asp Phe Lys Thr Asp Phe Tyr Pro Gly
                     245                      250                      255    
 
Ala Ser Tyr Val Leu Thr Ala Leu Asn Lys Pro Phe Ala Phe Thr Glu
                260                      265                     270        
  
Val Gly Pro Gln Thr Ala Asn Gly Ser Phe Asp Tyr Ser Leu Phe Ile
          275                       280                     285            
 
Asn Ala Ile Lys Gln Lys Tyr Pro Lys Thr Ile Tyr Phe Leu Ala Trp
     290                      295                    300                
 
Asn Asp Glu Trp Ser Pro Ala Val Asn Lys Gly Ala Ser Ala Leu Tyr
305                       310                     315                      320
  
His Asp Ser Trp Thr Leu Asn Lys Gly Glu Ile Trp Asn Gly Asp Ser
                     325                      330                      335    
 
Leu Thr Pro Ile Val Glu
               340        
 
<210>  4
<211>  1029
<212>  DNA
<213>  Bacillus subtilis
 
<400>  4
ttgtttaaga aacatacgat ctctttgctc attttatttt tacttgcgtc tgctgtttta     60
 
gcaaaaccaa ttgaagcgca tactgtgtcg cctgtgaatc ctaatgcaca gcagacaaca    120
 
aaagcagtga tgaactggct tgcgcacctg ccgaaccgaa cggaaaacag agtcctttcc    180
 
ggagcgttcg gaggttacag tcatgacaca ttttctatgg ctgaggctga tagaatccga    240
 
agcgccaccg gggactcgcc tgctatttat ggctgcgatt atgccagagg atggcttgaa    300
 
acagcagaca ttgaagattc aatagatgta agctgcaacg gtgatttaat ttcgtattgg    360
 
aaaaatggcg gaattccgca aatcagtttg cacctggcga accctgcttt tcagtcaggg    420
 
cattttaaaa caccgattac aaacgatcag tataaaaaaa tactagattc ttcaacagca    480
 
gaaggaaagc ggctaaatgc catgctcagc aaaattgctg acggacttca agagctggag    540
 
aaccaaggtg tgcctgttct gttcaggcca ctgcatgaaa tgaacggcga atggttttgg    600
 
tggggactta catcatataa ccaaaaggat aatgaaagaa tctctctata taaacagctc    660
 
tacaagaaaa tctatcatta tatgaccgac acaagaggac ttgatcattt gatttgggtt    720
 
tactcacccg acgccaaccg agattttaaa actgattttt acccgggagc gtcttacgtg    780
 
ctaacagcgc ttaataaacc atttgctttt acagaagtcg gcccgcaaac agcaaacggc    840
 
agcttcgatt acagcctgtt catcaatgca ataaaacaaa aatatcctaa aaccatttac    900
 
tttctggcat ggaatgatga atggagccca gcagtaaaca agggtgcttc agctttatat    960
 
catgacagct ggacactcaa caagggagaa atatggaatg gtgattcttt aacgccaatc   1020
 
gttgaatga                                                           1029
 
<210>  5
<211>  37
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
gggcatatgt tgtttaagaa acatacgatc tctttgc                              37
 
<210>  6
<211>  34
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
ggggcggccg ctcattcaac gattggcgtt aaag                                 34
 
<210>  7
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
ccgaagcgcc accggggact cgcctgc                                         27
 
<210>  8
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
gtccccggtg gcgcttcgga ttctatcagc                                      30
 
<210>  9
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  9
ggatggcttg aaacagcaga cattgaag                                        28
 
<210>  10
<211>  34
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  10
gtctgctgtt tcaagccatc ctctggcata atcg                                 34 
 

Claims (7)

1.一种优化的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因man26gy，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.包含权利要求2所述编码基因man26gy的重组载体。
4.根据权利要求3所述的含有编码基因man26gy的重组载体，其特征在于重组载体为重组载体pET-30a-MAN26gy，它由所述甘露聚糖酶基因man26gy***到质粒pET-30a上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间而得。
5.包含权利要求2所述编码基因man26gy的重组菌株，其特征在于所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌。
6.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
1)用含有甘露聚糖酶MAN26gy的编码基因man26gy的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组甘露聚糖酶表达；
3)回收并纯化所表达的甘露聚糖酶MAN26gy。
7.权利要求1所述的耐酸性甘露聚糖酶MAN26gy在制备饲料添加剂中的应用。
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