CN103667513A - 一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法 - Google Patents

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CN103667513A CN201310746446.4A CN201310746446A CN103667513A CN 103667513 A CN103667513 A CN 103667513A CN 201310746446 A CN201310746446 A CN 201310746446A CN 103667513 A CN103667513 A CN 103667513A
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Abstract

本发明提供了一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒以及方法。本发明提供的端粒酶结合引物（TS）和反向引物设计简单，TS只需包括DNA酶的序列以及切刻酶的酶切位点，不需要任何的修饰；反向引物只需包括与端粒酶延伸的多G序列互补的序列，这使得引物易于设计，可行性强。本发明的检测端粒酶活性的方法，反向引物只结合结果端粒酶延伸的TS引物，减少了非特异性扩增，而且在化学发光反应中，只有扩增出来的端粒酶多G序列和DNA酶可与hemin结合形成四聚体，产生化学发光信号，因此，本发明提供的检测端粒酶活性的方法特异性和灵敏度较高。此外，本发明提供的检测端粒酶活性的试剂盒成本低、操作简单、省时。

Description

一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种检测端粒酶活性的探针、试剂盒及方法。
背景技术
高灵敏地检测端粒酶活性对于癌症等相关疾病的早期诊断和药物筛选有重要的意义。传统检测端粒酶活性的技术主要是建立在聚合酶链反应（PCR）基础上的对端粒酶重复片段（TTAGGG）进行扩增（TRAP）来检测端粒酶活性，但是这些方法耗时、操作繁琐，且特异性不好。为了克服基于聚合酶链反应（PCR）的方法的缺点，近年来也发展出了一些不需要聚合酶链反应（PCR）的检测方法，如光纤敏感器，表面等离子共振技术，荧光，电化学等，但这些方法存在检测灵敏度低、操作繁琐、耗时或需将端粒酶结合引物固定在特别的支持物上的缺点。
因此，有必要提供一种简单易行、且能快速、高灵敏地检测端粒酶活性的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种检测端粒酶活性的探针。本发明第二方面提供了一种检测端粒酶活性的试剂盒。本发明第三方面提供了一种检测端粒酶活性的方法。本发明提供的检测端粒酶活性的探针不需要任何的标记和修饰，本发明提供的检测端粒酶活性的试剂盒采用的试剂成本低，本发明提供的检测端粒酶活性的方法具有很高的灵敏度和特异性，本发明提供的基于化学发光反应的端粒酶活性的检测探针、检测试剂盒和检测方法在疾病早期诊断和药物筛选方面具有广阔的应用价值。
第一方面，本发明提供了一种检测端粒酶活性的探针，所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为6～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补。
优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
具体地，所述SEQ ID NO:1为PW17序列，即GGGTAGGGCGGGTTGGG；
所述SEQ ID NO:2为T30695序列，即GGGTGGGTGGGTGGGT；
所述SEQ ID NO:3为PS2.M序列，即GTGGGTAGGGCGGGTTGG；
所述SEQ ID NO:4为PS5.M序列，即GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG；
所述SEQ ID NO:5为AGRO100序列，
即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
可形成分子内平行型G-四联体，该G-四联体可与氯高铁血红素（hemin）结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，具有过氧化物酶的催化作用，其在3-氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺）和过氧化氢存在条件下，可催化鲁米诺发生氧化反应并产生化学发光信号；此外，除鲁米诺外，还可催化其他氧化还原发光底物发生氧化还原反应并产生化学发光信号，如3-氨基邻苯二甲酰肼（鲁米诺）、N,N二甲基二吖啶硝酸盐（光泽精）、2,4,5-三苯基咪唑（洛粉碱）、3，4，5-三羟基苯甲酸（没食子酸）或双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐（过氧草酸盐）。
此外，端粒酶在端粒酶结合引物的3′端不断添加多G重复序列（TTAGGG），该多G重复序列也能形成分子内平行型G-四联体，该G-四联体可与氯高铁血红素（hemin）结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，也具有过氧化物酶的催化作用，能进一步放大化学发光信号。
优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI或Nt.BstNBI切刻酶。
优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。具体地，所述SEQ IDNO:6为AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。
在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
具体地，所述SEQ ID NO:7为AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
其中，下划线表示的部分为C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点。
本发明提供的端粒酶结合引物（TS）含有三个切刻内切酶的酶切位点。在有端粒酶存在时，端粒酶可在端粒酶结合引物（TS）的3′端不断添加多G重复序列（TTAGGG），反向引物（RS）能与多G重复序列（TTAGGG）结合，并进行复制延伸，从而形成双链，此时内切酶酶切位点产生，在切刻内切酶的不断酶切的作用下和聚合酶的链置换复制作用下，该双链DNA会产生引物、DNA酶和端粒酶多G重复序列片段；而产生的引物又可与多余的端粒酶结合引物（TS）相结合，从而诱发整个反应的指数扩增，不断产生更多的引物、DNA酶和端粒酶多G重复序列。产物DNA酶和端粒酶多G重复序列能与氯高铁血红素(hemin)结合形成四聚体，在过氧化物酶检测试剂存在时，该复合物能够催化底物进行氧化还原反应，产生化学发光信号。
本发明提供检测端粒酶活性的探针不需要任何的修饰、价格低廉、且设计简单。
优选地，所述端粒酶结合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
第二方面，本发明提供了检测端粒酶活性的试剂盒，包括：
端粒酶检测试剂，及
DNA酶检测试剂，
其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为6～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补。
优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
具体地，所述SEQ ID NO:1为PW17序列，即GGGTAGGGCGGGTTGGG；
所述SEQ ID NO:2为T30695序列，即GGGTGGGTGGGTGGGT；
所述SEQ ID NO:3为PS2.M序列，即GTGGGTAGGGCGGGTTGG；
所述SEQ ID NO:4为PS5.M序列，即GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG；
所述SEQ ID NO:5为AGRO100序列，
即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI或Nt.BstNBI切刻酶。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent（exo–）DNA聚合酶。
优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
具体地，所述SEQ ID NO:6为AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。
在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
具体地，所述SEQ ID NO:7为AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
其中，下划线表示的部分为C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点。
优选地，所述端粒酶结合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地，所述端粒酶检测缓冲液包括30毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH8.3）、3毫摩尔每升的氯化镁、70毫摩尔每升的氯化钾、1毫摩尔每升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐温20、200毫摩尔每升的dNTPs（四种脱氧核糖核苷酸的混合物）。
在此优选情况下，所述端粒酶检测试剂中端粒酶结合引物的浓度为100纳摩尔每升，反向引物的浓度为50纳摩尔每升，DNA聚合酶的浓度为1个单位每20微升，切刻内切酶的浓度为5个单位每20微升，采用所述端粒酶检测试剂进行反应的方式优选为：取体积比为1～2:19的待测端粒酶样品和端粒酶检测试剂混合，先在30～40℃下孵育8～15分钟，然后在50～60℃下孵育15～30分钟。
进一步优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶。
进一步优选地，所述切刻内切酶为Nt.BspQI切刻酶。
进一步优选地，所述端粒酶检测试剂进行反应的方式中，所述反应条件为：先在37℃下孵育10分钟，然后在55℃下孵育20分钟。
优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸或过氧草酸盐。
进一步优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂还包括：105微升含有0.5毫摩尔每升的鲁米诺、15微升的去离子水、75微升2×HEPES缓冲液（40毫摩尔每升的HEPES、600毫摩尔氯化钠、PH8.0）。
在此优选条件下，所述DNA酶检测试剂中的氯高铁血红素（hemin）优选为75纳摩尔每升，采用所述DNA酶检测试剂进行检测的方式优选为：将15微升的扩增产物（与扩增反应同时进行的有切刻内切酶酶切反应）加入到105微升的所述DNA酶检测试剂中得到混合物，将混合物放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒，得到化学发光信号。
本发明第三方面提供了一种检测端粒酶活性的方法，包括如下步骤：
1）提供端粒酶检测试剂，及
DNA酶检测试剂，
其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为6～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补；及
2）取待测端粒酶样品，加入所述端粒酶检测试剂进行两步恒温扩增反应，得到含所述DNA酶的产物；及
3）取所得含DNA酶的产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号。
优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
具体地，所述SEQ ID NO:1为PW17序列，即GGGTAGGGCGGGTTGGG；
所述SEQ ID NO:2为T30695序列，即GGGTGGGTGGGTGGGT；
所述SEQ ID NO:3为PS2.M序列，即GTGGGTAGGGCGGGTTGG；
所述SEQ ID NO:4为PS5.M序列，即GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG；
所述SEQ ID NO:5为AGRO100序列，
即GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。
优选地，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI或Nt.BstNBI切刻酶。
优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Vent（exo–）DNA聚合酶。
优选地，所述C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
具体地，所述SEQ ID NO:6为AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT。
优选地，在所述C的核苷酸序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点后得到所述A的核苷酸序列。
在此优选条件下，所述A的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
具体地，所述SEQ ID NO:7为AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCCGAG CAG AGT T。
其中，下划线表示的部分为C的序列中加入的Nt.BspQI切刻酶的识别位点。
优选地，所述端粒酶结合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
优选地，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地，所述步骤（2）中，所述两步恒温扩增反应的条件为：先在30～40℃下孵育8～15分钟，然后在50～60℃下孵育15～30分钟。
优选地，所述端粒酶检测缓冲液包括30毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH8.3）、3毫摩尔每升的氯化镁、70毫摩尔每升的氯化钾、1毫摩尔每升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐温20、200毫摩尔每升的dNTPs（四种脱氧核糖核苷酸的混合物）。
在此优选情况下，所述端粒酶检测试剂中端粒酶结合引物的浓度为100纳摩尔每升，反向引物的浓度为50纳摩尔每升，DNA聚合酶的浓度为1个单位每20微升，切刻内切酶的浓度为5个单位每20微升，采用所述端粒酶检测试剂进行反应的方式优选为：取体积比为1～2:19的待测端粒酶样品和所端粒酶检测试剂混合，先在30～40℃下孵育8～15分钟，然后在50～60℃下孵育15～30分钟。
进一步优选地，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶。
进一步优选地，所述切刻内切酶为Nt.BspQI切刻酶。
进一步优选地，所述采用所述端粒酶检测试剂进行反应的方式中，所述反应条件为：先在37℃下孵育10分钟，然后在55℃下孵育20分钟。
优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括氧化还原底物，所述氧化还原底物为鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸或过氧草酸盐；其中，氧化还原底物的浓度为0.5毫摩尔每升。
进一步优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂还包括：15微升的去离子水、75微升2×HEPES缓冲液（40毫摩尔每升的HEPES、600毫摩尔氯化钠、pH8.0）。
在此优选条件下，所述DNA酶检测试剂中的氯高铁血红素（hemin）优选为75纳摩尔每升，采用所述DNA酶检测试剂进行检测的方式优选为：将15微升的扩增产物（与扩增反应同时进行的有切刻内切酶酶切反应）加入到105微升的所述DNA酶检测试剂中得到混合物，将混合物放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒，得到化学发光信号。
本发明提供的检测端粒酶活性的方法主要分为三步：（1）端粒酶的延伸；（2）端粒酶介导的两步恒温扩增；（3）化学发光检测。首先构建了一个含有切刻内切酶位点的端粒酶结合引物（TS），有端粒酶存在时，端粒酶会在TS的3′端不断添加多G序列（TTAGGG）。因此反向引物（RP）就会与添加的多G序列（TTAGGG）进行结合，并开始复制，形成双链后，新的扩增模板和内切酶酶切位点形成，剪切，聚合酶以新的扩增模板进行链置换复制，从而产生端粒酶延伸产物-多G序列（TTAGGG），DNA酶以及引发指数扩增的引物（trigger）。而产生的引物可引发指数扩增反应，从而产生更多的端粒酶多G序列、DNA酶和引物，如此循环往复，就会产生大量的端粒酶多G序列和DNA酶。端粒酶多G序列和DNA酶能与氯高铁血红素(hemin)结合形成血红素多G四联体结构，在鲁米诺等氧化还原底物和过氧化氢存在条件下，发生化学发光，从而检测光信号。
本发明提供的检测端粒酶活性的方法不需要标记、低成本、快速、简单、灵敏，并且特异性好。
优选地，本发明提供的检测端粒酶活性的方法的能在30分钟内完成端粒酶活性的检测。
本发明提供检测端粒酶活性的探针、检测端粒酶活性的试剂盒及检测端粒酶活性的方法具有如下有益效果：
1.端粒酶结合引物（TS）设计简单。本发明提供的端粒酶结合引物只需包括DNA酶的序列以及切刻酶的酶切位点，不需要任何的修饰；反向引物只需包括与端粒酶延伸的多G序列互补的序列，这使得引物易于设计，可行性强。
2.特异性高。本发明的技术方案中的两步恒温扩增过程中，采用本说明提供的错配的反向引物（如SEQ ID NO:9所示）与端粒酶延伸的TS引物结合，减少了非特异性扩增，而且在化学发光反应中，只有扩增出来的端粒酶多G序列和DNA酶可与hemin结合形成四聚体，产生化学发光信号，因此，本发明提供的检测端粒酶活性的方法的特异性较高。
3.灵敏度高。本发明的技术方案将端粒酶诱导的恒温指数扩增反应的高效率与化学发光信号显著增强的两种优势串联起来，极大地提高了检测灵敏度。
4.成本低。化学发光具有灵敏度高和线性范围广的特点，而且价格低廉，在生物医学研究和疾病诊断方面具有广阔的应用价值。
5.操作简单、省时：由于本发明的技术方案中的扩增反应是恒温扩增，因而不涉及控温；而且该反应是在一管中进行反应后直接测化学发光信号的，因而不涉及分离、洗涤步骤。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的端粒酶结合引物结构示意图；
图2为本发明实施例2提供的检测端粒酶活性的方法流程图；
图3～图5为本发明实施例2提供的TCP8样品的检测结果；
图6～图9为本发明实施例2提供的细胞提取物样品的检测结果；
图10为本发明对比实施例提供的样品的化学发光信号检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold SpringHarbor）。所用引物及DNA序列均由宝生物工程大连有限公司合成。
实施例1
图1为本发明实施例提供的端粒酶结合引物的结构示意图，该端粒酶结合引物依次包括A、B、C。其中，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点（如图中X’所示），所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点（如图中X所示）；所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
结合图1，本实施例提供了一种检测端粒酶活性的引物，包括如下步骤：
（1）体外合成端粒酶结合引物（TS），核苷酸序列（5’端到3’）如SEQ ID NO:8所示；
（2）根据TS的序列以及多G序列（TTAGGG）设计反向引物（RP），所述RP的核苷酸序列（5’端到3’）如SEQ ID NO:9所示；
（3）根据TS的序列以及多G序列（TTAGGG）设计端粒酶产物(TPC8)，所述TPC8的核苷酸序列（5’端到3’）如SEQ ID NO:10所示；
具体地，所述TS、RP和TPC8的核苷酸序列如下表1所示:
表1.TS、RP和TPC8的核苷酸序列
Figure BDA0000450206720000111
如表1所示的TS、RP和TPC8中，在TS中，包括：
A段：AAA CCT ACA ATC CGT GGA AGA GCC GAG CAG AGT T
B段：GC TCT TCC GGG TAG GGC GGG TTG GGG CTC TTC C
C段：AA ACC TAC AAT CCG TCG AGC AGA GTT；
在表1中，带有下划线的碱基为切刻内切酶（Nt.BspQI）的识别位点（由于切刻内切酶是双链识别，而只切其中一条链，所以由于切的链不同，导致表1中第一个酶切位点跟后面两个酶切位点不同，第一个酶切位点为Nt.BspQI切刻酶的识别位点，其切割该识别为点的互补链）；波浪线标识的序列为产生经切刻酶酶切后能产生引物的模版序列；双下划线标识的为切下来的DNA酶的序列（该DNA酶序列两端能被Nt.BspQI切刻酶识别并酶切）；斜体的3'端序列为端粒酶的结合序列；
反向引物（RP）：是在端粒酶对端粒酶结合引物（TS）进行延伸后，RP可以与端粒酶延伸的多G序列结合，从而在聚合酶的作用下，复制延伸，由于端粒酶对端粒酶结合引物（TS）进行延伸的序列为多G序列（TTAGGG），故RP的序列为多G序列的互补序列，反向引物的序列中的CCC TTA而非CCCTAA，是因为前者的特异性扩增效果更好；
TPC8是本发明用来作为阳性对照的人工合成序列，TPC8的序列为TS序列的3’端加上多G序列（TTAGGG），TPC8序列中的斜体加粗的部分即是添加的8个多G序列，斜体加粗以外的序列与TS一致。
实施例2
本实施例提供了一种检测端粒酶活性的方法流程图，如图2所示。由图2可知，本检测方法大致可以分为三个步骤，第一步：带有切刻内切酶位点的端粒酶结合引物（TS），在端粒酶存在条件下，端粒酶会在TS的3′端不断添加多G序列（TTAGGG）。第二步：反向引物与端粒酶的延伸产物-多G序列（TTAGGG）互补配对，在聚合酶作用下复制延伸，形成双链后，新的扩增模板和切刻内切酶酶切位点形成；新的扩增模板经切刻内切酶剪切，然后聚合酶以新形成的扩增模板为模板进行链置换（SDA）复制，从而产生端粒酶产物-多G序列（TTAGGG），DNA酶以及引发下面指数扩增的引物（trigger）。而产生的引物（trigger）可与多余的端粒酶结合引物（TS）结合引发指数扩增反应，从而产生更多的端粒酶多G序列、DNA酶和引物（trigger），如此循环往复，端粒酶多G序列和DNA酶的量就呈指数增长。第三步：在碱性条件下，端粒酶多G序列和DNA酶能与氯高铁血红素（hemin）结合形成血红素-G四聚体，在过氧化物酶检测试剂（比如：鲁米诺、光泽精、洛粉、没食子酸或过氧草酸盐）存在条件下，发生氧化反应产生化学发光信号。
结合图2，本实施例提供了一种检测端粒酶活性的方法，包括如下步骤：
（1）样品制备
细胞提取物准备：培养人子***细胞（HeLa）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和人肺纤维细胞（MRC-5）。人子***细胞（HeLa）和人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）培养基为含有10%胎牛血清（FBS）的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），而人肺纤维细胞（MRC-5）的培养基为含有15%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺、50单位/毫升青霉素和50毫克/毫升链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM），三者都放在含有5%二氧化碳，37度的培养箱中进行培养。待细胞长到对数生长期时，用胰酶将其消化下来，并用pH值7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两遍，然后4度，8000转每分钟离心5分钟。将约1×106个细胞悬浮在200微升的裂解缓冲液中，于4度冰上裂解30分钟，然后4度，12000转每分钟离心20分钟。最后，将上清液转移至干净的离心管中，放在-80度保存备用；
取备用细胞提取物稀释不同倍数的细胞提取物，各1微升；或
合成的含有8个多G序列的端粒酶结合引物（TPC8），稀释不同倍数，各2微升；
（2）试剂准备
19微升的混合物：100纳摩尔每升的端粒酶结合引物(TS)、50纳摩尔每升的反向引物、30毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH8.3）、3毫摩尔每升的氯化镁、70毫摩尔每升的氯化钾、1毫摩尔每升的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.05%的吐温20、200毫摩尔每升的dNTPs（四种脱氧核糖核苷酸的混合物）、1个单位的聚合酶Bst2.0（热启动）和5个单位的切刻酶Nt.BspQI；
化学发光检测试剂：25毫摩尔每升的鲁米诺溶液（使用0.1摩尔每升的氢氧化钠溶解）、25微摩尔每升的hemin溶液（使用二甲基亚砜溶解），分装成小份储存在-20度冰箱；40毫摩尔每升的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）溶液，PH9.0；
（3）两步恒温扩增反应
将步骤（1）所得的稀释不同倍数的细胞提取物1微升或合成的含有8个多G序列的端粒酶结合引物（TPC8）2微升加入步骤（2）的19微升的混合物中；
然后先37度10分钟，使端粒酶以自身模板复制延伸，然后再55度孵育20分钟。
（4）化学发光反应并检测信号
将15微升的扩增产物加入到105微升含有0.25毫摩尔每升的鲁米诺、75纳摩尔每升的hemin、50微升的去离子水、30微升2×HEPES缓冲液（40毫摩尔每升的HEPES，pH8.0、300毫摩尔每升氯化钠、20毫摩尔每升氯化钾）的混合物中，室温孵育30分钟；然后放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒。
为了充分说明本发明的有益效果，本实施例步骤（1）提供的人工合成的添加了8个多G序列（TTAGGG）的端粒酶结合引物（TPC8）用于验证本发明的可行性，以及优化反应中的各个条件。以下为本实施例验证本发明的可行性的实验结果：
首先，本实施例提供了步骤（3）扩增反应的实时荧光检测结果，如图33所示。图3中，曲线1～7分别代表浓度为1.1x10-9，2.1x10-11，3.1x10-13，4.1x10-15，5.1x10-17，6.1x10-18，7.0（注：曲线7为阴性对照，为加入等体积的水进行检测）摩尔每升TPC8的实时荧光检测结果（以SYBR Green I为染料）。从该图3可看出，本方案的反应为指数性扩增方式，且随着TPC8浓度的降低，其达到荧光最大值一半所需的时间（POI）越长；从以上结果可看出，本发明提供的检测端粒酶活性的方法的对不同浓度的TPC8具有很好的区分度。
为了评估本发明提供的检测端粒酶活性的方法的定量分析能力，本实施例采用POI和化学发光强度作为评估参数制备与图3相对应的曲线，如图4所示，在图4中，横坐标为不同TPC8浓度取10为底的对数，纵坐标对应图3中的曲线的POI值，误差线代表三次实验的标准偏差。由图4可知，当TPC8的浓度取对数时，荧光强度在TPC8在一定范围内变化时呈现出良好的线性关系；此外，从图4可看出，以SYBR Green I为染料，采用本发明提供的检测端粒酶活性的方法时，TPC8的检测灵敏度可达10-18摩尔每升。
为了进一步评估本发明提供的检测端粒酶活性的方法的定量分析能力，本实施例还提供了步骤（4）中TPC8的化学发光反应的检测结果，如图5所示。在图5中，纵坐标为化学发光信号强度，横坐标为不同浓度的TPC8取10为底的对数，误差线代表三次实验的标准偏差；由图5可知，化学发光强度在TPC8在一定范围内变化时呈现出良好的线性关系，经过计算，采用本发明提供的检测端粒酶活性的方法时，TPC8的检测灵敏度可达到10-19摩尔每升；
经过评估，本发明提供的检测端粒酶活性的方法可行性高，对不同浓度的TPC8具有很好的区分度，具有很高的检测灵敏度。此外，从两种评估方法可以看出，相对于采用以SYBR Green I为染料的10-18摩尔每升的检测灵敏度，采用化学发光检测的灵敏度更高一些。
以下实验结果为本实施例2步骤（1）制备的细胞提取物样品的检测结果：
首先，本实施例提供了细胞提取物样品在步骤（3）扩增反应时的实时荧光检测结果，如图6所示，图6表示相对于不同数目的HeLa细胞在扩增反应时的实时荧光检测结果，在图6中，曲线1～8分别代表各样品的实时荧光检测结果（以SYBR Green I为染料）其中，曲线1为阳性对照，检测样品为TPC8（1x10-11），曲线1为～6为细胞样品，细胞数目依次为：1000个细胞、200个细胞、100个细胞、10个细胞和1个细胞，曲线7为和曲线8为阴性对照，其中，曲线7的样品采用1000个失活细胞，曲线8为等体积的水。从该图6可看出，本方案的反应为指数性扩增方式，虽然细胞样品需要一个端粒酶延伸过程，但是随着反应的进行，荧光信号还是会达到一个较高平台期，且随着HeLa细胞数目的降低，其达到荧光最大值一半所需的时间（POI）越长；从以上结果可看出，本发明提供的检测端粒酶活性的方法的对不同数目的细胞具有很好的区分度。
为了充分说明本发明提供的检测端粒酶活性的方法的定量分析能力，本实施例采用POI和化学发光强度作为评估参数制备与图6相对应的曲线，如图7所示，在图7中，横坐标为不同细胞的数目取以10为底的对数（图中的横坐标表示没有把细胞数目取对数后的值标示出来），纵坐标对应图6中的曲线的POI，误差线代表三次实验的标准偏差。由图7可知，当细胞的数目取对数时，细胞的数目在一定范围内变化时，荧光强度呈现出良好的线性关系；此外，从图7可看出，以SYBR Green I为染料，本发明提供的检测方法可实时检测到10个细胞数量的端粒酶活性。
其次，本实施例提供了步骤（3）细胞样品扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，如图8所示，其中，泳道1为含有端粒酶结合引物的裂解缓冲液；泳道2为DNA marker（20bp DNA Ladder Marker，Takara Code：D521A）；泳道3为含有反向引物的反应混合物；泳道4为样品为1000个失活细胞提取物；泳道5为阳性对照DNA酶；泳道6为样品为100个细胞提取物；即泳道1、3、4为阴性对照泳道，从图8中可看出，除了泳道6所出现的端粒酶产物（32～68nt）和DNA酶（25nt）的条带外，其它阴性对照泳道1、3、4都没有出现这两种带。说明本发明提供的检测端粒酶活性的方法的特异性较好。
为了进一步说明本发明提供的检测端粒酶活性的方法的定量分析能力，本实施例还提供了步骤（4）中细胞样品的化学发光反应的检测结果，如图9所示。在图9中，纵坐标为化学发光信号强度，横坐标为不同的细胞数目取对数（图中的横坐标表示没有把细胞数目取对数后的值标示出来），误差线代表三次实验的标准偏差；由图9可知，细胞的数目在一定范围内变化时，化学发光强度呈现出良好的线性关系，经过计算，化学发光计算本发明提供的检测端粒酶活性的方法时，细胞样品的检测限可达到1个细胞。
本发明实施例1说明采用本发明提供的检测端粒酶活性的探针、检测试剂盒以及检测方法能用于检测端粒酶的活性，且最低能检测到1个细胞数量中含有的端粒酶的活性，具有很高的灵敏度，此外，还能对待测样品的细胞数或浓度进行定量分析。
对比实施例
为了充分说明本发明的有益效果，本发明提供了实施例2的对比实施例，即将实施例2中的HeLa细胞换为另外一组癌细胞-人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和一组正常细胞-人肺纤维细胞（MRC-5）作为实验样品，其他步骤不变，此外，本对比实施例还提供了空白对照，该空白对照与实施例2相比，只含有细胞裂解缓冲液，不含细胞，其他步骤不变；检测结果如图10所示。在图10中，A为HeLa细胞；B为MDA-MB-231细胞；C为MRC-5细胞；D为裂解缓冲液；误差线代表三次实验的标准偏差。由图10可以看出，人子***细胞（HeLa）和人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）都有很高的化学发光信号，而人肺纤维细胞（MRC-5）的信号却跟阴性对照-裂解缓冲液的一样，只有很微弱的信号，实验结果表明该方法可以很好的区分肿瘤细胞和正常细胞，并能很灵敏地检测出肿瘤细胞的端粒酶活性。说明本发明提供的检测端粒酶活性的探针、检测试剂盒以及检测方法特异性非常好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000450206810000011
Figure IDA0000450206810000021
Figure IDA0000450206810000031

Claims (11)

1.一种检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处为切刻内切酶的识别位点；
所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为5～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补。
2.如权利要求1所述的检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI或Nt.BstNBI切刻酶。
4.如权利要求1所述的检测端粒酶活性的探针，其特征在于，所述A或C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.一种检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，包括：
端粒酶检测试剂，及
DNA酶检测试剂，
其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为6～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补。
6.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于,所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示的核苷酸序列。
7.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst2.0热启动DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、或Ventexo–DNA聚合酶；所述DNA酶序列两端的切刻内切酶为Nt.BspQI、Nb.BsmI、Nt.AlwI或Nt.BstNBI切刻内切酶。
8.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述A或C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.如权利要求5所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括3-氨基邻苯二甲酰肼、N,N二甲基二吖啶硝酸盐、2,4,5-三苯基咪唑、3，4，5-三羟基苯甲酸或双(2,4,6-三氯苯基)草酸盐（过氧草酸盐）。
10.一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提供端粒酶检测试剂，及
DNA酶检测试剂，
其中，所述端粒酶检测试剂包括端粒酶结合引物、反向引物、DNA聚合酶、切刻内切酶及端粒酶检测缓冲液，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
所述检测探针包括端粒酶结合引物和反向引物，所述端粒酶结合引物依次包括A、B以及C，所述A、B、C均为核苷酸序列，所述A的核苷酸序列为在C的核苷酸序列中加入切刻内切酶的识别位点，所述B具有DNA酶序列，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列，所述DNA酶序列的两端具有切刻内切酶的识别位点，
所述核苷酸序列C具有被端粒酶识别的序列；
所述核苷酸序列A中，距离A的5’端的15～24个碱基处具有切刻内切酶的识别位点；
所述反向引物具有与（TTAGGG）n互补的序列，其中，n为6～10的自然数，所述反向引物与所述端粒酶结合引物不互补；及
2）取待测端粒酶样品，加入所述端粒酶检测试剂进行两步恒温扩增反应，得到含所述DNA酶的产物；及
3）取所得含DNA酶的产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号。
11.如权利要求10所述的检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述两步恒温扩增反应的条件为：先在30～40℃下孵育8～15分钟，然后在50～60℃下孵育15～30分钟。
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