CN103695314B - 一种雨生红球藻营养细胞的保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种雨生红球藻细胞的保存方法，是将雨生红球藻在氮、磷元素的浓度比为20-30:1的培养液中行扩增培养；培养的温度12-20℃，且使光源发出的光通过厚度为0.05-0.12mm的红膜，光照强度为500-1500lx。本发明与现有技术相比，保存时间长，不容易老化，培养液中的营养细胞能够保持营养生长，培养至平台期最大密度时20-35天，平台期后，也能保持20-35天，进行下一步营养培养或转化，并且继续保持快速的生长状态，该方法简便易行，降低了保种的设施投入，降低了人工成本。
Description
技术领域
本发明属于藻类细胞培养保存技术领域，具体涉及一种雨生红球藻营养细胞的保存方法。
背景技术
天然虾青素（Astaxanthin）是类胡萝卜素的一种，是迄今为止发现的自然界中抗氧化能力最强物质；其具有保护皮肤，提高免疫力，抑制癌症、缓解疲劳、延缓衰老以及预防和治疗心脑血管疾病方面的功能，主要作为鱼类的天然着色剂，还广泛应用于水产品，化妆品，医药等行业。而雨生红球藻Haematococcus pluvialis是一种生产的天然虾青素单细胞绿藻，其虾青素物质含量高，被视为天然虾青素的“浓缩品”，且天然虾青素结构的稳定性和安全性高；因此，培养雨生红球藻已成为未来获取天然虾青素的最佳途径，从而得到各国的大力推进。
目前培养雨生红球藻生产虾青素采用一步法或二步法的技术途径，一步法如公告号为CN101586140，专利名称为“一种培养雨生红球藻生产虾青素的简易方法”的发明专利，就公开了在一个光生物反应器中用成份较复杂的培养基（培养液）完成雨生红球藻的营养生长和雨生红球藻转化（孢子转化）及虾青素的累积过程。二步法如公开号为CN1966660，专利名称为“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”的发明专利，公开了一种设置在固定架上的光生物反应器***的培养装置，在连接的二个单元光生物反应器上用培养液分别进行营养生长和雨生红球藻转化及虾青素的累积过程。
但不论是一步法或二步法，均需要大量雨生红球藻营养细胞的累积与保存。而营养细胞的保存与生长是一对矛盾：生长迅速，容易提早进入平台期，保存时间就短；生长缓慢，保存时间相对就长，将影响营养细胞的累积量。营养细胞的保存与老化也是一对矛盾的条件：保存时间长，容易出现老化，影响继续培养、转化。雨生红球藻营养细胞的累积量不足，将引起转化的效率不高。因此，雨生红球藻营养细胞的高效保存是继续营养生长和转化的前提，并直接关系到生产虾青素的效益以及雨生红球藻产业的发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种雨生红球藻营养细胞的保存方法，使保存的雨生红球藻具有继续培养后还能保持快速生长状态的活力，从而弥补现有技术的不足。
本发明的保存方法，是将雨生红球藻细胞在培养液中行扩增培养后；再将培养后的雨生红球藻细胞在氮、磷元素的浓度比为20-30:1的保存液进行保存培养，保存的温度12-20℃，光线的波长为660-740nm，光照强度为500-1500lx。
所述的保存液中，其一种配比包含有如下的组分：1000mg/L NaNO3、5mg/L KH2PO4、2.5mg/L FeSO4·7H2O、0.25mg/L MnSO4和5.0mg/LEDTA-Na2。
保存培养的光线是使光源发出的光，通过厚度为0.08-0.12mm的红膜，获得波长为660-740nm的光。
上述的保存液中还添加有氨苄西林，添加浓度为0.10-1.0万u/L。氨苄西林可有效的防止雨生红球藻细胞形成凝聚，从而防止了培养液中雨生红球藻凝结，在继续生长时，缩短了延缓期。
其中雨生红球藻保存时的密度为9-15万/ml。
本发明与现有技术相比，保存时间长，不容易老化，培养液中的营养细胞能够保持营养生长，培养至平台期达到最大密度，平台期后，也能保持20-35天，并且进行下一步营养培养或转化，能够继续保持快速的生长状态。该方法简便易行，降低了保种的设施投入，降低了人工成本。
具体实施方式
申请人在长期的研究中发现，在对雨生红球藻营养细胞进行扩增培养同时，调整营养液成分，使保存液中氮、磷元素的浓度比为20-30:1，即氮、磷元素的浓度比大大超过常见的比例；并使温度为12-20℃；在照射的光源与培养液之间添加透过光波长为660-740nm的红膜；且培养液的表面光照条件为500-1500lx。上述的条件能够有效的使雨生红球藻的保存时间变长，不容易老化。
下面结合实施例对本发明的保存方法进行详细的描述。
实施例1：
培养液的配制：120mg/L的NaNO3、15mg/L的KH2PO4、2.5mg/L的FeSO4·7H2O、0.25mg/L的MnSO4、2.5mg/L的EDTA-Na2。
接种的雨生红球藻营养细胞密度为3-5万/ml，在20℃，自然光照射，培养光强为2000lx，培养5天后，密度为9-15万/ml，进入保存状态。
保存液的配制，保存液中主要成分的含量为1000mg/L的NaNO3，和50mg/L的KH2PO4，2.5mg/L的FeSO4·7H2O、0.25mg/L的MnSO4、5.0mg/L的EDTA-Na2。保存液可以在培养液中直接添加NaNO3和KH2PO4制成的。
保存条件的控制：在照射的光源与培养液之间添加透过光波长为660-740nm的红膜；且保存液的表面光照条件为500-1500lx。
控制温度为12-20℃，氨苄西林的添加剂量为0.10-1.0万u/L。
按照上述方法所保存的雨生红球藻营养细胞，在保存培养35天后，密度为15-25万/ml；通过叶绿素荧光仪测定活力指标为0.612。恢复生长后活力指标为最佳的0.752。也就是说，上述的方法不但实现了雨生红球藻营养细胞的长时间保存，而且保存的细胞没有发生老化，容易进入后续的转化及虾青素的累积过程。
实施例2
培养液的配制：130mg/L的NaNO3、18mg/L的KH2PO4、2.5mg/L的FeSO4·7H2O、0.25mg/L的MnSO4、2.5mg/L的EDTA-Na2。
在配制好的培养液中接种的雨生红球藻营养细胞，使接种后培养液中雨生红球藻营养细胞的密度为3.2万/ml，在23℃，自然光照射，培养光强为2000lx培养6天后，密度为13.5万个细胞/ml。此时在培养液中加入NaNO3和KH2PO4作为保存液，使保存液中NaNO3的含量为1200mg/L，KH2PO4为40mg/L，并添加氨苄西林，使氨苄西林在保存液中的终浓度为0.18万u/L。将培养液用红膜进行覆盖，使通过光的波长为660-740nm；且保存液的表面光照条件为1300lx，培养温度为15℃，进入保存培养状态。
在保存培养30天后，镜检测定雨生红球藻营养细胞的密度为19.5万个细胞/ml；通过叶绿素荧光仪测定活力指标为0.654。再转入正常的培养条件后，两天后活力指标为0.793。
综上，本发明的方法能够有效的解决雨生红球藻营养细胞保存与老化之间的矛盾，具有很好的推广应用价值。
Claims (3)
1.一种雨生红球藻营养细胞的保存方法，其特征在于，所述的保存方法是将雨生红球藻细胞在培养液中行扩增培养；然后将雨生红球藻细胞在氮、磷元素的浓度比为20-30:1的保存液进行保存培养，保存的温度12-20℃，光线的波长为660-740nm，光照强度为500-1500lx；
所述的保存液的组成如下：1000mg/L NaNO3、50mg/L KH2PO4、2.5mg/L FeSO4·7H2O、0.25mg/L MnSO4和5.0mg/L EDTA-Na2；
所述的光线是使光源发出的光通过厚度为0.08-0.12mm的红膜获得的；
所述雨生红球藻在保存液中的密度为9-15万cell/ml。
2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述的保存液中添加有氨苄西林。
3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述的氨苄西林的添加浓度为0.10-1.0万u/L。
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