CN103691002A - 细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料及其制备方法。借助其内部孔隙的毛细管力作用并利用超声辅助胶原分子扩散法，以细菌纤维素干膜、胶原、原花青素、CaCl2和模拟体液为原料，细菌纤维素干膜、胶原、原花青素、CaCl2的质量比为10～200：1～50：4～6：6～10。使胶原呈不规则形态均匀分布在细菌纤维素的网络结构中，并将此复合物采用仿生矿化方法制备细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。本发明提供的复合材料具有优异的力学性能和独特的三维纳米网络结构，在结构和成分上与人体骨骼组织更为相似，有望满足骨组织工程支架材料的应用要求。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料及其制备方法。
背景技术
生物材料作为当今时代四大新材料之一，其发展与人类的健康息息相关，因而受到了越来越多的关注与研究。组织工程支架作为生物材料的一种俨然已成为科研与临床应用的一大热点。目前，用于组织工程支架研究与应用的材料主要包括胶原、壳聚糖、聚乳酸以及海藻酸盐等。与这些生物材料相比，细菌纤维素具有许多独特的性质，如天然的超精细三维网络结构，优异的力学性能，超高的持水能力，良好的生物相容性等等，因而已被广泛应用于伤口敷料、人工皮肤、人工血管，人工角膜等方面。
在软骨组织工程支架方面，由于细菌纤维素具有与软骨组织接近的力学强度以及良好的细胞粘附性，以细菌纤维素为基体的软骨组织工程支架发展迅速。例如，CN101947335A“细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料及其制备方法”报道了一种细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料，并且该复合材料具有良好的生物相容性以及力学性能，然而由于人体骨骼主要由胶原与羟基磷灰石组成，明胶虽然是胶原的降解产物，其氨基组成与胶原类似，但是终究明胶是小分子，无法真正表现出胶原的生物特性，如果应用于临床仍然可能造成生物排异反应。在另外一方面，鉴于人体骨骼的组成特点，许多学者对于胶原/羟基磷灰石复合材料也进行了研究，并发现该复合材料不仅具有与天然骨类似的结构，而且其生物活性良好，但是普遍存在力学性能较差的问题，限制了材料的进一步应用。基于以上两方面研究的缺陷，考虑到细菌纤维素良好的力学性能以及胶原/羟基磷灰石复合材料与人体骨骼类似的成分特点，如果通过某种方法能够将这两者进行组合制备出一种新型的细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料，它将不仅可以解决传统胶原/羟基磷灰石复合材料力学性能较差的问题，而且相对于细菌纤维素/明胶/羟基磷灰石复合材料它将更好地模拟人体的骨骼组成特点，具有更加重要的临床应用价值。而为了使合成出的这种新型的细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料结构成分均一，其前提条件就是先制备出结构成分均一的细菌纤维素/胶原复合材料。对此，CN102600507A“一种细胞培养支架材料及其制备方法中”报道了一种通过浸渍制备细菌纤维素/胶原复合材料方法，但是由于胶原属于生物大分子，很难进入细菌纤维素的纳米空隙，因此通过该方法得到的细菌纤维素/胶原复合材料中胶原分布很不均匀，只存在于细菌纤维素表面。
鉴于以上背景，本发明首次采用经干燥后的多孔的细菌纤维素薄膜作为基体，借助其内部孔隙的毛细管力作用并利用超声辅助分子扩散法，促使胶原能够充分进入细菌纤维素薄膜的纳米空隙，从而得到胶原成分分布均匀的细菌纤维素/胶原复合材料，并进一步将该材料浸渍于模拟体液中通过仿生矿化处理最终得到了细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。该材料成分均一，不仅具有与天然骨类似的胶原/羟基磷灰石的复合纳米结构，而且解决了传统胶原/羟基磷灰石复合材料力学性能较低的难题，在骨修复组织工程支架领域具有很高的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料及其制备方法。本发明采用经干燥后的多孔的细菌纤维素薄膜作为基体，借助其内部孔隙的毛细管力作用并利用超声辅助分子扩散法促使胶原均匀分布于细菌纤维素纤维薄膜的网络结构中，接着以原花青素为交联剂在超声振荡的条件下对胶原进行交联复合，并将复合后的材料通过仿生矿化处理制备出细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。本发明复合材料不仅具有独特的仿生三维纳米网络结构与良好的力学性能，而且由于胶原与羟基磷灰石的引入，使得材料更加符合人体骨骼的真实结构与成分。本发明复合材料具有良好的生物相容性，有利于细胞的粘附、生长和繁殖，有望满足骨组织工程支架材料的应用要求。本发明制备工艺简单，未使用任何有毒药品，成本低廉。
本发明提供的一种细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料，借助细菌纤维素内部孔隙的毛细管力作用并利用超声辅助胶原分子扩散法，以细菌纤维素干膜、胶原、原花青素、CaCl2与模拟体液为原料制成，细菌纤维素干膜、胶原、原花青素、CaCl2的质量比为10～200：1～50：4～6：6～10。
本发明细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将细菌纤维素膜经过冷冻干燥后制成细菌纤维素干膜；
步骤二、将胶原加入到浓度为0.1～0.5M的乙酸溶液中，配置成胶原浓度为1～50g/l的乙酸溶液；
步骤三、将制成的细菌纤维素干膜浸入到上述胶原浓度为1～50g/L的乙酸溶液中，再置于功率为100～500W的超声波清洗仪中超声8～12h；
步骤四、将步骤三得到的产物放入到浓度为4～6g/L的原花青素溶液中，并控制细菌纤维素干膜：胶原：原花青素的质量比为10～200：1～50：4～6；然后在100～500W的超声波清洗仪中超声1～5h，得到交联产物；
步骤五、将步骤四得到的交联产物放入0.05～0.2mol/L的CaCl2溶液，37℃恒温浸泡1～5天，并且每24h更换一次CaCl2溶液，得到经预钙化后的凝胶膜；
步骤六、将步骤五中得到的经预钙化后的凝胶膜放入预先配好的模拟体液中，37℃恒温浸泡1～10d，每24h更新一次模拟体液，得到细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。
本发明首先借助其内部孔隙的毛细管力作用并利用超声辅助分子扩散法，并用原花青素作为交联剂，将细菌纤维素干膜与胶原进行复合，使胶原均匀分布于细菌纤维素的纤维网络中，然后通过仿生矿化处理制备出细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。羟基磷灰石与胶原的引入不仅提高了胶原本身的力学性能，并且也改善了细菌纤维素本身的生物相容性，复合材料具有独特的三维纳米网络结构以及与人体骨骼类似的结构成分特点，这将有利于骨细胞的生长于繁殖，有望满足骨组织工程支架材料的应用要求。
本发明在常压下即可完成材料的制备，其工艺简单，并且本发明复合材料具有良好的生物相容性，相对于单一细菌纤维素材料更有利于骨细胞的粘附、生长与繁殖，对于骨组织工程支架材料的发展与应用具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中所制备的细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料的X射线衍射谱图；
图2为本发明实施例1中所制备的细菌纤维素/胶原的扫描电镜照片；
图3为本发明实施例1中所制备的细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料的扫描电镜照片。
具体实施方式
以下通过实施例讲述本发明的详细过程，提供实施例是为了理解的方便，绝不是限制本发明。
实施例1：
按照下述过程制备细菌纤维素：
首先，将12.5g葡萄糖、3.75g蛋白胨、5.00g酵母粉与5.00g磷酸氢二钠溶解于盛放有500ml的蒸馏水的烧杯中，用冰醋酸调节pH至4.5，将液体倒入锥形瓶中，在115℃高温下灭菌0.5h，作为液体培养基。
用接种环取一环木醋杆菌，接入到100ml的上述液体培养基中，用纱布扎紧瓶口，至于培养摇床中，在30℃下震荡30小时，得到木醋杆菌种子溶液。
将木醋杆菌种子溶液按照体积百分比不少于6％的接种量接种到灭菌后的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，30℃恒温静置培养5d，得到细菌纤维素凝胶膜。用质量百分比1％的氢氧化钠溶液清洗至乳白色，再用去离子水洗至中性，至此得到细菌纤维素膜。
按照下述步骤制备本发明细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料
首先将细菌纤维素膜进行冷冻干燥得到干态的细菌纤维素。
将0.2g胶原溶于100ml浓度为0.1M的乙酸溶液中。取2g细菌纤维素干膜放入该胶原的乙酸溶液中，接着置于功率为300W的超声波清洗仪中超声振荡8h，将细菌纤维素膜取出，放入100ml浓度为5g/L原花青素水溶液中，再置于200W的超声波清洗仪中超声振荡4h。反应结束后，将凝胶膜放入50ml浓度为0.1mol/L的CaCl2溶液中，37℃恒温浸泡3天，期间每天更换一次CaCl2溶液。将凝胶膜取出，置于50ml预先配好的模拟体液中，在37℃恒温浸泡5天，即得细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。
配制模拟体液：向去离子水中依次加入NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O与MgCl2·6H2O，配得模拟体液的例子浓度为142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.8mmol/LCa2+、1.5mmol/L Mg2+、6.3mmol/L HCO3-、148.5mmol/L Cl-、1.5mmol/L HPO4 2-、0.5mmol/LSO4 2-，最后用Tris将pH值调至7.4。
本发明首次成功制备了细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。有图1所示的X射线衍射可知，材料中分别出现了细菌纤维素、胶原以及羟基磷灰石的衍射峰，且无其他物质杂峰，证明制得成分纯净的细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。
本发明以细菌纤维素干膜为基体，利用超声辅助分子扩散法以原花青素作为交联剂，首先制得细菌纤维素/胶原复合材料，胶原呈不规则形态均匀分布于细菌纤维素的纳米网络结构中，见图2。接着再对细菌纤维素/胶原复合材料进行仿生矿化处理，在该复合材料的纳米纤维表面沉积羟基磷灰石，得到细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。由图3可知，羟基磷灰石均匀包裹在纤维表面，并且仍然保留了细菌纤维素良好的三维纳米网络结构。
实施例2：
将0.1g胶原溶于100ml浓度为0.25M的乙酸溶液中，将2g细菌纤维素干膜放入该胶原的乙酸溶液中，接着置于功率为500W的超声波清洗仪中超声振荡10h，取出细菌纤维素膜并放入100ml浓度为4g/L的原花青素水溶液中，超声振荡4h后，再将该凝胶膜置于50ml浓度为0.2mol/L的CaCl2溶液，浸泡2d，期间每天更换一次CaCl2溶液，得到经预钙化后的凝胶膜。接着再将该凝胶膜放入预先配好的模拟体液中恒温浸泡7d，得到细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。其他实验条件同实验实施例1。
尽管上面结合图对本发明进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨的情况下，还可以作出很多变形，这些均属于本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料，其特征在于，借助细菌纤维素内部孔隙的毛细管力作用并利用超声辅助胶原分子扩散法，以细菌纤维素干膜、胶原、原花青素、CaCl2与模拟体液为原料制成，细菌纤维素干膜、胶原、原花青素、CaCl2的质量比为10～200：1～50：4～6：6～10。
2.根据权利要求1中所述细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料，其特征在于所述的模拟体液各类无机盐成分离子浓度为：142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.8mmol/L Ca2+、1.5mmol/L Mg2+、6.3mmol/L HCO3-、148.5mmol/L Cl-、1.5mmol/L HPO4 2-、0.5mmol/LSO4 2-。
3.一种如权利要求1所述细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将细菌纤维素膜经过冷冻干燥后制成细菌纤维素干膜；
步骤二、将胶原加入到浓度为0.1～0.5M的乙酸溶液中，配置成胶原浓度为1～50g/l的乙酸溶液；
步骤三、将制成的细菌纤维素干膜浸入到上述胶原浓度为1～50g/L的乙酸溶液中，再置于功率为100～500W的超声波清洗仪中超声8～12h；
步骤四、将步骤三得到的产物放入到浓度为4～6g/L的原花青素溶液中，并控制细菌纤维素干膜：胶原：原花青素的质量比为10～200：1～50：4～6；然后在100～500W的超声波清洗仪中超声1～5h，得到交联产物；
步骤五、将步骤四得到的交联产物放入0.05～0.2mol/L的CaCl2溶液，37℃恒温浸泡1～5天，并且每24h更换一次CaCl2溶液，得到经预钙化后的凝胶膜；
步骤六、将步骤五中得到的经预钙化后的凝胶膜放入预先配好的模拟体液中，37℃恒温浸泡1～10d，每24h更新一次模拟体液，得到细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料。
4.根据权利要求3中所述细菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料的制备方法，其中，所述模拟体液各类无机盐成分离子浓度为：142.0mmol/L Na+、5.0mmol/L K+、3.8mmol/LCa2+、1.5mmol/L Mg2+、6.3mmol/L HCO3-、148.5mmol/L Cl-、1.5mmol/L HPO4 2-、0.5mmol/LSO4 2-。
5.一种菌纤维素/胶原/羟基磷灰石复合材料应用于骨组织工程支架材料。
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