CN103689215A - 一种高活性坚果抗氧化肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高活性坚果抗氧化肽及其制备方法，属于食品制备领域。该方法是以坚果分离蛋白为原料，采用分步酶催化的方法，首先将蛋白溶液预热，冷却后调节pH值及温度，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4L水解，水解后灭酶，冷却处理，然后加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，离心取上清，浓缩，冷冻干燥，即得抗氧化肽。本发明操作方便，反应效率高，所得产物具有较高的抗氧化活性和较好稳定性，可以将其应用于食品添加剂、保健品、药物载体等领域，产品具有工业化的应用前景。

Description

一种高活性坚果抗氧化肽及其制备方法
技术领域
本发明属于食品制备领域，具体涉及一种高活性坚果抗氧化肽的制备方法。
背景技术
天然抗氧化肽具有极强的抗癌、抗诱导及抗衰老等生物活性，其抗氧化活性往往强于蛋白质和氨基酸，此外，与人工合成的食品抗氧化剂相比更加安全可靠，生物体内的天然抗氧化肽主要为肌肽和谷胱甘肽，但含量很低，运用酶法、发酵法等手段从天然动植物蛋白质中可得到抗氧化肽，它们具有较强抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功能。外源抗氧化肽有望开发为新型功能性食品。
目前，食物蛋白改性的研究重点就是利用酶法改性，从分子水平上来讲，酶法改性的原理就是对蛋白质分子的主链进行打断处理或者修饰蛋白质分子的侧链，从而能够引发蛋白质空间结构和理化性质的改变。坚果蛋白本身就具有一定的抗氧化作用，而大量研究表明经过水解以后的坚果蛋白肽抗氧化效果得到了一些提升，如何能够进一步提高坚果蛋白肽的抗氧化活性，成为人们的重点研究方向。
发明内容
本发明提供一种高活性坚果抗氧化肽及其制备方法，以解决目前单纯水解坚果蛋白时存在的氧化肽活性不高的问题。 
本发明采取的技术方案包括下列步骤：
(1)配浓度为2～10%的坚果分离蛋白溶液，在温度90℃下处理7～20min，冷却至室温；
(2)调节上述坚果分离蛋白溶液pH值7.0～10，水浴温度40～60℃，按1000～9000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解1～6h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：1～5，淀粉蔗糖酶加入量100U-300U/g，35℃处理1～10h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
本发明步骤（1）中加入的坚果分离蛋白为核桃分离蛋白、松子分离蛋白和榛子分离蛋白。
本发明步骤(1)中，坚果分离蛋白浓度4.6%，90℃处理15min。
本发明步骤(2)中，所述坚果分离蛋白溶液pH值7.6，温度50℃，加酶量4510U/g，酶解时间4h。
本发明(3)步骤中，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，反应时间为8h。
本发明的优点是：各参数是经过单因素结合响应面分析优化而来，本发明以坚果分离蛋白为原料，采用两步酶催化法生产高活性抗氧化肽，即在用酶法得到坚果肽的基础上再添加另一种酶进行酶法改性，所采用的淀粉蔗糖酶在催化反应时仅仅利用了蔗糖裂解时所释放的能量而不需要添加ADP或UDP，并且得到更高活性的抗氧化产品。
本发明中反应温度为35℃，pH7.0，此条件是淀粉蔗糖酶的最适反应条件，反应条件温和，而传统美拉德反应处理温度需达到90℃以上，且中间产物复杂，副产物也较多，不利于后续分离，本发明可以保护抗氧化肽活性，极大降低能耗和生产成本。本发明工艺简单，所得产物抗氧化活性高，稳定性好，可以将其应用于食品添加剂、保健品、药物载体等领域。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。
实施例中材料来源：
采用的坚果分离蛋白为核桃分离蛋白、松子分离蛋白或榛子分离蛋白。
Alcalase 2.4L：诺维信水解蛋白酶2.4L购自北京高瑞森科技有限公司；测定酶活36229.37U/ml；
淀粉蔗糖酶：将Neisseria polysaccharea(ATCC43768购自美国典型微生物保藏中心) 中淀粉蔗糖酶基因在E.coli BL21中异源表达，利用定点突变技术对重组菌空间进行改造，成功构建突变株F191M，测定比酶活202 U/mg。（详见《多糖奈瑟球菌(Neisseria polysacchare)淀粉蔗糖酶突变株F191M的构建及酶学性质表征》作者张磊，刘春雷，闵伟红，孙琳琳，方丽）
实施例1
(1)配浓度为2%的坚果分离蛋白溶液，在温度90℃下处理7min，冷却至室温；
(2)调节上述坚果分离蛋白溶液pH值7.0，水浴温度40℃，按1000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解1h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：1，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，35℃处理1h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
实施例2
(1)配浓度为6%的坚果分离蛋白溶液，在温度90℃下处理13min，冷却至室温；
(2)调节上述坚果分离蛋白溶液pH值8.5，水浴温度50℃，按5000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解3.5h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：3，淀粉蔗糖酶加入量200U/g，35℃处理5.5h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
实施例3
(1)配浓度为10%的坚果分离蛋白溶液，在温度90℃下处理20min，冷却至室温；
(2)调节上述坚果分离蛋白溶液pH值10，水浴温度60℃，按9000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解6h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：5，淀粉蔗糖酶加入量300U/g，35℃处理10h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
实施例4
(1)配浓度为4.6%的核桃分离蛋白溶液，在温度90℃下处理15min，冷却至室温；
(2)调节上述核桃分离蛋白溶液pH值7.6，水浴温度50℃，按4510U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解4h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0，水解度达到17.56%；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，35℃处理8h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
实验例1：对本发明制得的产物进行抗氧化指标的测定
抗氧化活性能力以还原能力、自由基清除能力来评价。取1mL样品(空白用1mL蒸馏水代替，其他试剂依次同下)中，加入2. 5mL 1%的铁***溶液和2. 5mL pH 6. 6的磷酸盐缓冲液( 0. 2 mo l/L)，混匀后在50℃保温20min，然后加入2. 5mL 10% 的三氯乙酸，混和后以3 000 r/m in 离心10min，取上清液2. 5mL，加入2. 5mL蒸馏水和0.5mL 0. 1%的FeCl3，混匀后在700 nm 波长下比色，记录吸光度A 值。吸光度A 值与样品的还原能力有关， A值越大则样品的还原能力越强。
按上述实施例4，比较单一酶解制备出的抗氧化肽与添加淀粉蔗糖酶处理之后所得到的目标物的还原能力，做三次平行试验，结果见表1，还原能力提高了40%。
表1. 两种肽抗氧化能力的比较
Figure 174618DEST_PATH_IMAGE001

Claims (10)

1.一种高活性坚果抗氧化肽，其特征在于是由下列方法制得的：
(1)配浓度为2～10%的坚果分离蛋白溶液，在温度90℃下处理7～20min，冷却至室温；
(2)调节上述坚果分离蛋白溶液pH值7.0～10，水浴温度40～60℃，按1000～9000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解1～6h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：1～5，淀粉蔗糖酶加入量100U-300U/g，35℃处理1～10h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
2.根据权利要求1所述的一种高活性坚果抗氧化肽，其特征在于：步骤（1）中加入的坚果分离蛋白为核桃分离蛋白、松子分离蛋白和榛子分离蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种高活性坚果抗氧化肽，其特征在于：步骤(1)中，坚果分离蛋白浓度4.6%，90℃处理15min。
4.根据权利要求1所述的一种高活性坚果抗氧化肽，其特征在于：步骤(2)中，所述坚果分离蛋白溶液pH值7.6，温度50℃，加酶量4510U/g，酶解时间4h。
5.根据权利要求1所述的一种高活性坚果抗氧化肽，其特征在于： 步骤(3)中，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，反应时间为8h。
6.   如权利要求1所述的一种高活性坚果抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)配浓度为2～10%的坚果分离蛋白溶液，在温度90℃下处理7～20min，冷却至室温；
(2)调节上述坚果分离蛋白溶液pH值7.0～10，水浴温度40～60℃，按1000～9000U/g比例加入Alcalase 2.4L，酶解1～6h，结束后迅速升温至90℃并保持15min 进行灭酶处理，冷却至室温，调节水解液pH至 7.0；
(3)加入淀粉蔗糖酶和蔗糖，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：1～5，淀粉蔗糖酶加入量100U-300U/g，35℃处理1～10h；
(4)冷却至室温，5000 r/min 离心10 min，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得产物。
7.根据权利要求6所述的一种高活性坚果抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤（1）中加入的坚果分离蛋白为核桃分离蛋白、松子分离蛋白和榛子分离蛋白。
8.根据权利要求6所述的一种高活性坚果抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，坚果分离蛋白浓度4.6%，90℃处理15min。
9.根据权利要求6所述的一种高活性坚果抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述坚果分离蛋白溶液pH值7.6，温度50℃，加酶量4510U/g，酶解时间4h。
10.根据权利要求6所述的一种高活性坚果抗氧化肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，分离蛋白与蔗糖的质量比为1：3，淀粉蔗糖酶加入量100U/g，反应时间为8h。
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