CN103695390B

CN103695390B - 一种糖化酶及重组表达糖化酶的工程菌株

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Publication number: CN103695390B
Application number: CN201310719904.5A
Authority: CN
Inventors: 刘士成; 吴佳鹏; 朱倩倩; 黄亦钧; 张慧丹
Original assignee: QINGDAO KDN BIOTECH CO Ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-12-23
Also published as: CN103695390A

Abstract

本发明提供了一种糖化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。所述糖化酶的最适作用温度为75℃，在70℃-80℃范围内能保持80%以上的酶活；最适作用pH为6.0，且在pH4.0-7.0范围内，能保持70%以上的酶活。该糖化酶可广泛应用于葡萄糖的生产中，2.5h时，其DE值（还原糖值）达到最高为97%；所述糖化酶专一性强，能高效分解α-1,4-糖苷键，产物中葡萄糖的含量高达90%。而且所述糖化酶的耐温性好，所以淀粉液化后可以不用增加降温步骤，直接加入本发明所述糖化酶进行酶解反应，从而节省工时和能源，更节约了生产成本，市场前景广阔。

Description

一种糖化酶及重组表达糖化酶的工程菌株

技术领域

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种糖化酶及重组表达糖化酶的里氏木霉工程菌株。

背景技术

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase），它能把淀粉从非还原性末端水解α-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖。糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性末端切开α-1，4键处，也能缓慢切开α-1，6糖苷键。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性末端依次切下葡萄糖单位，在遇到1，6键时，先将α-1，6键分割，再将α-1，4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖。

糖化酶用途广泛，用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵，还可用于生产各种规格的葡萄糖。凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。糖化酶对设备没有腐蚀，使用安全，且工艺简单、性能稳定，利用糖化酶对淀粉进行水解比较安全，还有利于实现生产机械化和文明生产。

目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始，中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS.3.4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验，均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食，产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶，这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达***是黑曲霉，其产酶量（蛋白量）较高，但是受到糖化酶本身性质的影响，黑曲霉表达糖化酶的比活比较低，不能适应市场的需求。因此，开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型糖化酶及重组表达该糖化酶的基因工程菌。本发明将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉（Trichoderma reesei）中进行表达，构建得到高效表达该糖化酶的重组菌株，显著提高了糖化酶的产量，有利于糖化酶的广泛应用。

本发明一方面涉及一种糖化酶，其特征在于，所述糖化酶包括：

a)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

b)其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相似性高于90%以上，且具有糖化酶功能的酶。

所述糖化酶的编码基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面涉及携带有上述糖化酶基因的表达载体。

本发明还提供用于重组表达糖化酶的里氏木霉（Trichoderma reesei）。

本发明还涉及上述糖化酶的应用。

本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到413U/mL。所述糖化酶的最适作用温度为75℃，在70℃-80℃范围内能保持80%以上的酶活；最适作用pH为6.0，且在pH4.0-7.0范围内，能保持70%以上的酶活。。该糖化酶可广泛应用于葡萄糖的生产中，2.5h时，其DE值（还原糖值）达到最高为97%；所述糖化酶专一性强，能高效分解α-1,4-糖苷键，产物中葡萄糖的含量高达90%。而且所述糖化酶的耐温性好，所以淀粉液化后可以不用增加降温步骤，直接加入本发明所述糖化酶进行酶解反应，从而节省工时和能源，更节约了生产成本，市场前景广阔。

附图说明

图1为本发明构建的表达载体质粒图谱。

图2为里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指为重组表达的糖化酶。

图3为本发明所述糖化酶作用温度-相对酶活曲线图。

图4为糖化酶VL-2和VL-3作用温度-相对酶活曲线图。

图5为本发明所述糖化酶作用pH-相对酶活曲线图。

图6为糖化酶VL-2和VL-3作用pH-相对酶活曲线图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,3nd Ed.(Singleton et al.,2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale et al.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的***序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。

术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。

术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。

由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1基因克隆与表达载体构建

1.1总DNA的提取

将绳状青霉（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号3.3791）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mM Tris-HCl,100mM EDTA,250mM NaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

1.2基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物：ATGGCTCGTCAATTTCTGTTGT

下游引物：TTAGGCGGTGACAGAGGCGGTT

PCR扩增条件为94℃3min；94℃30S；58℃30S，72℃2min30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。连接T载体后，送至北京华大基因研究中心进行测序分析。将扩增产物的测序结果根据三连体密码子原则进行翻译，获得所述扩增产物编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

经NCBI Blast序列比对发现，SEQ ID NO:1编码的蛋白属于糖苷水解酶第15家族，与Talaromyces stipitatus的糖化酶氨基酸序列相似性最高，为83%，是一个新的等位基因。

委托上海生工生物工程股份有限公司，将糖化酶的氨基酸序列SEQ IDNO:1，按照里氏木霉的密码子偏好性进行优化，合成糖化酶的编码核苷酸序列SEQ ID NO:2；在起始密码子ATG前端加KpnI酶切位点，在终止密码子TAA后端加XbaI酶切位点，用于表达载体的构建；合成的基因序列SEQ ID NO:2连接于pUC57载体，命名为pU-Glu11496。

实施例2里氏木霉工程菌的构建

2.1表达载体构建

把质粒pU-Glu11496进行Kpn I和Xba I双酶切，回收所需目的条带即糖化酶基因。同样，对木霉表达质粒pTG也进行Kpn I和Xba I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即糖化酶基因和表达载体进行22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5a。相应的阳性克隆表达质粒命名为pTG-glu11496，质粒图谱如图1所示。

2.2原生质体制备

接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约60mL YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20mL裂解酶液(0.2g/10mL，0.7M NaCl溶解，Sigma L1412）酶解2小时；取出酶解液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心10min；弃上清，加5mL溶液2悬浮，然后3000rpm，离心10min；加适量溶液2悬浮分装（200μl/管，10⁸个/mL）。

2.3转化与验证

取pTG-glu11496DNA加入到200μl原生质体中，接着加入50μl25%PEG溶液轻轻混匀，冰浴20min；然后加入2mL25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50mL左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO₄,1%KH₂PO4,0.6%(NH₄)₂SO₄,1%葡萄糖,18.3%山梨醇,0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/mL潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)₂SO₄,1.5%KH₂PO₄,0.06%MgSO₄,0.06%CaCl₂，1.5%琼脂），30℃黑暗培养数天至转化子长出。

将转化子接种于YEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中培养过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mM Tris-HCl,100mM EDTA,250mM NaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物（上游引物：ATGGCTCGTCAATTTCTGTTG和下游引物：GGCGGTGACAGAGGCGGTTGC）扩增目的基因验证转化子。PCR扩增条件为94℃3min；94℃30S；58℃30S，72℃90S30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，经过PCR反应选育和验证阳性转化子。所获得的阳性工程菌命名为里氏木霉K-VL11496（Trichoderma reeseiK-VL11496）。

实施例3发酵和酶学性质测定

将上述里氏木霉工程菌K-VL11496接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH₄)₂SO₄，0.09%MgSO₄，2%KH₂PO₄，0.04%CaCl₂，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000），28℃培养48小时，然后25℃乳糖诱导培养48小时，取发酵上清液，进行12%SDS-PAGE分析。结果如图2所示，其中箭头所指处为重组表达的糖化酶，说明里氏木霉工程菌K-VL11496能够重组表达本发明的糖化酶，考马斯亮蓝法测定其蛋白表达量约为1.46g/L。

酶活测定方法

甲、乙两支50mL比色管，分别加入25mL的2％可溶性淀粉溶液和5mL的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH4.6)；于40±0.2℃的恒温水浴中预热5～10min。在甲管中加入酶制备液2.0mL摇匀并立即记时；反应1h后，立即在甲、乙两管各加0.2mL的20％氢氧化钠溶液，立即摇匀并将两管取出迅速用水冷却；然后于乙管中补加酶制备液2.0mL(作为对照)。取两管中上述反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入0.1N碘液10mL，再加0.1N氢氧化钠溶液15mL(边加边摇晃)，放置暗处15min，加入2N硫酸2mL；最后用0.05N硫代硫酸钠溶液滴定至无色为终点。

酶活X＝(A-B)×N×90.05×n

其中:X——酶活力单位,μ/g(mL);

A——空白试验消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;

B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的毫升数;

N——硫代硫酸钠溶液的当量浓度;

n——稀释倍数;

90.05——1mL1N硫代硫酸钠相当葡萄糖毫克数;

按照上述测定方法，取1mL上述摇瓶发酵的上清液进行酶活测定。结果显示其酶活为413U/mL，说明糖化酶基因在里氏木霉工程菌中得到了高效表达。

实施例4酶学性质分析

为了进一步分析本发明获得的新型糖化酶的酶学性质，申请人对该酶的最适作用温度和pH值进行了检测，同时分别与申请人2012年申请的两项发明专利（申请号分别为201210491553.2和201210500500.2）中涉及的两种糖化酶进行了比较。

将发明专利201210491553.2中所述糖化酶命名为糖化酶VL-2;

将发明专利201210500500.2中所述糖化酶命名为糖化酶VL-3;

4.1最适作用温度分析

在pH5.0条件下，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃条件下测定本发明所述里氏木霉工程菌K-VL11496发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。结果如图3所示，本发明所述糖化酶的最适作用温度为75℃，在70℃-80℃范围内能保持80%以上的酶活。

按照上述同样方法分别检测糖化酶VL-2和糖化酶VL-3的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。结果如图4所示，糖化酶VL-2和VL-3的最适作用温度为70℃，在55℃-75℃能保持60%以上的酶活性。

4.2最适作用pH分析

在50℃条件下，分别用pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释本发明所述里氏木霉工程菌K-VL11496发酵上清液，测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。结果如图5所示，本发明所述糖化酶的最适作用pH为6.0，且在pH4.0-7.0范围内，能保持70%以上的酶活。

按照上述同样方法分别检测糖化酶VL-2和糖化酶VL-3的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活。结果如图6所示，糖化酶VL-2的最适作用pH为5.0，糖化酶VL-3的最适作用pH为5.5，在pH3.5-6.0范围内能保持80%以上的酶活水平。

综上，与糖化酶VL-2和VL-3相较，本发明获得的新型糖化酶最适作用温度更高，耐高温效果更好，pH耐受范围更宽泛，因此，本发明所述新型糖化酶更适合在高温条件下应用，催化效率更高，而且有利于节约生产成本。

实施例5转糖实验

糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键，可广泛应用于葡萄糖的生产。在生产中，先利用淀粉酶将淀粉液化，液化淀粉的pH约为5.5，降温至75℃，然后加入糖化酶进行后续的糖化过程。

取10mL液化淀粉，加入1mL本发明的重组糖化酶（1000U/mL）；75℃作用1.5h后，测定反应液的DE值（还原性糖值），达到95%；2.5h时，其DE值达到97%，2.5h之后DE值不再升高，此时反应液中葡萄糖的含量为90%。

上述结果表明，本发明的糖化酶专一性强，能高效分解α-1,4-糖苷键，产物中葡萄糖的含量高达90%。而且本发明所述糖化酶的耐温性好，所以淀粉液化后可以不用增加降温步骤，直接加入本发明所述糖化酶进行酶解反应，从而节省工时和能源，更节约了生产成本。

本发明的重组糖化酶还可用于甜味剂的生产中或用于生产有机物的发酵方法中，所述有机化合物例如乙醇、柠檬酸、抗坏血酸、氨基酸、抗生素等。

Claims

1.一种糖化酶，其特征在于，所述糖化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种编码权利要求1所述的糖化酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求2所述的基因。

4.一种工程菌，其特征在于，所述的工程菌为携带有权利要求3所述的重组表达载体的菌株。

5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述的菌株为里氏木霉。

6.权利要求1所述的糖化酶在制备葡萄糖中的应用。