CN103690452A - 预防并治疗口腔疾病的组合物及方法 - Google Patents

Abstract

一种用于口腔保健的植物提取物产品，其中植物提取物含有叶绿素，多酚类和三萜类化合物，简称为“aCPT”。该产品的剂型为任何用于口腔可接受的剂型，如牙膏或漱口水等，所述提取物是经有机溶剂如乙醇或甲醇提取制备而成。

Description

预防并治疗口腔疾病的组合物及方法

技术领域

本发明涉及口腔保健产品，尤其涉及如牙膏类的，含有植物提取物中活性成分的口腔保健产品。

发明背景

口腔健康对人的全身健康非常重要。许多报道已经显示，口腔健康不佳和全身疾病，如心脏病、糖尿病和一些呼吸道疾病存在密切相关。口腔疾病，包括蛀牙、口腔溃疡(mouth ulcer)、牙龈出血、牙龈炎、牙周炎、牙龈萎缩(gum receding)和骨质流失(boneloss)在内，被视为人类的第三大杀手。因此，开发有效预防并治疗这些口腔疾病的新方法具有重要意义。

龋齿(蛀牙)是仅次于感冒的最常见疾病之一，在中国，儿童患病率为80-90%，老年人患病率为90%以上。龋齿是一种口腔疾病，主要是因为变形链球菌(Streptococcus mutans)和乳酸杆菌(Lactobacillus)等致病细菌能够将残留在牙齿上的食物残渣中的碳水化合物代谢为弱酸，从而使牙齿脱钙，逐步分解坚硬的牙齿结构，导致龋齿。

牙龈是牙齿周围的软组织，它呈珊瑚粉色，质地紧密并会紧密支撑和密封每颗牙齿。牙龈出血，也称为出血牙龈，主要由在牙龈线上形成并累积硬化的牙菌斑（牙石)造成，而牙菌斑则使由于刷牙和用牙线清洁牙齿不当而导致。为预防和阻止牙龈出血，必须防止细菌生长，以及防止牙菌斑在牙齿和牙龈上的沉积。

牙骨质流失指的是牙齿和牙槽的骨质流失，这主要由牙龈疾病所致。牙龈萎缩是40岁以上成人常见的状况，通常由于使用牙刷或牙线不当或牙周疾病所致，由此导致牙菌斑形成，并在牙齿之间积聚，使牙齿和牙龈之间形成楔子(wedge)。虽然预防及治疗牙龈萎缩对维持口腔卫生至关重要，然而现在没有任何产品可以使牙龈组织变强韧或再生来修复已萎缩的牙龈。

发明摘要

本发明提供了一种针对口腔健康的活性天然植物提取物组分，其中包括叶绿素、多酚、和三萜类等化合物，这个所述活性天然化合物组合物在下文被称为aCPT。

这些aCPT可以从多种蔷薇科植物提取，其中包括金樱子(Fructuo rosae laevigakea)(EFRL)、积雪草(Centella asiatica)(ECA)、插田泡(高丽悬钩子,Rubus coreanus)的青果实(EUFRC)，蓝布正(Geumjaponicum)(GJ)和帝王悬钩子(Rubus imperialis)(ERI)。虽然从所述不同植物中提取的提取物含有许多互相类似的成分，但是从GJ提取的提取物含有较多的多酚类化合物。因此从上述植物得到的提取物可以被认为是本发明的互相替代物，并被涵盖在本发明中。

根据本发明，这些植物的提取物（aCPT）对口腔疾病有高效的治疗作用。进一步发现，可以将合适剂量的aCPT(0,05%-50%)加入到口腔卫生产品中，尤其是牙膏,该产品将对牙齿和口腔健康有益。aCPT也可以被加入到其他合适的剂型，包括，但并不限于，霜剂、软膏、凝胶剂、泡沫剂、粉剂、喷雾剂、饮料、混合饮料、糖果、锭剂、漱口水、漱口剂、凝胶剂、牙线、口香糖、等等。

根据本发明，可以用任一由C1-C6醇类和水组成的低级烷基醇水溶液从所述植物，包括EFRL、ECA、EUFRC、GJ以及ERI中萃取aCPT，最好是用乙醇/水溶剂或甲醇/水溶剂。根据本发明，我们发现用低级烷基醇水溶液提取的aCPT能有效预防和治疗口腔疾病，包括蛀牙，口腔溃疡，牙龈和口腔肿痛，口腔炎症，牙龈出血，牙龈炎，牙周炎，牙龈萎缩，口臭，牙骨质流失和牙齿松动，以及衰老引起的牙齿松动或脱落。

在本发明中，aCPT是指用本申请中描述的提取方法从任一植物中获取的提取物，只要该提取物中含有叶绿素、多酚、和三萜类，并且每一化合物的含量和从金樱子(Fructuo rosae laevigakea)(EFRL)、积雪草(Centella asiatica)(ECA)、插田泡(高丽悬钩子,Rubus coreanus)的青果实(EUFRC)，蓝布正(Geumjaponicum)(GJ)、和帝王悬钩子(Rubus imperialis)(ERI)中提取的相当。

附图简述

图1显示了aCPT处理对dKO小鼠的牙骨质流失的预防作用。

图2显示了分别用从EFRL、ECA、EUFRC、GJ、或ERI中提取的aCPT处理的小鼠的GI得分。

图3显示了aCPT对老龄小鼠因衰老引起的牙龈退行性退变的修复作用。

图4显示了aCPT对老龄动物牙釉质的厚度及维度(dimension)的保护作用。

图5显示了aCPT对细菌生长的抑制作用。a-e为推荐浓度的五种牙膏中常用的防腐剂。aCPT为分别含0.1%(i)、0.3%(ii)、或0.5%(iii)aCPT的培养基，显示aCPT对口腔细菌生长的剂量依赖性抑制作用。

图6显示了aCPT对人类口腔细菌生长的显著抑制作用以及和五种牙膏中常用的防腐剂的对比。

图7显示了对人使用aCPT后菌斑指数(PLI)的评价。

作为本发明的一部分，所附的权利要求书中对本发明中的各种新颖性作了重点说明。为了更好地了解本发明，它的操作优势，和它的特性，请参照附图和以下说明所阐述的优选实施方案。

发明的具体实施方案的详细描述

从植物中制备aCPT

根据本发明，提取物的制备方法通常包括选用C1-C6醇提取植物的步骤。这一步骤在常温下操作，可能重复3-6次，通常5次。提取前先把植物切成小块或制成粉末以提高提取效率。C1-C6醇包括甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，叔丁醇。通常，加入1-10倍于干燥植物重量的醇。下面详细描述了该方法的一个具体例子，所制备的活性提取物用于说明它的生物效应。

实施例1.从样本植物材料中制备活性提取物

EFRL和GJ在7月份收集自中国陕西省太白县和贵州省。两种植物用同一方法提取。

所述植物经洗涤、干燥(100kg)并切成小块。将这些植物的干燥块在50℃浸泡于95%乙醇(200L)达2小时，再加入95%乙醇和水以使乙醇浓度达到60%(1:10w/v)。在60℃提取所述植物达6小时。过滤所得提取物，并在50℃再用60%乙醇(1:10v/v)提取所述植物达6小时。合并上述所得提取物，过滤、并电喷雾干燥，制备出粉末，也就是活性提取物。分析表明，活性提取物含有20-30%叶绿素，50-80%的多酚，以及1-3%三萜化合物，在本发明中我们将其称为“aCTP”。用aCTP制备的牙膏，即aCTP-牙膏（CTP-T），用于特此公开的所有生物测试。

本发明公开的活性提取物也许可以用现有的技术和工艺被不同程度的进一步纯化，这一点应该是本领域的技术人员的共识。对于某些剂量，一些本领域的技术人员会倾向于进一步纯化，但对本发明的实施不是必须的。在本发明中，aCTP可以是用低级烷基醇制备的粗提物（如实施例1所示），也可以经过进一步的纯化，只要其拥有本发明所述的生物效应。

经NMR分析，用实施例1方法从EFRL或GJ中提取的aCTP中含有叶绿素a,叶绿素b,***黄鞣宁，鞣花酸，水杨梅鞣质A，B，羟基积雪草酸，蛇含鞣质，积雪草酸，2-羟基齐墩果酸，苦莓苷F1，Kaji-ichigoside F1,蔷薇酸,熊果酸,积雪草苷,和委陵菜酸的28-β-D-葡糖苷。如果在某一特定情况下，需要修改制备活性提取物的方法，以上信息将有助于设计修改提取和纯化步骤。

药物组合物的配制和剂量

本领域技术人员应该认识到，药物组合物可包含药物可接受的载体，这一部分由所施用的特定组合物及用于施用该组合物的特定方法来决定。因此，施用所述化合物组合物的药物组合物有多种合适的配制剂(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA18thed.，1990)。

根据本发明，aCPT可以制成一系列合适的剂型，例如，霜剂、软膏、凝胶剂、泡沫剂、粉剂、液体饮料，喷雾剂、糖果、锭剂、漱口水、牙膏，漱口剂、口香糖、口腔护理胶条和牙线。制备以上各种剂型的方法是已知的，不属于本发明范畴。这些剂型可以用于治疗口腔疾病，保持口腔健康或者是预防口腔疾病，根据不同的应用，各种剂型中含有的aCPT浓度也会不同（从0.1%-50%或更高）。例如，针对不同口腔疾病的状况，比如蛀牙，牙菌斑，牙龈出血，牙龈炎，牙周炎，牙齿松动，口腔溃疡，衰老引起的牙齿脱落，牙龈萎缩，以及口腔创伤等，我们测试aCPT对这些口腔疾病的治疗或预防作用。对于一般健康人群，我们一般用含0.1-1%aCPT的牙膏，用于预防蛀牙，牙菌斑和口臭。由于aCPT自身具有的抗菌作用，牙膏中无需加入防腐剂。而含1-3%aCPT的牙膏适用于有轻度到中度口腔问题的人群，常用可以预防常见的口腔疾病。含4-30%aCPT的牙膏适用于有中度到严重口腔问题的人群，常用可以预防和改善多数口腔疾病。

本申请中的实施例采用了以下的样板配方牙膏：

GJ提取物(aCPT)	3.0%
		维生素B2	0.1%
山梨糖醇	50.0%
		二氧化硅	30.0%
水	13.7%
		十二烷基硫酸钠	2.2%
薄荷脑，甜橙油，柠檬油	1.0%

aCPT的生物活性

实施例2.aCPT对老年阿尔茨海默小鼠的实验性牙周炎和牙骨吸收的治疗效果(条件性PS1/PS2双敲除阿尔茨海默小鼠，dKO)

早老素1(PS1)和早老素2(PS2)是跨膜蛋白，它们是γ-分泌酶的完整组成部分，是负责淀粉样前体蛋白(APP)膜内切割和Notch(刻痕)受体的复合体(De Strooper等，1998，1999)。有报道显示PS1或PS2的突变可能与阿尔茨海默病(AD)发病早有关(Haass，1997；Price&Sisodia，1998)。更多研究表明，前脑中条件性敲除了PS1和PS2基因的小鼠(dKO小鼠)早在2月龄就显示出AD样轻度神经退行性表型。在6月龄dKO小鼠可观察到严重的记忆损伤。有趣的是，近来的研究发现dKO脑的炎症可以扩散到周围器官和组织，包括口腔组织，如牙周组织异常、口腔炎症和牙骨质吸收(Han等，2011)。因此，dKO AD小鼠模型也可以用作口腔疾病的动物模型、特别是老年相关性口腔疾病的模型。

将重20-50克的16只dKO小鼠(6月龄)分为测试和对照组。两组小鼠均可自由获取水和大鼠颗粒鼠粮(chow)达2个月，受试组的大鼠颗粒食物含从GJ获得的0.5%aCPT，而对照组的大鼠颗粒食物不含aCPT。实验进行到在第61日，处死动物。取其下颚，脱钙作组织学处理。用H&E染色、组织切片并评估组织形态测量学参数。

结果发现未处理的对照组小鼠的牙骨质流失比aCPT处理组明显增加(表1)。未处理的dKO小鼠的牙周组织有明显炎性反应，特征为炎性细胞浸润、水肿和形态学异常。然而，aCPT处理组的小鼠表现出明显减轻的炎性反应、炎性细胞浸润较轻、牙龈及牙骨质等的形态学特征较为正常。更令人印象深刻的是，测试组一半以上的实验动物的磨牙牙根明显较大，并且牙根与牙槽骨的接触面积明显较大，甚至超过同龄的对照小鼠(野生型,无dKO)(图1)。

表1.aCPT处理预防dKO小鼠的牙骨质流失

Ctrl代表野生型无dko的小鼠；dko代表载体处理的对照组小鼠，其前脑中已条件性敲除了PS1和PS2基因；aCPT代表aCPT处理的dko小鼠。

对比之下，未处理的对照组dKO实验小鼠中无一显示在aCPT处理的dKO组中可见的上述结果。与同龄的aCPT处理的dKO小鼠和野生型对照小鼠(无dKO)相比，该组的牙周炎症及牙槽嵴的吸收显著，并且磨牙牙根与牙槽骨的接触面积较小。结论为，dKO小鼠咀嚼含aCPT食物可显著预防其磨牙骨质流失，并有助于保持磨牙与牙槽骨的较大的接触面积。而且，实验性牙周炎的炎症过程也通过咀嚼含aCPT食物而得到显著减轻。另外，发现aCPT处理的dKO小鼠的磨牙牙根明显较大，甚至超过同龄的野生型对照小鼠。

实施例3.aCPT对SAM小鼠的实验性牙周炎和老年性口腔状况的治疗效果

将衰老加速的小鼠(SAM)种系建立为衰老加速和与年龄相关性疾病的小鼠模型(Takeda等，1981)。除了SAMP10最具特征的年龄相关性改变如脑萎缩外，这些小鼠也可用于做衰老引起的牙科病症的动物模型(Sashima等，1987；Chen等，1989)。研究认为，人类牙周炎和牙槽骨质流失是慢性退行性变疾病，会随年龄增长而变得更加普遍和严重(Anderson，1982)。在这项研究中，使用平均生存时间为333天速衰小鼠(SAMP10)作为研究模型(Takeda等，1991)，我们测试了aCPT对于老年衰老相关的口腔病症的治疗效果。

方法.实验动物（SAMP10小鼠，n=48）在常规条件下饲养，动物可任意采食鼠粮和自由饮水。当小鼠6月龄时，给测试组小鼠(每组，n=8)分别喂食各含1%GJ、1%EFRL、1%ECA、1%EUFRC或1%ERI（即从五种植物中分别提取的aCPT）的常用小鼠鼠粮达3个月。给未处理的对照组小鼠(n=8)喂食无任何上述提取物的常用鼠粮。处理3月后，将给五个被试组小鼠喂食的含上述提取物的小鼠鼠粮分别替换为无任何上述提取物的常用鼠粮。当小鼠为10月龄时，评价所有组小鼠的牙龈指数(GI)(该评估方法基于探测牙龈组织来肉眼观察牙龈，从而评估颜色、紧实度(firmness)和出血)，然后处死实验小鼠。评价平均牙槽骨质流失(mm SD)，具体方法是通过将沿每颗磨牙牙根的轴的牙尖端和牙槽骨之间的距离总和，从对侧值中减去。并对所有组的动物进行形态测量学和组织学分析。

结果：以0-3等级***来测量牙龈炎记分(GI)。即0=无炎症，1=轻度炎症-牙龈颜色轻微改变及质地几乎无改变；2=中度炎症-探测发现牙龈有中度的发亮(glazing)、发红、水肿、肥大和出血倾向；3=重度炎症-牙龈明显的发红、肥大和自发性出血倾向。GI记分=GI记分总和除以记分的位点数(围绕牙齿的牙龈龈线)。

发现GJ、EFRL、ECA、EUFRC或ERI各处理组的GI记分(0.601-0.732±0.301)显著低于未处理的对照动物(1.232±0.438)(图2)(p<0.01)。所有提取物处理组比未处理的对照组，都有显著预防牙槽骨质流失的作用，并且牙槽骨和牙骨质都保存良好(p<0.05)。组织学检查显示，在未处理的对照动物观察到明显的炎性反应，包括牙周组织的水肿和炎性细胞浸润，以及牙槽骨吸收(图3)。而且，未处理的对照动物牙周组织的紧实度和总体积显著下降。但在提取物处理的动物中，炎性反应显著下降，仅观察到较轻的水肿及炎性细胞浸润。而且，在整个牙周组织中观察到较多的(9.3-11.2%)毛细血管(p<0.05)(图3)，牙周组织体积和紧实度显著增加，显微镜下可见较多的成纤维细胞和沉积的胶原组织。

总之，这些观察结果提示所有五种提取物，特别是GJ，不仅会抑制老龄小鼠牙周组织的炎性反应，包括减轻水肿和炎性细胞浸润，以及牙槽骨吸收，而且会促进牙龈和牙周组织的生长，从而显著改善牙龈炎、牙周炎和牙龈萎缩。总之，包括GJ、EFRL、ECA、EUFRC和ERI在内的提取物均可不同程度地降低老龄相关性牙周炎性反应、牙龈炎、牙龈萎缩和牙槽骨吸收的进展。

实施例4.增强牙龈的紧实度及改善牙龈萎缩

牙冠指牙槽骨以上的牙齿上部。牙根指牙槽骨中的牙齿下部。理想的冠根比介于1:1至1:2之间，是牙齿及其牙龈预后的关键指数(Czochrowska等，2002)。为评估aCPT对牙龈的修复的作用，我们测量了对照组(SAMP10，n=8，6月龄)小鼠和处理组SAMP10小鼠(n=8，6月龄)的牙齿的冠根比。首先给对照组小鼠喂食常用的小鼠咀嚼鼠粮，和给测试组小鼠喂食含1%aCPT或GJ的咀嚼鼠粮。喂养3个月后，发现对照组小鼠磨牙的冠根比较差，磨牙牙根暴露部分较多。与此相比，1%aCPT或GJ处理组小鼠的磨牙冠根比呈正常，磨牙根暴露部分显著较少。

人类的牙釉质厚度自大约50岁开始变薄。在本实验SAMP10小鼠研究中，也发现，9月龄的载体处理对照组SAMP10小鼠牙釉质的厚度也显著变薄，并且牙齿表面的釉质维度连续性较差(图4)。与此相比，aCPT或GJ处理组小鼠的牙釉质厚度和维度都保持良好(图4)，表明aCPT或GJ处理可以预防由老龄或年龄进展所致的牙釉质退行性改变(P<.001)。

牙齿松动.如果一旦发现牙齿松动，这就提示可能存在严重的牙龈疾病或老年性(advanced)牙龈疾病或退行性牙龈病变。一般来讲一旦发现牙齿松动，松动的牙齿可能就保留不住了。可能的治疗方案恐怕就是拔掉松动的牙齿，重新种牙。

牙龈疾病通常由存在于口腔中的多种细菌造成。有些患者口腔中可能有更多种与侵袭性牙龈疾病有关的细菌。这些细菌容易积累在牙龈与牙齿的接合处。正常的健康牙龈有围绕牙齿的沟或小沟(sulcus)(1-3毫米深)。当细菌感染牙龈时，牙龈可与牙齿脱离。当牙龈由于牙龈疾病而与牙齿脱离时，这个小沟会形成一个“袋"，其深度超过3毫米。然后引发牙龈疾病的细菌就会扩散到支撑牙齿的下层骨，随后会导致牙齿松动。如果牙龈疾病在早期阶段得不到适当处理，患者牙齿就可能脱落。

我们测试了含aCPT牙膏(CPT-T)对人类口腔疾病的治疗作用，受试者为12名，其中九名有轻度牙龈萎缩(40-60岁)，两名有牙齿松动(52-70岁)，一名有重度牙龈萎缩和牙齿松动(46岁)，他们接受每日两次使用CPT-T(3%)。使用CPT-T之前的测试发现，所有受试者都有较大的牙间隙，这表明存在整体牙体龈萎缩。除了牙间隙变宽外，两名受试者的下前部(左)和上前部(右)的牙齿有牙齿松动(1-3个牙齿松动)，松动的牙齿呈深棕色达2-3年以上。在所有牙齿均有重度牙齿松动的受试者，其所有牙齿的咬合能力严重下降，并且牙齿颜色都呈深棕色。经进一步检查发现，其半数以上(前牙、上牙、下牙和后牙)的牙根都因牙龈萎缩而暴露，并且其牙龈在探测或刷牙时非常容易出血，伴有口臭，表明其患有重度的牙龈炎和牙龈萎缩。

这些受试者被告知每日早晚各用CPT-T(3%，97克牙膏含3克从GJ提取的aCPT，牙膏其他79%的成分主要含有維生素B2、山梨醇、二氧化硅、纯净水、月桂醇硫酸酯钠、薄荷脑、甜橙油、柠檬油、羧甲基纤维素)刷牙一次，每次至少3分钟。结果显示，用CPT-T2-3周后，所有受试者均报告发现，应用CPT-T后，硬块食物或食物纤维楔入牙齿间的发生率显著下降，提示牙间隙减小，这可能是由于恢复强韧的牙龈可以支撑牙齿处于较紧密的位置上。经测试发现，所有受试者的牙间隙都比应用CPT-T前缩小了约1/3。原来有1-3颗牙齿松动的两名受试者的松动牙齿的活动度下降，其病变牙齿的深棕色也显著变浅。大多数受试者的牙龈从发红变成了粉色，原有触痛得到显著改善。口臭也显著减轻，可能由于口腔细菌感染和炎症得到明显控制的缘故。

应用CPT-T六周后发现，所有受试者都保持了已缩小的牙间隙。一般来说，使用CPT-T后，牙齿显得更白、更坚固。经检查发现，原牙齿松动的两名受试者的牙齿变得完全正常，而之前这些松动牙齿由于营养不良而呈现的深棕色也转为正常白色，接近其他正常牙齿的色泽。一些受试者的牙龈从发红变成了正常的珊瑚粉色，压痛和感染以及炎症都显著减轻或不再存在。由于口腔的细菌感染、炎症和口腔疾病所致的口臭也显著改善或完全消失。在应用CPT-T六周后，重度牙龈萎缩和牙齿松动的受试者(46岁)也有了显著改善，其所有松动牙齿的活动性都下降，而且其牙龈的发红、压痛和牙龈出血都显著减轻，其咀嚼能力亦恢复了。并且在使用CPT-T的一年里，没有失去任何牙齿。而用CPT-T之前，每年都会失掉牙齿。然而，她可能需要使用更长时间的CPT-T，来使其萎缩的牙龈和松动的牙齿得到进一步的恢复。所有上述结果都表明，使萎缩牙龈变强韧可更紧密地支撑活动牙齿，并为牙齿提供良好营养。更有趣的是，在使用CPT-T两个月后发现，这些牙龈萎缩的受试者中的一些，其先前暴露的牙根面积变小。另外，在试验中我们发现aCPT浓度越高的牙膏（例如9-25%的GJ牙膏）对口腔疾病的治疗效果越好。

在老年人群中一旦发现牙齿松动就提示老年性牙龈疾病的存在。牙齿松动在临床上无法恢复的，因此，牙齿松动将导致松动的牙齿脱落。因为CPT-T可以显著抑制病原微生物的生长，并促进组织修复，它可以去除牙龈疾病的直接致病微生物并增强受损牙龈的修复。结果是，CPT-T可以预防并治疗如上所述的牙龈疾病和牙龈萎缩，以及延缓衰老引起的牙齿脱落。

实施例5.CPT-T对牙龈出血的作用

将CPT-T(0.1%、0.5%或3%，每100克牙膏各含0.1、0.5或3克的aCPT)分别用于患有急性或慢性牙龈出血的受试者（每组9人，年龄为26-80岁)。结果发现用CPT-T(3%)刷牙2分钟，每日早晚各一次，所有9个受试者均停止牙龈出血。根据牙龈出血严重程度，停止牙龈出血所需天数为1-6天。2例中，用CPT-T刷牙1天后牙龈出血即消失。另外4例中，在CPT-T刷牙3-5天后牙龈出血停止。两周的刷牙时间足够长到可使剩下的3例在过去2-3年中曾患有反复性难治性牙龈出血的受试者停止牙龈出血。对比之下，对照组9例使用不含aCPT牙膏的受试者中，仅有一例在刷牙6天后停止牙龈出血。

牙间出血指数(IBI)的测量，是用出血的牙间隙数除以所研究的牙间隙数，得到最小值为0(无出血)，最大值为1(出血)的记分。出血点数除以记分的牙间点数。使用牙膏前，安慰剂对照组(n=9)和CPT-T组(n=9)的IBI分别为0.387±0.286和0.365±0.276。然而，使用牙膏2周后，安慰对照组和CPT-T组的IBI平均值分别为0.358±0.266和0.101±0.098。使用CPT-T组的IBI比对照组显著低。

实施例6.CPT-T对口腔溃疡的治疗效果

对曾患反复性口腔溃疡的6位受试者(4女2男，年龄介于48-82岁)进行测试，使用CPT-T(1%)刷牙至少3分钟，每日早晚各一次。所有六名受试者的口腔溃疡在1-7天的CPT-T治疗后都完全消失。治愈口腔溃疡需要的时间介于一天到一周。根据溃疡的严重程度及牙膏所含的aCPT浓度的不同，溃疡愈合的时间有所不同。例如，轻度或偶发性溃疡在应用CPT-T后的1-3天内愈合，然而，对反复性难治性口腔溃疡的愈合可能需要6-8天。一般情况下，牙膏所含aCPT的浓度越高，口腔溃疡愈合得越快。例如，一名曾患复发性难治性口腔溃疡两年多的女性，在应用CPT-T(3%)7天后愈合。对比之下，在对照组中，3名患偶发性口腔溃疡的受试者在用对照牙膏的第4、5和8天后愈合。然而，该组中其他3名患复发性口腔溃疡的受试者未显示任何溃疡改善。

实施例7.CPT-T对抗口腔细菌，从而有效预防蛀牙的作用

口腔由于存在营养物、细胞碎片和和细菌排放物，而成为多种细菌繁殖的有利培养基，所述细菌主要包括链球菌、乳酸杆菌、葡萄球菌、棒状杆菌和大量厌氧菌。龋齿主要由细菌如乳酸杆菌(Lactobacillusspp.)、变形链球菌、放线菌(Actinomyces spp.)的酸性代谢产物所引起。这些细菌通常生活在口腔中，靠碳水化合物为食。这些细菌在口腔里和牙齿上形成粘腻的生物膜包被层，在早上刷牙前会导致口臭。在这层粘腻的膜中包含以上提及的细菌，合称为细菌斑，覆盖在牙齿和牙龈上，通过无氧呼吸代谢它们的食物，如所吃食物中包含的糖，结果产生酸性细菌废物，使牙齿表面达到高酸度。所产生的酸攻击牙齿，超过一段时间后，这些酸就会破坏牙釉质并影响牙齿的矿物质含量，导致蛀牙。

aCPT抑制口腔细菌结合到牙齿表面。aCPT是天然存在的活性组分，可从几种蔷薇科的植物提取。口腔细菌通过糖结合蛋白而粘附到牙齿表面，而aCPT中包含的多酚类可以沉淀细菌的糖结合蛋白，因此aCPT可以抑制口腔细菌与牙齿结合，从而使粘附下降。结果显示，0.3%的aCPT就能降低变形链球菌与牙齿表面的粘附。

aCPT对细菌生长的抑制作用。本研究测试了aCPT对细菌生长的抑制作用。将在牙膏、洗发水、化妆品和身体护理产品(body product)中广泛应用的商业化防腐剂，比如0.2%苯甲酸、0.2%氯己定、0.4%对羟基苯甲酸酯、0.3%三氯生、0.15%山梨酸钾，用作阳性对照。

用牙科用牙签来收集取自牙间隙的口腔细菌样本，样本来自8名正常受试者(4男，4女)。口腔中的人类口腔唾液是由水、氨基酸类、蛋白质类、脂质、碳水化合物和一些无机物组成，因此它适于细菌生长。在牙齿和牙龈表面形成的细菌斑主要包含厌氧性螺旋体细菌和弧菌(逗号形细菌)、葡萄球菌、乳酸杆菌、链球菌(特别是变形链球菌)和龋齿放线菌(Actinomyces odontolyticus)。

本实验旨在探究aCPT对口腔细菌生长的抑制作用。将样品牙签分别无菌划线接种在甘露醇盐琼脂(MSA)平板上。在37℃培养接种的平板。

MSA平板分别只含下列防腐剂之一(0.2%氯己定、0.2%苯甲酸、0.4%对羟基苯甲酸酯、0.3%三氯生、0.15%山梨酸钾)，其浓度是根据国家监管机关的规定标准，用作阳性对照。不同浓度的aCPT分别加入细菌培养的不同测试孔，用以测定aCPT抑制口腔细菌生长的最大抑制稀释度(MID)。

所有这五种防腐剂都已公开了其预防菌斑和抑制细菌的作用。因此，本研究将这五种商业化广泛应用的防腐剂与不同浓度的aCPT进行比较，比较它们对在龋齿和牙龈炎的发生中起重要作用的口腔细菌生长的抑制作用。

将口腔细菌样本在80%CO2、15%N2和5%H2的环境下进行培养，使培养孔内的细菌密度达到介于0.5x109到1x109细胞/ml的密度。然后，将上述培养的细菌用于接种含规定标准浓度的五防腐剂或梯度浓度的aCPT的次级培养皿中。通过分别计数培养皿上的细菌菌落，来确定所述5种防腐剂和aCPT对于采自不同受试者获得的口腔细菌的生长抑制作用。

结果显示，在含有国立(State)推荐浓度的上述5种防腐剂的培养皿上，其全视野中到处可见细菌菌落(图5)。对比之下，虽然在aCPT浓度为0.1%时，培养皿中观察到的细菌菌落数与在防腐剂-处理的口腔细菌培养皿中观察所见的相近，然而，一旦aCPT的浓度达到0.3%时，细菌菌落少了约65%(图5)。当用0.5%的aCPT处理培养物时，只观察到不足10个细菌菌落(图5)。当aCPT浓度为1%或更高时,几乎无细菌菌落或只有不足5个细菌菌落。

然后我们测试了aCPT对采自有口腔炎症的患者的口腔细菌的生长抑制作用。患口腔炎症的受试者在晚上刷牙，并在转天早晨用含10%FBS的1640培养液漱口。将此漱口液(rinse)转移到24孔培养平板上，每孔含1ml的样本漱口液。将梯度浓度的上述5种防腐剂和aCPT分别以三个平行孔的方式加入不同的孔中，并在37℃温箱培养。在37℃培养18小时后，观察到aCPT(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.6%)对取样的口腔细菌的生长有剂量依赖性抑制作用。与此相比，尽管上述所选防腐剂(0.05-0.3%氯己定；0.05-0.3%苯甲酸；0.1-0.5%对羟基苯甲酸酯；0.05-0.4%三氯生和0.05-0.2%山梨酸钾)对口腔细菌生长有弱的剂量依赖性抑制作用，然而这些防腐剂对该口腔细菌生长抑制作用较弱，在国家规定的浓度下，仅仅达到15-35%的生长抑制作用(图6)。鲜明的对比是，尽管0.1%aCPT处理的细菌培养物对于培养物中的细菌生长只显示了约10%的抑制作用，但是其抑菌效果也与国家推荐浓度的所选防腐剂相当。然而，0.2-1.6%aCPT的抑制细菌生长作用分别为60%(0.2%的aCPT)、81%(0.4%的aCPT)、90%(0.8%的aCPT)以及96%(1.6%的aCPT)(图6)。此结果表明，aCPT对人类口腔细菌生长具有极强的抑制作用，其效果显著超过了其它被选的5种常用防腐剂。

公知防腐剂能引起多种副作用如皮肤刺激、致癌和影响神经***等，因此在2009年，国家设立新的标准只允许加入不超过0.3%的防腐剂。因此，还有待发现更有效抑菌，使用浓度更低的防腐剂。既然aCPT或GJ，或EFRL是从天然可食用植物中提取的，而且在较低浓度下(0.1-0.2%)与上述推荐浓度的常用防腐剂具有等效的抑菌活性，以比被试常用防腐剂的国家推荐浓度低1/2-1/3的剂量就达到同等的抗口腔细菌效果，所以它可以被视为更安全的绿色防腐剂。例如，当aCPT、GJ浓度增加到上述常用防腐剂的国家推荐浓度的2/3或同等浓度时，其口腔细菌生长抑制效果比国家推荐浓度的被试防腐剂高1.7-4或2.3-5.4倍(图6)。这些结果提示，aCPT对人类口腔细菌生长有明显更强的抑制作用，并且与其它5种常用防腐剂相比更为安全。更重要的是，这个提取物并没有改变这个可食性植物的天然组合，因此，含数百种不同天然化合物的浓度为0.1-1.6%的活性提取物仅仅等同于浓度低数百倍的每种化合物。而且，我们的毒性实验表明，给大鼠每日口服施用480-4800mg/kg体重的GJ，60天，比0.5-2%GJ牙膏的剂量高1,600,000-16,000,000或400,000-4,000,000倍，都不会对实验动物产生任何明显副作用。另外，提交专利申请前，我们还分别测试了含0.1-28%GJ的牙膏达2年以上，除了它对口腔疾病具有强力的多重治疗效果之外，未观察到任何不理想的或副作用。因此，aCPT牙膏不仅能替代不太有效的并易于产生可能副作用的合成防腐剂，而且提供了对多种口腔疾病的显著治疗效果，因为aCPT含有天然抗菌因子，抗炎因子，能促进老年牙龈和牙组织再生，组织修复因子能诱导干细胞或前体细胞分化成局部组织以修复损伤或萎缩的牙龈和口腔组织。

实施例8.预防牙菌斑的形成并清除牙菌斑

体外研究证明了aCPT的细菌生长抑制作用，这预期了它在牙表面上抗细菌斑形成的潜力。为测试这一点，募集16名人类受试者，在试验前除牙石并用橡胶轮给牙齿抛光，作为试验基线。在使用CPT-T之前、使用该牙膏起一周、一个月及三个月后，分别给所有受试者都进行牙龈及牙齿检查。每颗牙至少检查6个点。鉴于CPT-T去除牙上细菌斑并抑制菌斑形成的迅速作用，使用CPT-T一周后，立即评价CPT-T对去除菌斑和抗细菌斑形成的效用。

菌斑指数(PLI)评价为0-5的等级（0=无菌斑，1=牙齿上散在的菌斑斑块，2=薄而连续的的菌斑带（band)，3=最多占牙三分之一的菌斑带，4=最多覆盖牙三分之二的菌斑，5=覆盖牙三分之二或更多牙冠的菌斑）。菌斑记分=所有记分总和除以(牙)记分的位点数。

测试组的受试者(n=30,年龄为26-62岁)使用CPT-T(1-3%)刷牙，而对照组的受试者(n=30,年龄为24-58岁)使用相同但不含aCPT的牙膏刷牙，每日早晚各一次，每次至少3分钟。在应用被试牙膏前评价两组所有受试者的PLI，结果显示，PLI指数分别为约2.61±1.08(测试组)和2.59±1.19(对照组)(图7)。然而，随着应用CPT-T，测试组的PLI指数进行性下降(CPT-T用后第1周为1.61±0.82，第2周为1.03±0.65，第4周为0.51±0.31)(p<0.001)(图7)。与此相比，对照组的PLI指数无显著改变(应用对照牙膏后第1周为2.53±1.21，第2周为2.32±1.41，第4周为2.36±1.12)(图7)。更显著的是，在应用所述牙膏2周后，当两组受试者在早晨刷牙前接受检查时，测试组的牙齿表面保持光滑，无明显菌膜形成，PLI约为1.13±0.61。鲜明对照是，对照组受试者的牙齿表面覆盖了薄而粗糙的菌膜，PLI约为3.86±1.65(p<0.001)(图7)。此薄而粗糙的牙菌膜中包含了很多微生物，包括变形链球菌及多种其它细菌，它们发酵糖及其它碳水化合物来形成乳酸及其他代谢产物。这个不断产酸的过程重复循环可逐渐溶解牙表面和表面下的矿物质，从而使坚硬的牙骨质出现不可逆的结构损害，使牙表面釉质破坏，并进而破坏釉质下的牙骨，使被破坏的牙表面呈现不透明的白色或棕色斑点，进而导致龋齿。因此，CPT-T的细菌生长抑制作用，及因此对牙菌斑在牙表面形成的抑制作用，可强力保护牙齿，避免口臭、预防龋齿和口腔炎症。更有趣的是，在测试组四名受试者应用CPT-T达1-2月后，其牙齿咬合面(occlusalsurface)上原来由于牙齿釉质破坏，及牙骨表面矿物质的溶解(dissolution)而形成多处粗糙、不透明的白点，重新修复为光滑表面，其不透明颜色恢复为正常外观。这就提示在龋齿形成的早期，应用CPT-T可以实现受损釉质的再矿化(remineralisation)及早期蛀牙的修复。新修复的损害表面又硬又滑，而对照组其它三名受试者的蛀牙活动期损害则为白垩样、粗糙、多孔表面。

植物提取物的等同物

根据本发明，从金樱子(Fructuo rosae laevigakea)(EFRL)、积雪草(Centella asiatica)(ECA)、插田泡(高丽悬钩子,Rubus coreanus)的青果实(EUFRC)，蓝布正(Geum japonicum)(GJ)或帝王悬钩子(Rubus imperialis)(ERI)这五种植物的醇提取物含有相似的活性组分，在使用中可以认为是等同的。实施例3中可以显示这种等同性。用实施例1中描述的方法从这五种植物中（即EFRL，ECA，EUFRC，GJ和ERI）分别制备的提取物在修复牙龈萎缩，口腔创伤，牙龈溃疡，牙龈出血和口腔炎症方面有相似的效果。例证见图2。因此，在使用本发明的过程中，这五种植物各自的提取物被视为是等同的。

虽然本文已披露了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于那些本领域技术人员仍是显而易见的。因此，本文披露的多个方面和实施方案仅为举例目的，并不应限制如下权利要求所限定的真正范围或违背其精神。

Claims (12)

1.一种口腔保健产品，其中包含（1）存在于口腔可接受剂型中的有效剂量的aCPT和（2）产品说明文字表明该保健产品可用于改善口腔健康。

2.根据权利要求1所述的产品，其中所述口腔可接受的剂型选自下组：霜剂、软膏、凝胶剂、泡沫剂、粉剂、液体饮料、喷雾剂、糖果、锭剂、牙膏和口香糖。

3.根据权利要求1所述的产品，其中所述口腔可接受的剂型选自下组：漱口水、漱口剂、口腔护理胶条和牙线。

4.根据权利要求2所述的产品，其中所述口腔可接受的剂型是牙膏。

5.根据权利要求1所述的产品，其中所述aCPT是从下组植物中的一种植物制备而成的提取物：金樱子（EFRL），积雪草（ECA），插田泡(高丽悬钩子)的青果实(EUFRC)，蓝布正（GJ）和帝王悬钩子（ERI）。

6.根据权利要求5所述的产品，其中所述口腔可接受的剂型选自下组：霜剂、软膏、凝胶剂、泡沫剂、粉剂、液体饮料、喷雾剂、糖果、锭剂、牙膏和口香糖。

7.根据权利要求5的方法，其中口腔可接受的剂型选自下组：漱口水，漱口剂，口腔护理胶条和牙线。

8.根据权利要求7所述的产品，其中所述口腔可接受的剂型是牙膏。

9.一种口腔保健方法，该方法包括服用从下组植物中的一种植物制备而成的提取物：金樱子（EFRL），积雪草（ECA），插田泡（高丽悬钩子）的青果实(EUFRC)，蓝布正（GJ）和帝王悬钩子（ERI）。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述保健产品的剂型为牙膏。

11.根据权利要求5所述的产品，所述aCPT从蓝布正（GJ）提取制成。

12.根据权利要求5所述的产品，所述aCPT从金樱子（EFRL）提取制成。

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