发明内容
基于此,有必要提供一种能显著降低假阳性出现概率的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用。
一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体,包括由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的轻链可变区与人IgG1的轻链恒定区构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区与人IgG1的重链恒定区构成的重链。
在其中一个实施例中,所述抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体由保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞产生。
在其中一个实施例中,所述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在其中一个实施例中,所述重链可变区含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
一种抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体的构建方法,包括如下步骤:
分别构建含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体,其中,含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因,含有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的重链恒定区的表达基因;
将所述表达载体转染到同一宿主细胞中;
从所述宿主细胞中回收得到所述抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体。
在其中一个实施例中,待***如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体预留有XbaI和PmlI双酶切位点;待***如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体预留有NheI和HindIII双酶切位点。
在其中一个实施例中,所述如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得:
从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR,RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以SEQ ID NO.5及SEQID NO.6所示的引物序列进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中表达;
回收DH5α感受态细胞表达的产物,使用如SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示的引物序列进行PCR,得到所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列;
所述如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得:
从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR,RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以SEQ ID NO.9及SEQID NO.10所示的引物序列进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中表达;
回收DH5α感受态细胞表达的产物,使用如SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12所示的引物序列进行PCR,得到所述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
一种编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的DNA。
一种编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的DNA。
一种包含编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的DNA和/或编码如SEQID NO.2所示的氨基酸序列的DNA的真核细胞表达载体。
一种由上述真核细胞表达载体转染的宿主细胞。
上述重组抗体在制备检测心肌肌钙蛋白I检测试剂或检测仪器中的应用。
一种心肌肌钙蛋白I的检测试纸,包括上述重组抗体。
在其中一个实施例中,所述检测试纸包括支撑薄片、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫、检测线及质控线,所述样品垫、所述金标垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸收垫从所述支撑薄片的一端向另一端依次设置在所述支撑薄片上,所述样品垫与所述金标垫部分重叠,所述金标垫与所述硝酸纤维素膜部分重叠,所述硝酸纤维素膜与所述吸收垫部分重叠,所述检测线及所述质控线设在所述硝酸纤维素膜上,且所述检测线设在靠近所述金标垫的一端,所述质控线设在靠近所述吸收垫的一端,所述金标垫上涂覆有所述重组抗体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的重组抗体,所述检测线为亲和纯化的抗心肌肌钙蛋白I的兔多抗,所述质控线为羊抗鼠IgG抗体。
一种检测试剂盒,包括上述心肌肌钙蛋白I的检测试纸。
上述重组抗体与鼠源性抗体相比,既保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了与人血清中的抗鼠抗体发生非特异性反应,因此,从临床诊断应用方面来看,上述重组抗体比鼠源性抗体更具有应用价值。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体及其构建方法和应用作进一步详细的说明。
一实施方式的抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体,包括由抗人心肌肌钙蛋白I(hcTnI)的鼠源抗体(mAb)的轻链可变区(L链V区,VL)与人IgG1的轻链恒定区(L链C区,CL,如k链C区(Ck)等)构成的轻链和由抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体的重链可变区(H链V区,VH)与人IgG1的重链恒定区(H链C区,CH)构成的重链。
其中,上述抗人心肌肌钙蛋白I的鼠源抗体由保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞产生,该杂交瘤细胞命名为CTNI-C4,已于2013年11月13日保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心(即中国典型培养物保藏中心)。上述轻链可变区含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列,其对应的DNA序列为序列表中SEQ ID NO.3;重链可变区含有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列,其对应的DNA序列为序列表中SEQ ID NO.4。
SEQ ID NO.3的序列为: GAT GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA GCCTCCATC TCTTGC TGGTAC CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC TCCAAAACTC CTGATCTAC GGGGTCCCAG ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGC AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGC TTCGGTG CTGGGACCAA GCTGGAGCTG AAACGG。SEQ ID NO.4的序列为: CAG GTCCAACTGC AGCAGCCTGG GTCTGAACTG GTGAGGCCTG GGGCTTCAGT GAAGCTGTCC TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACC TGGGTGAA GCAGAGGCCT GGACAAGGCC TTGAATGGAT TGGT AAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CGTCCAGCGC AGCCTACATG CACCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCACA A TGGGGTCA AGGAACCTCA GTCACTGTCT CTGCA。其中,用点下划线标记的是抗体的信号肽(Signal Peptide,SP)序列,用实下划线标记的序列是框架区(framework Region,FR)序列,斜体序列是互补决定区(complementarydetermining region,CDR)序列,即高变区。
本实施方式还提供了一种抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体的构建方法,包括如下步骤:
分别构建含有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体,其中,含有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的轻链恒定区的表达基因,含有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体含有人IgG1的重链恒定区的表达基因;
将表达载体转染到同一宿主细胞中;
从宿主细胞中回收得到抗人心肌肌钙蛋白I重组抗体。
其中,待***如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的表达载体预留有XbaI和PmlI双酶切位点;待***如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体预留有NheI和HindIII双酶切位点。
如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得:
从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR,RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以SEQ ID NO.5及SEQID NO.6所示的引物序列进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中表达;
回收DH5α感受态细胞表达
的产物,使用如SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8所示的引物序列进行PCR,得到SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是通过如下步骤制备获得:
从保藏号为CCTCC C2013185的杂交瘤细胞中提取RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR,RT-PCR扩增产物70℃酶失活后作为模板,以SEQ ID NO.9及SEQID NO.10所示的引物序列进行PCR,回收PCR产物,PCR产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中表达;
回收DH5α感受态细胞表达的产物,使用如SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12所示的引物序列进行PCR,得到SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
本实施方式应用一套设计的引物从自主构建并培养的抗hcTnI鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株(CCTCC C2013185)中克隆出了抗hcTnI抗体的轻链和重链的可变区基因。将测序后的轻链和重链可变区序列在IMGT抗体数据库里进行分析,结果表明VH基因(重链可变区基因)与数据库中的鼠源VH基因具有较高的同源性,且属于鼠VH1基因家族;VL基因(轻链可变区基因)与数据库中的鼠源VL基因具有较高的同源性,且属于鼠Vk2基因家族。
此外,本实施方式还提供了一种包含编码SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4序列的DNA的表达载体,如pFP-IgCH和pFP-IgCK或基因工程常用的其他真核表达载体,以及该DNA表达载体转染的宿主细胞,如Freestyle CHO-S细胞或基因工程常用的其他表达细胞。
上述重组抗体可广泛应用在制备检测心肌肌钙蛋白I检测试剂或检测仪器的领域中。如,一种心肌肌钙蛋白I的检测试剂盒,其包括壳体、检测试纸和其他检测试剂。
如图1和图2所示,本实施方式的检测试纸100包括支撑薄片110、样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140、吸收垫150、检测线160及质控线170。样品垫120、金标垫130、硝酸纤维素膜140及吸收垫150从支撑薄片110的一端向另一端依次设置在支撑薄片110上。样品垫120与金标垫130部分重叠,金标垫130与硝酸纤维素膜140部分重叠,硝酸纤维素膜140与吸收垫150部分重叠。检测线160及质控线170设在硝酸纤维素膜上,且检测线160设在靠近金标垫130的一端,质控线170设在靠近吸收垫150的一端。支撑薄片110采用不吸水的材料制作。样品垫120用于样品点样。重组抗体包附胶体金颗粒形成胶体金标记的重组抗体均匀涂覆在金标垫130上。检测线160为亲和纯化的抗心肌肌钙蛋白I的兔多抗,质控线170为羊抗鼠IgG抗体。
如图3所示,检测试纸100可置于检测试剂盒的壳体200内。壳体200上开设有加样孔210及观察窗220。加样孔210对应样品垫120的位置。检测线160及质控线170裸露于观察窗220中,方便观察。
其他检测试剂可以根据需要直接在实验室制备。
上述检测试剂盒利用双抗体夹心法来检测被检材料中的心肌肌钙蛋白I。检测时,样品中所有的cTnI先和金标记抗心肌肌钙蛋白I的重组抗体结合,由于毛细管作用,反应复合物沿硝酸纤维素膜140向前泳动,若样品中有cTnI,到达检测线160时,遇到包被在硝酸纤维素膜140上的抗心肌肌钙蛋白I的兔多抗,就会形成兔多抗-心肌肌钙蛋白I-金标记重组抗体复合物,从而富集在检测线160上,形成红色沉淀线;未结合cTnI的金标记重组抗体则通过检测线160,被羊抗鼠IgG抗体捕获,富集在质控线170上,形成红色沉淀线。当检测线160与质控线170上同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有cTnI,反应复合物到达检测线160时,遇到捕获多抗就不会形成兔多抗-cTnI-金标记重组抗体复合物,反应复合物通过检测线160,仅富集在质控线170上形成红色沉淀线,此时判为阴性结果。
此外,在其他实施方式中,该检测试剂盒的结构不限于上文描述。上述重组抗体除应用在上述胶体金标记的单抗检测试剂盒外,还可以用于其他心肌肌钙蛋白I检测试剂盒或设备中。本领域技术人员可以理解,将本实施方式的重组抗体直接或间接结合其他信号基团(如磁性微球、辣根过氧化酶等),或将本实施方式的重组抗体作为包被抗体(例如ELISA),则可用于其他形式的心肌肌钙蛋白I检测试剂或设备。
上述重组抗体与鼠源性抗体相比,既保留了亲本抗体的识别抗原的特异性和亲和力,而且避免了与人血清中的抗鼠抗体发生非特异性反应,因此,从临床诊断应用方面来看,上述重组抗体比鼠源性抗体更具有应用价值。
以下为具体实施例部分:
本实施例中Freestyle CHO-S细胞、转染试剂FreeStyleTMMAX Reagent及细胞培养基等均购自Life Technologies公司。Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。TrizolRNA提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。限制性内切酶购自NEB公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成。人重组心肌肌钙蛋白I抗原为深圳市菲鹏生物股份有限公司生产,货号AG-CTNI-HP0005。
1、引物设计与合成
扩增VL基因上游引物:
mkF1:5’>ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT<3’(SEQ ID NO.13);
mkF2:5’>ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG<3’(SEQ ID NO.14);
mkF3:5’>ATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA<3’(SEQ ID NO.15);
mkF4:5’>ATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT<3’(SEQ ID NO.16);
mkF5:5’>ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG<3’(SEQ ID NO.5)。
扩增VL基因下游引物:
mkR:5’>GGATACAGTTGGTGCAGCATCAGCCCGTTT<3’(SEQ IDNO.6)。
扩增VH基因上游引物:
mHF1:5’>SAGGTGMAGCTKCASSARTCWGG<3’(SEQ ID NO.17);
mHF2:5’>ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCT<3’(SEQ ID NO.9);
mHF3:5’>ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT<3’(SEQ ID NO.18);
mHF4:5’>ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT<3’(SEQ ID NO.19)。
扩增VH基因的下游引物:
mHR:5’>TGGGGSTGTYGTTTTGGCTGMRGAGACRGTGA<3’(SEQ IDNO.10)。
2、抗体可变区基因克隆及测序
从杂交瘤细胞cTnI-C4中提取中RNA,用反转录试剂盒进行RT-PCR,扩增产物70℃酶失活后作为模板,以上述合成的引物进行PCR,VL基因扩增5管,VH基因扩增4管,其中VL的mKF5/mKR引物对扩增出420bp左右的目的条带,VH的mHF2/mHR引物对扩增出420bp左右的目的条带,如图4所示。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收,产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中,转化到DH5α感受态细胞中,长出菌落后分别取VH及VL基因克隆各2个克隆送Invitrogen公司进行测序。
3、cTnI-C4抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析,并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的,其中mKF5/mKR扩增出的420bp的VL基因片段中,VL基因序列为339bp,属于VkII基因家族,其前方有57bp的前导肽序列;mHF2/mHR引物对扩增出的423bp的VH基因片段中,VH基因序列为348bp,属于VH1基因家族,其前方有57bp的前导肽序列。
4、重组抗体表达质粒的构建
pFP-IgCK和pFP-IgCH载体为构建的重组抗体真核表达载体,前者已经***人IgG k链的恒定区基因,并预留XbaI和PmlI酶切位点;后者已***人IgG1重链恒定区基因,并预留NheI和HindIII酶切位点,质粒图谱如图5所示。
根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果,设计cTnI-C4抗体的VL和VH基因特异性引物,两端带有酶切位点和保护碱基,引物如下:
C4-VHF:5’>GGGGCTAGCATGGAATGGAGCTGTGTCATC<3’(SEQ IDNO.7);
C4-VHR:5’>CCCAAGCTTGCTGCAGAGACAGTGACTGAGG<3’(SEQ IDNO.8);
C4-VKF:5’>CTAGTCTAGAATGAAGTTGCCTGTTAGG<3’(SEQ IDNO.11);
C4-VKR:5’>CCGTTTCAGCTCCAGCTTGG<3’(SEQ ID NO.12)。
下划线的部分为酶切位点,VH两端位点为NheI/HindIII,VL基因5’段为XbaI,3’段为PmlI,该酶为平端酶,所以引物上可以不设酶切位点,Prime StarDNA聚合酶扩增的片段为平端。
经过PCR扩增出的396bp的VL基因片段和405bp的VH基因片段,如图6所示。VL基因用XbaI酶切,pFP-IgCK用XbaI/PmlI双酶切,VH基因和pFP-IgCH都用NheI/HindIII双酶切,将片段和载体纯化回收后VL基因连接到pFP-IgCK载体中,VH基因连接到pFP-IgCH载体中,分别得到重链和轻链的重组表达质粒。
5、重组抗体表达质粒转染CHO细胞,产物检测
转染前一天接种5×105/mL细胞于6孔培养板中,用含有8mM谷氨酰胺的Freestyle CHO Expression Medium,与37℃,8%CO2的培养箱中150rpm圆周振荡培养16—22h,转染时细胞密度在1×106/mL,转染3mL细胞需要质粒3.75μg(重链和轻链表达质粒各1.875μg),转染试剂FreeStyleTMMAX Reagent需要3.75μL,按照Life Technologies推荐的转染方法进行转染,转染72h后可以取样检测表达的重组抗体。
6、真核表达的重组抗体检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释人重组心肌肌钙蛋白I抗原(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产,货号AG-CTNI-HP0005),使其终浓度为8μg/mL。加入96孔聚苯乙烯板,每孔0.1mL,37℃2小时或4℃过夜。次日,用含10%小牛血清(NBS)的0.02M pH7.2PB,0.15mL/孔,37℃封闭2小时,用于检测。转染后第六天,取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中,37℃30分钟,水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的鼠抗人IgG-18#(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产),37℃30分钟同上洗后,每孔加入100μL含0.1%(M/V)邻苯二胺,0.1%(V/V)双氧水,pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液,37℃15分钟,加入稀硫酸溶液,每孔50μL,测450nm吸收值。空载体pFP-IgCk和pFP-IgCH共转染的细胞上清作为阴性对照,以测定值与对照值得比≧2.0判定为阳性。结果如表1:
表1
结果显示成功表达出有活性的重组抗体。
7、重组抗体纯化
用同样的方法放大表达500mL,表达六天后细胞培养液12000rpm离心20min,上清转移到干净的瓶中,用proteinG亲和层析柱进行亲和纯化,纯化的穿透峰和吸收峰如图7所示。纯化后得到15mg重组cTnI-C4抗体,取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE,4μg鼠源cTnI-C4抗体作为对照,电泳图如图8所示。在还原性SDS-PAGE后显示两条带,1条Mr为50KD(重链),另一条Mr为28KD(轻链)。
8、重组cTnI-C4抗体用于心肌肌钙蛋白I胶体金检测试剂盒
该检测试剂盒包括检测试纸及样品稀释液。其中,样品稀释液为8%NaCl溶液。配制方法:80gNaCl,加蒸馏水定容至1000mL。
该检测试纸通过如下步骤制作:
A.硝酸纤维素膜的制备
包被缓冲液的配制:含6%甲醇、0.01M pH7.2PBS缓冲液为包被缓冲液,0.22μm膜滤过,置4℃备用,有效期一周。1000mL6%甲醇的0.01M pH7.2PBS缓冲液配方:NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g、甲醇60mL,双蒸去离子水定容至1000mL。
硝酸纤维素膜的制备:用包被缓冲液将抗心肌肌钙蛋白I兔多克隆抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产,货号PAB-CTNI-AP0002)稀释到1~5mg/mL,调整机器,划线为T线,即为检测线,T线靠近金标垫端,距金标垫端约5mm;用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体(深圳市菲鹏生物股份有限公司生产,货号BA-PAB-MU0001)稀释到1~5mg/mL,调整机器,划线为C线,即为控制线,C线靠近吸收垫,距吸收垫约3mm。两线距离5~8mm,均匀。37℃烘干,封装备用。
B.胶体金、金标记单克隆抗体的制备
(1)溶液的配制
①氯金酸的配制:用双蒸去离子水溶解氯金酸,配成1%溶液,置4℃备用,有效期四个月。1000mL1%氯金酸溶液配方:10g氯金酸:双蒸去离子水定容至1000mL。
②柠檬酸三钠的配制:用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠,配成1%溶液,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期容至1000mL。
③0.1M碳酸钾的配制:用双蒸去离子水配制,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期四个月。1000mL0.1M碳酸钾溶液配方:13.8g碳酸钾;双蒸去离子水定容至1000mL。
④2%PEG-20000的配制:用双蒸去离子水配制,0.22μm膜滤过,置4℃备用,有效期四个月。1000mL2%PEG-20000溶液配方:20g PEG-20000;双蒸去离子水定容至1000mL。
⑤标记洗涤保存液的配制:2%牛血清白蛋白(BSA),0.05%叠氮钠(NaN3),0.01M pH7.2PBS溶液,0.22μ膜滤过,置4℃备用,有效期四个月。1000mL标记洗涤保存液配方:20g BSA,0.5g NaN3、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)胶体金的制备:
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,置电炉煮沸,按每100mL0.01%氯金酸加入2mL1%柠檬酸三钠,继续煮沸,直到液体呈亮红色即停止加热,冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物,有效期一周。
(3)胶体金标记单克隆抗体的制备:
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2,按8~10μg抗体/mL胶体金加入实施例1中制备得到的抗心肌肌钙蛋白I单克隆抗体,磁力搅拌器混匀30min,搅拌下加入BSA至终浓度为1%静置1小时。13000rpm、4℃离心30min,弃上清,沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次,用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬,置4℃备用,有效期一周。
C.金标垫的制备
(1)封闭液的配制:
2%BSA,0.1%TritonX-100、0.05%NaN3,0.01M pH7.2PBS溶液,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期四个月。1000mL封闭液配方:20g BSA,0.5g NaN3、1mL TritonX-100、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)金标垫的制备:
将金标垫浸泡于封闭液中30min后,于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上,每毫升溶液铺20平方厘米,冷冻干燥,封装,置4℃备用。
D.试纸条样品垫的制备
(1)封闭液的配制:
2%BSA,0.1%TrtionX-100、0.05%NaN3,0.01M pH7.2PBS溶液,0.22μm膜滤过,置4度备用,有效期四个月。1000mL封闭液配方:20g BSA,0.5g NaN3、1mL TrtionX-100、0.01M pH7.2PBS溶液定容至1000mL。
(2)样品垫的制备:
将样品垫浸泡于封闭液中30min后,于37℃烘干,封装,置4℃备用。
E.检测试纸的组装
将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上,切成3mm宽的小条。每十小条一包,加入干燥剂,真空封装,得到所述检测试纸。
以罗氏心肌肌钙蛋白I诊断试剂盒(Troponin I STAT)检出的阳性样本和阴性样本作为本试剂盒的检测样本,其中205例心肌肌钙蛋白I检测阳性样本,800例检出阴性样本,以基于鼠源cTnI-C4抗体的检测试剂盒作为对照,检测结果见表2。结果表明,本试剂盒检出阳性标本201份,相对灵敏度为98.05%,与对照的鼠源cTnI-C4抗体检测结果一致;800份阴性样本检出788份,其中12份为假阳,相对特异性为98.5%,而鼠源cTnI-C4抗体检出771份,其中29份为假阳,相对特异性为96.38%,所以重组cTnI-C4抗体应用于心肌肌钙蛋白I的诊断既保持了亲本鼠抗体的亲和力,同时降低了假阳性率,提高了诊断的特异性,优于基于鼠源抗体的心肌肌钙蛋白I诊断试剂盒。
表2基于鼠源抗体和重组抗体的心肌肌钙蛋白I检测试剂盒检测结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。